CN114594179A - 一种土壤中多种抗生素的同时快速提取和检测方法 - Google Patents

一种土壤中多种抗生素的同时快速提取和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种土壤中多种抗生素的同时快速提取和检测方法，本发明样品前处理方法通过提取和浓缩工艺优化，实现5大类58种抗生素的同时提取和净化，相比于固相萃取方法，显著提高了样品的前处理效率。本发明检测方法高效液相色谱‑串联质谱采用甲醇‑水条件流动相体系，相较于现有技术可实现同分异构体磺胺对甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪的色谱分离。整体上，本发明方法实现了土壤中5大类58种抗生素同时快速提取和检测，且本发明方法检测限低，准确度和精密度高。

Description

一种土壤中多种抗生素的同时快速提取和检测方法
技术领域
本发明属于环境污染物检测领域，具体涉及一种土壤中多种抗生素的同时快速提取和检测方法。
背景技术
抗生素在全世界范围内广泛用于人和兽用疾病治疗，并在畜禽养殖生产中用于饲料添加。畜禽养殖中的抗生素用量占全部抗生素用量的70％。抗生素在用于畜禽后，其中30-90％通过粪便和尿液排出体外，其中大部分以抗生素原体形式存在。抗生素通过畜禽粪便和基于畜禽粪便的有机肥的施用进入农田土壤环境，导致土壤中抗生素残留情况较为突出。土壤中抗生素残留能够通过抗性基因传导、影响土壤微生物群落结构和功能，危害土壤生态安全。此外，土壤中的抗生素可由农作物吸收和富集，间接造成人体的抗生素暴露。因此对土壤中抗生素的检测非常重要。
抗生素属于易离子化极性化合物，存在很多离子功能基团和不同的酸离解常数(pKa),因此抗生素尤其是四环素类和喹诺酮类抗生素极易通过阳离子交换、表面络合、阳离子桥接、和氢键作用等吸附在土壤颗粒上。由于强烈的吸附作用，同时部分抗生素在酸性和碱性条件下容易降解，土壤中多类抗生素的多残留检测一直是一个难点。
传统上应用最为广泛的土壤中抗生素的残留检测方法是固相萃取法，该方法是使用缓冲溶液多次提取后，提取液进行固相萃取浓缩和净化。为进一步提升部分抗生素的回收率，有研究使用加压溶剂萃取法进行土壤中抗生素的提取。虽然上述方法中土壤中抗生素残留检测能够取得较为理想的回收率和定量限结果，但是方法前处理特别复杂，耗时长，检测效率极低。此外，上述方法抗生素种类也无法满足检测需求。因此，亟需建立新型的土壤中多种类抗生素的高通量的快速提取和检测方法。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的不足，提供了一种多种抗生素的同时快速提取和检测方法。
本发明采用的技术方案为：
本发明公开了一种土壤样品多种抗生素检测的样品前处理方法，包括如下步骤：
(1)土壤样品去除植物根茎、石块杂物后，置于塑料离心管中；
(2)加入Na2EDTA，加入磷酸缓冲液和乙腈-甲酸溶液；乙腈-甲酸溶液中，乙腈和甲酸的体积比为95:5；
(3)涡旋震荡提取，然后离心，将上清液全部转移至离心管中，再重复一次上述操作，合并上清液；
(4)向上清液中加入氯化钠，震荡后离心，使乙腈相与缓冲液相分离；
(5)吸取上清液至内含无水硫酸镁及C18的塑料离心管中，涡旋混匀，进行分散固相萃取净化，然后离心；
(6)向上清液中加入氨的甲醇溶液，混合均匀后，旋转蒸发至近干，加入含1％甲酸的体积比为1:1的甲醇-水溶液，复溶，过微孔滤膜，得待测提取液。
优选地，多种抗生素包括58种，分别为磺胺醋酰、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲(基)嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺胍、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺氯哒嗪、甲氧苄氨嘧啶、磺胺苯吡唑、氧氟沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、西诺沙星、吡哌酸、达氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星、奥比沙星、二氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、培氟沙星、噁喹酸、萘啶酸、氟甲喹、金霉素、去甲基金霉素、土霉素、四环素、多西环素、替米考星、交沙霉素、螺旋霉素、罗红霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺。
优选地，所述的磷酸缓冲液为pH为3的磷酸缓冲液。其制备方法为：取27.2g磷酸二氢钾溶于1L水中，加入1.35mL磷酸，混匀。
优选地，步骤(5)中上清液、无水硫酸镁、C18的比例为：1mL:150mg：25mg。
优选地，步骤(6)中，氨的甲醇溶液的添加量为：氨的甲醇溶液：上清液＝50μL：1mL。
具体地，该土壤样品多种抗生素检测的样品前处理方法，包括如下步骤：
(1)土壤样品去除植物根茎、石块杂物后，置于塑料离心管中；
(2)加入Na2EDTA，加入磷酸缓冲液和乙腈-甲酸溶液；乙腈-甲酸溶液中，乙腈和甲酸的体积比为95:5；
(3)涡旋震荡提取3min，5000r/min离心5min，将上清液全部转移至离心管中，再重复一次上述操作，合并上清液；
(4)向上清液中加入氯化钠，震荡后，4200r/min离心5min，使乙腈相与缓冲液相分离；
(5)吸取上清液至内含无水硫酸镁及C18的塑料离心管中，涡旋混匀1min，进行分散固相萃取净化，4200r/min离心5min；
(6)向上清液中加入氨的甲醇溶液，混合均匀后，在40℃水浴旋转蒸发至近干，加入含1％甲酸的体积比为1:1的甲醇-水溶液，复溶，过微孔滤膜，得待测提取液。
本发明还公开了一种土壤样品中多种抗生素的检测方法，包括如下步骤：
(1)建立抗生素标准曲线：
以甲醇为溶剂，配制抗生素混合标准溶液，空白土壤样品(不含抗生素)按照上述前处理方法处理后，得到空白基质溶液，逐级用空白基质溶液将抗生素混合标准溶液稀释成质量浓度为0.002mg/L、0.005mg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L和0.5mg/L的基质匹配标准工作溶液，选择不少于5个浓度点，供液相色谱-串联质谱仪测定，以抗生素定量用子离子的质量色谱图峰面积为纵坐标，相对应的基质匹配标准工作溶液的质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准工作曲线。
(2)将待测土壤样品按照上述的前处理方法处理后得到的待测提取液采用液相色谱-串联质谱分析
1)高效液相色谱条件为：色谱柱：C18(2.1mm(内径)×100mm,1.8μm)；柱温：40℃；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为甲醇，流速：0.3mL/min，进样量2μL，流动相梯度条件如下：
Figure BDA0003526722910000031
(2)质谱条件：离子源类型：电喷雾离子源；扫描方式：正离子和负离子同时扫描；电喷雾电压：正离子5500V，负离子-4500V；离子源温度：500℃；雾化气：0.345MPa；辅助加热气：0.345MPa；测定模式为：多反应监测；
(3)计算分离出的抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出抗生素含量。
优选地，质谱的测定模式：多反应监测，每种抗生素分别选择至少两个离子对，按照出峰顺序，分时段分别检测，每种抗生素的保留时间离子化方式、母离子、子离子及离子对参数如下：
Figure BDA0003526722910000041
Figure BDA0003526722910000051
Figure BDA0003526722910000061
本发明公开的土壤中多种抗生素的同时快速提取和检测方法与现有技术相比具有的积极效果在于：
(1)本发明方法实现了土壤中5大类58种抗生素同时快速提取和检测。
(2)本发明样品前处理方法通过提取和浓缩工艺优化，实现5大类58种抗生素的同时提取和净化，相比于固相萃取方法，显著提高了样品的前处理效率。
(3)本发明样品前处理方法，通过浓缩过程控制体系的酸碱度，以避免过程中磺胺类和大环内酯类抗生素的降解。
(4)本发明方法可以在10分钟之内实现58种抗生素的同时快速检测，且本发明方法检测限低，准确度和精密度高。
(5)本发明方法高效液相色谱采用甲醇-水条件流动相体系，相较于现有技术可实现同分异构体磺胺对甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪的色谱分离。
附图说明
图1为58种抗生素MRM色谱图；
图2为乙腈和水作为流动相时磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪的色谱分离情况。
图3为甲醇和水作为流动相时磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪的色谱分离情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1
一、建立抗生素标准曲线：
(1)58种抗生素标准品：磺胺醋酰、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲(基)嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺胍、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺氯哒嗪、甲氧苄氨嘧啶、磺胺苯吡唑、氧氟沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、西诺沙星、吡哌酸、达氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星、奥比沙星、二氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、培氟沙星、噁喹酸、萘啶酸、氟甲喹、金霉素、去甲基金霉素、土霉素、四环素、多西环素、替米考星、交沙霉素、螺旋霉素、罗红霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺。纯度均大于等于95％。
(2)58种抗生素标准储备溶液：准确称取抗生素标准品10mg(精确到0.1mg)于小烧杯中，根据溶解度用甲醇溶解后转移到10或100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，于－18℃以下避光保存。
(3)标准工作溶液：准确吸取1mL抗生素标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。现用现配。
(4)标准工作曲线：空白土壤样品按照二所述的前处理方法处理后，得到空白基质溶液。精确吸取一定量的混合标准溶液，逐级用空白基质溶液稀释成质量浓度为0.002mg/L、0.005mg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L和0.5mg/L的基质匹配标准工作溶液，根据仪器性能和检测需要选择不少于5个浓度点，供液相色谱-串联质谱仪测定。以抗生素定量用子离子的质量色谱图峰面积为纵坐标，相对应的基质匹配标准工作溶液质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准工作曲线。
二、样品前处理
(1)土壤样品去除植物根茎及石块等杂物后，准确称取2g置于50mL塑料离心管中。
(2)加入0.4g Na2EDTA，加入10mL磷酸缓冲液和10mL乙腈-甲酸溶液。
其中磷酸缓冲液：称取27.2g磷酸二氢钾溶于1L水中，加入1.35mL磷酸，混匀。
乙腈-甲酸溶液(95+5，体积比)：量取50mL甲酸加入950mL乙腈中，混匀。
(3)涡旋震荡提取3min，5000r/min离心5min，将上清液全部转移至50ml离心管中，再重复一次上述操作，合并上清液。
(4)向合并后的上清液中加入10g氯化钠，剧烈震荡后，4200r/min离心5min，使乙腈相与缓冲液相分离。
(5)吸取上清液8mL至内含1200mg无水硫酸镁及200mg C18的15mL塑料离心管中，涡旋混匀1min。进行分散固相萃取净化。4200r/min离心5min。
(6)准确吸取5mL上清液于100mL鸡心瓶中，加入250μL氨的甲醇溶液，混合均匀后在40℃水浴旋转蒸发至近干。加入含1％甲酸的体积比为1:1的甲醇-水溶液，复溶，过微孔滤膜，用液相色谱-串联质谱进行测定。
三、液相色谱串联质谱分析
(1)超高效液相色谱条件为：色谱柱：C18(2.1mm(内径)×100mm,1.8μm)；柱温：40℃；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为甲醇。流动相梯度条件见表1。流速：0.3mL/min；进样量2μL。
(2)质谱条件：离子源类型：电喷雾离子源；扫描方式：正离子和负离子同时扫描；电喷雾电压：正离子5500V，负离子-4500V；离子源温度：500℃；雾化气：0.345MPa；辅助加热气：0.345MPa；
测定模式：多反应监测，每种抗生素分别选择至少两个离子对，按照出峰顺序，分时段分别检测。每种抗生素的保留时间、离子化方式、离子对及去簇电压、碰撞能参数见表2。MRM色谱图见图1。
表1流动相及其梯度条件(VA+VB)
Figure BDA0003526722910000081
表2 58种抗生素的质谱条件
Figure BDA0003526722910000082
Figure BDA0003526722910000091
Figure BDA0003526722910000101
试验结果：
1、流动相条件的优化与选择
58种抗生素有多种抗生素为同分异构体，存在相同的离子对，因此检测过程中可能存在相互干扰。典型的情况为磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪，三种磺胺类抗生素为同分异构体，在使用传统流动相体系(乙腈和水)时磺胺对甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪无法实现色谱分离，因此质谱分析中无法区分两者(图2)。因此本发明采用甲醇/水体系作为流动相对抗生素的分离，结果发现磺胺对甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪能够实现色谱基线分离(图3)。实现了58种农药的同时快速定量检测。
2、不同提取液对回收率结果的影响
本发明考察了8种类型缓冲液对提取效率的影响，结果见表3。不同提取液对回收率具有显著影响。5％甲酸的加入可以提高四环素类和喹诺酮类抗生素在乙腈和缓冲液之间的分配，从而提高最终的提取效果。对于不同的缓冲液，磷酸缓冲液(pH3)较McIlvaine缓冲液(pH 3,4,7)对于绝大部分抗生素的提取效果好。因此选择磷酸缓冲液：乙腈(含5％甲酸)＝1:1作为提取液。
提取液A为磷酸缓冲液(pH3)：乙腈(1/1,v/v)；
提取液B为McIlvaine缓冲液(pH3)：乙腈(1/1,v/v)；
提取液C为McIlvaine缓冲液(pH4)：乙腈(1/1,v/v)；
提取液D为McIlvaine缓冲液(pH7)：乙腈(1/1,v/v)；
提取液E为磷酸缓冲液(pH3)：乙腈含5％甲酸(1/1,v/v)；
提取液F为McIlvaine缓冲液(pH3)：乙腈含5％甲酸(1/1,v/v)；
提取液G为McIlvaine缓冲液(pH4)：乙腈含5％甲酸(1/1,v/v)，
提取液H为McIlvaine缓冲液(pH7)：乙腈含5％甲酸(1/1,v/v)。
表3不同提取液对提取效果的影响
Figure BDA0003526722910000111
Figure BDA0003526722910000121
3、浓缩过程中体系的酸碱度对回收率的影响：
磺胺类和大环内酯类抗生素在高酸度条件下浓缩过程中会发生降解，导致回收率低。为此，本发明考察了在浓缩过程中通过添加氨溶液来调整体系的酸碱度从而保证磺胺类和大环内酯类抗生素的回收率结果(表4)。分别在浓缩添加50/100/150/200/250/300微升的氨甲醇溶液(对应5mL上清液)对回收率的影响。结果发现在添加250微升氨溶液时能够较好的抑制抗生素的降解。
表4不同氨溶液添加量对浓缩过程中磺胺类和大环内脂类抗生素回收率的影响
Figure BDA0003526722910000131
Figure BDA0003526722910000141
4、添加回收率
使用五种类型的土壤进行添加回收率的考察。五种土壤分别是红土、潮土、黑土、水稻土和褐土。回收率结果见表5。由表5可知，不同类型土壤中58中抗生素的回收率和RSD都较好，能够满足土壤中抗生素的同步检测。
表5 58种抗生素在5种土壤中的回收率结果
Figure BDA0003526722910000142
Figure BDA0003526722910000151
Figure BDA0003526722910000161
5、方法的线性和定量限。58种抗生素的线性方程和相关系数以及定量限见表6。定量限定义为回收率和重现性能够满足分析要求的最低添加浓度，对于磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素定量限为2μg/kg，对于四环素类和氯霉素类抗生素定量限为5μg/kg。
本发明定量限以实际添加回收获得，而非采用现有技术中使用的信噪比计算得来，方法定量灵敏度更真实。
表6 58种抗生素的线性和相关系数
Figure BDA0003526722910000162
Figure BDA0003526722910000171
Figure BDA0003526722910000181
应用例
为进一步验证本方法在检测土壤中多种抗生素的效果。在天津某区养殖厂周边采集了15个长期施用粪肥的农田土壤。经本方法检测，土壤样品中共检出8种抗生素残留，分别为磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、氧氟沙星、替米考星、金霉素、土霉素、四环素、多西环素(具体浓度见表7)。其中四环素类抗生素金霉素、土霉素以及喹诺酮类抗生素氧氟沙星检出浓度较高，土霉素和喹诺酮检出率100％，最高浓度超过了1000μg/kg。其他种类抗生素残留量较低，大部分在100μg/kg以下。
表7实际土壤样品中抗生素残留量
Figure BDA0003526722910000191
ND:未检出
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，都应涵盖在本发明的权利要求书保护范围之内。

Claims (8)

1.一种土壤样品多种抗生素检测的样品前处理方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)土壤样品去除植物根茎、石块杂物后，置于塑料离心管中；
(2)加入Na2EDTA，加入磷酸缓冲液和乙腈-甲酸溶液；乙腈-甲酸溶液中，乙腈和甲酸的体积比为95:5；
(3)涡旋震荡提取，然后离心，将上清液全部转移至离心管中，再重复一次上述操作，合并上清液；
(4)向上清液中加入氯化钠，震荡后离心，使乙腈相与缓冲液相分离；
(5)吸取上清液至内含无水硫酸镁及C18的塑料离心管中，涡旋混匀，进行分散固相萃取净化，然后离心；
(6)向上清液中加入氨的甲醇溶液，混合均匀后，旋转蒸发至近干，加入含1％甲酸的体积比为1:1的甲醇-水溶液，复溶，过微孔滤膜，得待测提取液。
2.根据权利要求1所述的一种土壤样品多种抗生素检测的样品前处理方法，其特征在于：多种抗生素包括58种，分别为磺胺醋酰、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲(基)嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺胍、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺氯哒嗪、甲氧苄氨嘧啶、磺胺苯吡唑、氧氟沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、西诺沙星、吡哌酸、达氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星、奥比沙星、二氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、培氟沙星、噁喹酸、萘啶酸、氟甲喹、金霉素、去甲基金霉素、土霉素、四环素、多西环素、替米考星、交沙霉素、螺旋霉素、罗红霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺。
3.根据权利要求1所述的一种土壤样品多种抗生素检测的样品前处理方法，其特征在于：所述的磷酸缓冲液为pH为3的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种土壤样品多种抗生素检测的样品前处理方法，其特征在于：步骤(5)中上清液、无水硫酸镁、C18的比例为：1mL:150mg：25mg。
5.根据权利要求1所述的一种土壤样品多种抗生素检测的样品前处理方法，其特征在于：步骤(6)中，氨的甲醇溶液的添加量为：氨的甲醇溶液：上清液＝50μL：1mL。
6.根据权利要求1所述的一种土壤样品多种抗生素检测的样品前处理方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)土壤样品去除植物根茎、石块杂物后，置于塑料离心管中；
(2)加入Na2EDTA，加入磷酸缓冲液和乙腈-甲酸溶液；
(3)涡旋震荡提取3min，5000r/min离心5min，将上清液全部转移至离心管中，再重复一次上述操作，合并上清液；
(4)向上清液中加入氯化钠，震荡后，4200r/min离心5min，使乙腈相与缓冲液相分离；
(5)吸取上清液至内含无水硫酸镁及C18的塑料离心管中，涡旋混匀1min，进行分散固相萃取净化，4200r/min离心5min；
(6)向上清液中加入氨的甲醇溶液，混合均匀后，在40℃水浴旋转蒸发至近干，加入含1％甲酸的体积比为1:1的甲醇-水溶液，复溶，过微孔滤膜，得待测提取液。
7.一种土壤样品中多种抗生素的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)建立抗生素标准曲线：
以甲醇为溶剂，配制抗生素混合标准溶液，空白土壤样品按照权利要求1-6任一项前处理方法处理后，得到空白基质溶液，逐级用空白基质溶液将抗生素混合标准溶液稀释成质量浓度为0.002mg/L、0.005mg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L和0.5mg/L的基质匹配标准工作溶液，选择不少于5个浓度点，供液相色谱-串联质谱仪测定，以抗生素定量用子离子的质量色谱图峰面积为纵坐标，相对应的基质匹配标准工作溶液的质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准工作曲线；
(2)将待测土壤样品按照权利要求1-6任一项所述的前处理方法处理后得到的待测提取液采用液相色谱-串联质谱分析
1)高效液相色谱条件为：色谱柱：C18(2.1mm(内径)×100mm,1.8μm)；柱温：40℃；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为甲醇，流速：0.3mL/min，进样量2μL，流动相梯度条件如下：
Figure FDA0003526722900000021
Figure FDA0003526722900000031
(2)质谱条件：离子源类型：电喷雾离子源；扫描方式：正离子和负离子同时扫描；电喷雾电压：正离子5500V，负离子-4500V；离子源温度：500℃；雾化气：0.345MPa；辅助加热气：0.345MPa；测定模式为：多反应监测；
(3)计算分离出的抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出抗生素含量。
8.根据权利要求7所述的一种土壤样品中多种抗生素的检测方法，其特征在于：
所述步骤(2)质谱的测定模式为：多反应监测，每种抗生素分别选择至少两个子离子；需要检测的子离子按照出峰顺序，分时段分别检测，每种抗生素的保留时间、离子化方式、母离子、子离子及离子对参数如下：
Figure FDA0003526722900000032
Figure FDA0003526722900000041
Figure FDA0003526722900000051
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