CN112684067A - 一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，包括如下步骤：(1)配置多种抗生素的标准工作液，采用HPLC‑MS/MS方法检测各个抗生素的浓度，然后绘制标准曲线；(2)样品前处理；(3)固相萃取；(4)采用HPLC‑MS/MS方法结合标准曲线检测待测样中各抗生素的浓度。本发明所公开的方法可以同时对水产品中18种(4类)抗生素精准检测，降低了检测成本，提高了检测效率。对水产品中蛋白质和脂质等基质进行了去除，降低了基质效应，在多次实验中均具有较高的回收率，稳定性好(RSD低)，提高了检测精准度和分析结果的准确性。为水产品中抗生素残留的快速精准检测和健康风险评估奠定了理论基础和提供了技术支撑。

Description

一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法

技术领域

本发明涉及抗生素残留检测技术领域，特别涉及一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法。

背景技术

抗生素是由微生物或高等动植物所产生的次级代谢产物，也可以由人工合成，按其化学结构和性质可分为磺胺类，大环内酯类，喹诺酮类和四环素类等。抗生素作为一种抗菌剂和生长促进剂，在畜牧业和水产养殖业被广泛使用。由于抗生素的难降解性及在水产养殖业的长期使用，短时间内不能排出，极易残留在生物体内。残留的抗生素不仅会对水生动物产生毒性作用，而且也能引起抗性细菌的耐药性，由于耐药基因的传播和扩散，对人类健康产生潜在影响。所以对水产品中抗生素残留的检测意义重大。

随着抗生素在水产品中的广泛使用，对抗生素的检测方法提出了更高的要求，亟待开发可同时快速高效检测多种抗生残留的方法。现有的检测手段并不能满足目前多类抗生素的同时检测，并且水产品中基质复杂，脂质和蛋白质对抗生素的检测存在严重干扰，所以对水产品中多种抗生素同时精准定量检测提出挑战。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，以达到检测种类多、回收率高、稳定性强、成本低、基质效应少目的。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，包括如下步骤：

(1)配置多种抗生素的标准工作液，采用HPLC-MS/MS方法检测各个抗生素的浓度，然后绘制标准曲线；

(2)取水产品肌肉组织于绞肉机中匀浆，取匀浆后的肌肉于离心管中，加入提取液，涡旋，超声提取，离心，取上清液于旋蒸瓶中，上清液旋蒸至体积不再变化，将剩余液体转移到离心管中，加入乙腈饱和正己烷和过量无水硫酸钠，涡旋振荡，去除上层正己烷，将下层液体用超纯水复溶，等待固相萃取；

(3)固相萃取SPE小柱依次用甲醇和超纯水活化，然后对样品进行过柱处理，样品过柱后，依次用超纯水和甲醇的水溶液淋洗小柱，真空抽干，最后用氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中；在水浴条件下用氮吹仪吹干；剩余液体用甲醇复溶，于-20℃放置24h以上，之后对样品离心，取上清液经滤膜过滤，即为待测样；

(4)采用HPLC-MS/MS方法结合标准曲线检测待测样中各抗生素的浓度。

上述方案中，步骤(1)中的多种抗生素包括磺胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉、磺胺-6-甲氧嘧啶、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、强力霉素、四环素、土霉素、罗红霉素、泰乐菌素和克拉霉素，共18种抗生素。

上述方案中，抗生素的标准工作液配制方法如下：

配制抗生素标准工作液一：18种抗生素各称取1mg用甲醇定容至1L，浓度为1mg/L；

配制抗生素标准工作液二：取1mL抗生素标准工作液一用甲醇定容至10mL，浓度为100ug/L；

采用上述两种标准工作液配制浓度分别为1ug/kg、5ug/kg、10ug/kg、20ug/kg、50ug/kg、100ug/kg和200ug/kg的抗生素标准工作液；

其中，抗生素标准工作液二用于配置1ug/kg、5ug/kg、10ug/kg和20ug/kg，取样量分别为10uL、50uL、100uL和200uL；抗生素标准工作液一用于配置50ug/kg、100ug/kg和200ug/kg，取样量分别为50uL、100uL和200uL；最后用甲醇定容至1mL。

上述方案中，步骤(2)具体方法如下：

取水产品肌肉组织于绞肉机中匀浆，称取(2±0.02)g匀浆后的肌肉于50mL离心管中，加入15mL提取液，涡旋1min，超声提取15分钟，在10000r/min、4℃下离心10min，取上清液于250mL旋蒸瓶中，剩余残渣重复提取2次，合并上清液；上清液在40℃旋蒸至体积不再变化，将剩余液体转移到50mL离心管中，加入乙腈饱和正己烷和过量无水硫酸钠，涡旋振荡，去除上层正己烷，将下层液体用超纯水复溶至300mL，等待固相萃取。

进一步的技术方案中，所述提取液采用乙腈和EDTA-Mcllvaine缓冲液，体积比为1:1。

上述方案中，步骤(3)的具体方法如下：

固相萃取SPE小柱依次用6mL甲醇和6mL超纯水活化，然后对样品进行过柱处理，速度为3-5mL/min，样品过柱后，依次用6mL超纯水和6mL5％甲醇的水溶液淋洗小柱，真空抽干30min，最后用6mL5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中；在40℃水浴条件下用氮吹仪吹干；剩余液体用甲醇复溶至1mL，于-20℃放置24h以上；之后样品在13000r/min、4℃下离心5min，取上清液经0.22um滤膜过滤，即为待测样。

上述方案中，步骤(4)中，质谱检测参数为：

离子源：API-ESI源；脱溶剂气温度：500℃；离子喷雾电压：5000V；检测方式：多反应监测；

幕帘气体压力、雾化器压力和辅助气体压力分别设置为30.0psi、50.0psi和50.0psi；

色谱条件为：

色谱柱：安捷伦Eclipse Plus-C18，规格为2.1mm×150mm,3.5μm；

流动相A：含有0.1％甲酸的超纯水；

流动相B：乙腈；流速：0.2mL/min。

通过上述技术方案，本发明提供的同时检测水产品中多种抗生素残留的方法具有如下有益效果：

1、本发明可以同时实现对水产品中18种(4类)抗生素的快速检测，降低了检测成本，提高了检测效率。

2、本发明利用正己烷加过量无水硫酸钠对水产品中蛋白质和脂质等基质进行了去除，降低了基质效应，提高分析结果的准确性。

3、本发明在多次实验中均具有较高的回收率，稳定性好(RSD低)，检测精准度高。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

一、原理

生物样品经过匀浆、超声波提取、旋转蒸发浓缩、去除基质效应、固相萃取、氮吹和复溶。采用液相色谱-三重四极杆串联质谱进行检测，根据保留时间定性，外标法定量来检测生物体内各抗生素的浓度。

二、适用范围

该方法适合为生物样品中磺胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉、磺胺-6-甲氧嘧啶、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、强力霉素、四环素、土霉素、罗红霉素、泰乐菌素和克拉霉素18种抗生素提供精确定量。

三、仪器与设备

涡旋振荡器(海门其林贝尔仪器制造有限公司，QL-901)；超声清洗器(深圳市洁盟清洗设备有限公司，JP-060S)；50mL离心机(澳大利亚Dynamica)；2mL离心机(大龙兴创实验仪器有限公司，D1524R)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA)；氮吹仪(北京佳源兴业科技有限公司，MD-12)；十二管防交叉污染固相萃取装置(美国SUPELCO)；液相色谱串联质谱仪(色谱：美国Thermo Scientific；质谱：加拿大AB Sciex)；超纯水机(四川优普超纯科技有限公司，UPR-II-15TN)；十万分之一天平、万分之一天平(美国Thermo Scientific)。

四、材料和试剂

18种抗生素标准品为：磺胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉、磺胺-6-甲氧嘧啶、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、强力霉素、四环素、土霉素、罗红霉素、泰乐菌素和克拉霉素；其中沙拉沙星购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他购自于中国上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98％。

Oasis HLB固相萃取小柱(6mL/500mg，Waters)；乙腈、甲醇(HPLC级，TEDIA)；超纯水(电阻率≥18.25MΩ·cm)；氨水购自于天津市科密欧化学试剂有限公司(HPLC级)；正己烷购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(HPLC级)；无水硫酸钠，磷酸氢二钠十二水合物、柠檬酸水合物、Na₂EDTA购自国药集团化学试剂有限公司(分析纯)。

五、分析过程

5.1标准曲线的配置

配制抗生素标准工作液一：18种抗生素各称取1mg用甲醇定容至1L，浓度为1mg/L；

配制抗生素标准工作液二：取1mL抗生素标准工作液一用甲醇定容至10mL，浓度为100ug/L；

采用上述两种标准工作液配制浓度分别为1ug/kg、5ug/kg、10ug/kg、20ug/kg、50ug/kg、100ug/kg和200ug/kg的抗生素标准工作液；

其中，抗生素标准工作液二用于配置1ug/kg、5ug/kg、10ug/kg和20ug/kg，取样量分别为10uL、50uL、100uL和200uL；抗生素标准工作液一用于配置50ug/kg、100ug/kg和200ug/kg，取样量分别为50uL、100uL和200uL；最后用甲醇定容至1mL。

5.2样品前处理：

本次实验样品为大菱鲆，采样地点为山东半岛南部水产养殖区。取大菱鲆肌肉组织于绞肉机中匀浆，称取(2±0.02)g匀浆后的肌肉于50mL离心管中，空白组不加入任何抗生素标准品，实验组加入100uL抗生素标准工作液一，静置30min。加入15mL提取液(乙腈：EDTA-Mcllvaine缓冲液＝1：1/v:v)，1g无水硫酸钠，涡旋1min，超声提取15分钟，在10000r/min、4℃下离心10min，取上清液于250mL旋蒸瓶中，剩余残渣重复提取2次，合并上清液。上清液在40℃旋蒸至体积不再变化，将剩余液体转移到50mL离心管中，加入乙腈饱和正己烷和过量无水硫酸钠，涡旋振荡，去除上层正己烷，将下层液体用超纯水复溶至300mL，等待固相萃取。。

5.3固相萃取：

固相萃取SPE小柱(6mL/500mg)依次用6mL甲醇和6mL超纯水活化，对样品进行过柱处理，速度为3-5mL/min，样品过柱后，依次用6mL超纯水和6mL5％甲醇的水溶液淋洗小柱，真空抽干30min，最后用6mL5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中。在40℃水浴条件下用氮吹仪吹至近干，用甲醇复溶至1mL，于-20℃放置24h以上。之后样品在13000r/min、4℃下离心5min，取上清液经0.22um滤膜过滤，即为待测样。

5.4HPLC-MS/MS检测：

质谱检测参数为：

离子源：API-ESI源；脱溶剂气温度：500℃；离子喷雾电压：5000V；检测方式：多反应监测(MRM)。

幕帘气体压力、雾化器压力和辅助气体压力分别设置为30.0、50.0和50.0psi。

色谱条件为：

色谱柱：安捷伦Eclipse Plus-C18，规格为2.1mm×150mm,3.5μm；流动相A：含有0.1％甲酸的超纯水；流动相B：乙腈；流速：0.2mL/min。

梯度洗脱程序如表1所示：

表1梯度洗脱程序

时间(min)	A:0.1甲酸水溶液(％)	B:乙腈(％)
			0	90	10
3	80	20
			8	65	35
15	40	60
			15.1	90	10
20	90	10

优化后的质谱参数如表2所示：

表2优化后的质谱参数

*为定量子离子。

5.5检测结果

5.5.1标准曲线

目标抗生素的线性范围、回归方程和相关性如表3所示：

表3目标抗生素的线性范围、回归方程和相关性(R²)

5.5.2回收率

通过标准样检测及加标回收实验，鱼肌肉组织中方法检出限(MDLs)、方法定量限(MQLs)、加标回收率及方法重现性(RSD)如表4所示：

表4鱼肌肉组织中方法检出限(MDLs)、方法定量限(MQLs)、加标回收率及方法重现性(RSD)

5.5.3目标抗生素的检测浓度

通过该方法，对大菱鲆，草虾，南美白对虾和海参中目标抗生素进行检测，结果如表5所示：

表5水产品中抗生素的浓度水平(ug/kg)

六、效果验证

在提取生物样品抗生素的前处理过程中，步骤可简述为以下6步：(1).称量样品于离心管；(2).加入提取液涡旋、超声波提取、离心取上清液；(3).合并上清液旋转蒸发后复溶；(4).固相萃取；(5).氮吹；(6).定容至1mL于棕色小瓶。

现针对不同的前处理过程与本发明的前处理过程进行对比，具体前处理提取条件见表6。

表6. 8种方法的不同提取条件

本发明的前处理方法即表6中的方法8，前处理后，采用HPLC-MS/MS检测抗生素的加标回收率，结果见表7。

加标回收率的计算公式为：

其中，RE(％)是加标回收率；

C₂是加入混合标准溶液的生物样品的检测浓度，ng/mL；

V₂是加入混合标准溶液的生物样品上样前的定容体积，mL；

C₁是未加入混合标准溶液的生物样品的检测浓度，ng/mL；

V₁是未加入混合标准溶液的生物样品上样前的定容体积，mL；

C₀是混合标准溶液的检测浓度，ng/mL；

V₀是混合标准溶液的体积，mL。

表7.水产品中18种抗生素的加标回收率

可以看出，本发明的方法8的前处理过程对18种抗生素的回收率整体高于其余的7种方法，说明本发明的前处理方法可以将水产品中的大部分抗生素都提取出来，因此检测的精度更高。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配置多种抗生素的标准工作液，采用HPLC-MS/MS方法检测各个抗生素的浓度，然后绘制标准曲线；

(2)取水产品肌肉组织于绞肉机中匀浆，取匀浆后的肌肉于离心管中，加入提取液，涡旋，超声提取，离心，取上清液于旋蒸瓶中，上清液旋蒸至体积不再变化，将剩余液体转移到离心管中，加入乙腈饱和正己烷和过量无水硫酸钠，涡旋振荡，去除上层正己烷，将下层液体用超纯水复溶，等待固相萃取；

(3)固相萃取SPE小柱依次用甲醇和超纯水活化，然后对样品进行过柱处理，样品过柱后，依次用超纯水和甲醇的水溶液淋洗小柱，真空抽干，最后用氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中；在水浴条件下用氮吹仪吹干；剩余液体用甲醇复溶，于-20℃放置24h以上，之后对样品离心，取上清液经滤膜过滤，即为待测样；

(4)采用HPLC-MS/MS方法结合标准曲线检测待测样中各抗生素的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，步骤(1)中的多种抗生素包括磺胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉、磺胺-6-甲氧嘧啶、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、强力霉素、四环素、土霉素、罗红霉素、泰乐菌素和克拉霉素，共18种抗生素。

3.根据权利要求2所述的一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，抗生素的标准工作液配制方法如下：

配制抗生素标准工作液一：18种抗生素各称取1mg用甲醇定容至1L，浓度为1mg/L；

配制抗生素标准工作液二：取1mL抗生素标准工作液一用甲醇定容至10mL，浓度为100ug/L；

采用上述两种标准工作液配制浓度分别为1ug/kg、5ug/kg、10ug/kg、20ug/kg、50ug/kg、100ug/kg和200ug/kg的抗生素标准工作液；

其中，抗生素标准工作液二用于配置1ug/kg、5ug/kg、10ug/kg和20ug/kg，取样量分别为10uL、50uL、100uL和200uL；抗生素标准工作液一用于配置50ug/kg、100ug/kg和200ug/kg，取样量分别为50uL、100uL和200uL；最后用甲醇定容至1mL。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，步骤(2)具体方法如下：

取水产品肌肉组织于绞肉机中匀浆，称取(2±0.02)g匀浆后的肌肉于50mL离心管中，加入15mL提取液，涡旋1min，超声提取15分钟，在10000r/min、4℃下离心10min，取上清液于250mL旋蒸瓶中，剩余残渣重复提取2次，合并上清液；上清液在40℃旋蒸至体积不再变化，将剩余液体转移到50mL离心管中，加入乙腈饱和正己烷和过量无水硫酸钠，涡旋振荡，去除上层正己烷，将下层液体用超纯水复溶至300mL，等待固相萃取。

5.根据权利要求1或4所述的一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，所述提取液采用乙腈和EDTA-Mcllvaine缓冲液，体积比为1:1。

6.根据权利要求1所述的一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法如下：

固相萃取SPE小柱依次用6mL甲醇和6mL超纯水活化，然后对样品进行过柱处理，速度为3-5mL/min，样品过柱后，依次用6mL超纯水和6mL5％甲醇的水溶液淋洗小柱，真空抽干30min，最后用6mL5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中；在40℃水浴条件下用氮吹仪吹干；剩余液体用甲醇复溶至1mL，于-20℃放置24h以上；之后样品在13000r/min、4℃下离心5min，取上清液经0.22um滤膜过滤，即为待测样。

7.根据权利要求1所述的一种同时检测水产品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，步骤(4)中，质谱检测参数为：

离子源：API-ESI源；脱溶剂气温度：500℃；离子喷雾电压：5000V；检测方式：多反应监测；

幕帘气体压力、雾化器压力和辅助气体压力分别设置为30.0psi、50.0psi和50.0psi；

色谱条件为：

色谱柱：安捷伦Eclipse Plus-C18，规格为2.1mm×150mm,3.5μm；

流动相A：含有0.1％甲酸的超纯水；

流动相B：乙腈；流速：0.2mL/min。