CN112526024A - 一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法 - Google Patents

一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，包括以下步骤：将水产品的样品放入冷冻干燥仪中低温干燥，得到干燥样品；将上述干燥样品置于50mL圆底离心管中，依次添加提取液和萃取液，涡旋混匀，再与第一净化盐充分混匀，进行离心取得一次上清液；再将一次上清液转移至15mL尖底离心管中，与第二净化盐充分混匀，进行离心取得二次上清液，然后浓缩干燥，再用复溶液进行复溶，经针式过滤器过滤得待检测的样品溶液。本发明首先能同时对多种磺胺类抗生素及其乙酰化代谢产物进行前处理，前处理完成后即可使用常规技术进行样品的色谱或质谱分析，可减少3/4有机试剂的消耗，更绿色、环保、清洁。

Description

一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法
技术领域
本发明涉及抗生素检测领域，具体涉及一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法。
背景技术
磺胺类药物是一种人工合成抗菌药物，抗菌谱广，价格便宜，广泛应用于医疗业，水产养殖业，是一种用于抗感染的人畜共用药。然而，磺胺类药物在人体及动物体内并不能完全吸收，大部分以原型及代谢物随尿液及粪便排出体外。例如，磺胺类药物在动物体内大约有50％以母体形式排出体外，大约有30％以乙酰化代谢物排出体外。这些磺胺类药物及其代谢物能直接进入污水处理厂，但是，研究表明磺胺类在污水处理厂不能完全去除，并随污水出水排入地表水。此外，磺胺类代谢物在污水处理过程可能会重新转变为其母体化合物。
已有研究表明有些代谢物的毒性甚至会比其母体化合物更强，例如乙酰化的磺胺药物一般比其母体化合物的溶解度低，容易析出结晶，产生结晶尿，增加肾毒性。然而，到目前为止，大部分研究者主要的工作还是集中在研究母体化合物，对其代谢物的研究较少，特别是国内关于磺胺的乙酰化代谢物在环境中的研究较少。
样品的前处理是残留检测的重要步骤，也是最消耗时间和试剂的步骤。但是现有水产品中磺胺类药物的残留检测的前处理大部分只能做单种药物残留的前处理，效率低，需要很长的时间进行处理，有机试剂的消耗量大，成本较高。因此，迫切需要建立一种快速高效的检测磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的方法。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，解决了现有水产品中磺胺类药物的残留检测前处理大部分只能做单种药物残留的前处理，效率低，需要很长的时间进行处理，而且有机试剂的消耗量大，成本较高的问题。
技术方案：本发明一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，包括以下步骤：
(1)预处理：将水产品的样品放入冷冻干燥仪中低温干燥，得到干燥样品；
(2)样品处理：将上述干燥样品置于50mL圆底离心管中，依次添加提取液和萃取液，涡旋混匀，再与第一净化盐充分混匀，进行离心取得一次上清液；再将一次上清液转移至15mL尖底离心管中，与第二净化盐充分混匀，进行离心取得二次上清液，然后浓缩干燥，再用复溶液进行复溶，经针式过滤器过滤得待检测的样品溶液；
(3)样品检测：通过高效液相色谱仪对过滤后的待检测的样品溶液进行磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测。
进一步的，所述步骤(2)中提取液为超纯水。
进一步的，所述步骤(2)中萃取液含5％氨水的乙腈。
进一步的，所述步骤(2)中第一净化盐为氯化钠和硫酸镁；第二净化盐为C18和硫酸镁。
进一步的，所述步骤(2)中复溶液为甲醇。
进一步的，所述步骤(2)中针式过滤器为孔径0.22微米的有机相过滤器。
进一步的，所述步骤(2)中二次上清液浓缩干燥具体为：将二次上清液置于10mL玻璃试管中，45℃下旋蒸或氮气吹干。
进一步的，所述步骤(3)中磺胺类抗生素乙酰化代谢产物为磺胺甲恶唑乙酰化代谢物、磺胺嘧啶乙酰化代谢物、磺胺甲基嘧啶乙酰化代谢物和磺胺二甲基嘧啶乙酰化代谢物中的一种或几种。
本发明的高效液相色谱仪对样品溶液进行色谱分析的条件为：柱温40℃，进样体积为5μL，流速为0.4mL/min。正离子模式(ESI+)，流动相包括A(超纯水/(甲醇+0.1％甲酸)，v/v＝98/2)和B(100％乙腈)，梯度洗脱。
本发明的高效液相色谱仪对样品溶液的质谱条件为：配备电喷雾离子源(ESI)，细管电压3kV，碰撞气体流速50L/h，辅助加热气体温度500℃，离子源气体流速900L/h，采用多重反应监测模式(MRM)。
有益效果：本发明首先能同时对多种磺胺类抗生素及其乙酰化代谢产物进行前处理，前处理完成后即可使用常规技术进行样品的色谱或质谱分析，可减少3/4有机试剂的消耗，更绿色、环保、清洁；而且本发明检测过程耗时少，与现有方法相比大大缩短了检测周期，其回收率高，检测的精确度和灵敏度高，检出限低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述：
实施例1(白鲦中磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑其乙酰化代谢产物的残留测定)
反应容器包括：
离心管：50mL圆底离心管，材质为聚丙烯，带1.0毫升分刻度，备9支；
离心管：15mL尖底离心管，材质为聚丙烯，带1.0毫升分刻度，备9支；
0.22微米滤器，采用尼龙膜针式过滤器；
萃取液：含5％氨水的乙腈，15mL，其余为超纯水，10mL，各备9支；
第一净化盐：氯化钠1g，硫酸镁4g；
第二净化盐：C18 150mg，硫酸镁900mg；
复溶液：甲醇，50mL，1瓶；
操作步骤如下：
(1)预处理：将白鲦鱼肉的样品剪成大小均匀的形状，放入冷冻干燥仪中低温干燥，得到干燥样品；
(2)样品处理：准确称取冷冻干燥后的白鲦鱼肉5.0克置于50mL聚丙烯材质圆底离心管中，依次添加提取液超纯水10mL和含5％氨水的乙腈萃取液15mL，涡旋混匀30s，再加入第一净化盐氯化钠1g和硫酸镁4g，手动摇匀，涡旋1min，使萃取液、第一净化盐和鱼肉充分混匀，4000r/min的速度离心5～10min，取得一次上清液；
再将一次上清液取12mL转移至15mL聚丙烯材质尖底离心管中，使其与盛于尖底离心管中的第二净化盐C18 150mg和硫酸镁900mg混合，涡旋1min，充分混匀，4000r/min的速度离心5～10min，取得二次上清液；
取9mL二次上清液置于玻璃试管中，45℃下旋蒸或氮气吹干，取1mL复溶液甲醇进行复溶得到待测液，再经孔径0.22微米的有机相过滤器过滤得待检测的样品溶液，并分装于棕色色谱瓶中，可供色谱或质谱分析；
(3)样品检测：通过高效液相色谱仪对过滤后的待检测的样品溶液进行磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测。
实施例2(贝类中磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶其乙酰化代谢产物的残留测定)
反应容器包括：
离心管：50mL圆底离心管，材质为聚丙烯，带1.0毫升分刻度，备9支；
离心管：15mL尖底离心管，材质为聚丙烯，带1.0毫升分刻度，备9支；
0.22微米滤器，采用尼龙膜针式过滤器；
萃取液：含5％氨水的乙腈，15mL，其余为超纯水，10mL，各备9支；
第一净化盐：氯化钠1g，硫酸镁4g；
第二净化盐：C18 150mg，硫酸镁900mg；
复溶液：甲醇，50mL，1瓶；
操作步骤如下：
(1)预处理：将贻贝肉的样品剪成大小均匀的形状，放入冷冻干燥仪中低温干燥，得到干燥样品；
(2)样品处理：准确称取冷冻干燥后的贻贝肉5.0克置于50mL聚丙烯材质圆底离心管中，依次添加提取液超纯水10mL和含5％氨水的乙腈萃取液15mL，涡旋混匀30s，再加入第一净化盐氯化钠1g和硫酸镁4g，手动摇匀，涡旋1min，使萃取液、第一净化盐和贝肉充分混匀，4000r/min的速度离心5～10min，取得一次上清液；
再将一次上清液取12mL转移至15mL聚丙烯材质尖底离心管中，使其与盛于尖底离心管中的第二净化盐C18 150mg和硫酸镁900mg混合，涡旋1min，充分混匀，4000r/min的速度离心5～10min，取得二次上清液；
取9mL二次上清液置于玻璃试管中，45℃下旋蒸或氮气吹干，取1mL复溶液甲醇进行复溶得到待测液，再经孔径0.22微米的有机相过滤器过滤得待检测的样品溶液，并分装于棕色色谱瓶中，可供色谱或质谱分析；
(3)样品检测：通过高效液相色谱仪对过滤后的待检测的样品溶液进行磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测。
测试：
(1)对实施例1和实施例2的样品一起进行检测分析，其检测条件如下：
液相色谱条件：仪器采用Waters超高效液相色谱系统(Milford,MA,USA)，色谱柱型号为BEH-C18(100mm×1.7um×2.1mm；Waters，USA)，柱温40℃，进样体积为5μL，流速为0.4mL/min。流动相包括A(超纯水/(甲醇+0.1％甲酸)，v/v＝98/2)和B(100％乙腈)，梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1液相色谱条件
Figure BDA0002823228100000041
质谱条件：Waters Xevo三重四级杆质谱仪，配备电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压3kV；碰撞气体流速50L/h；辅助加热气体温度500℃；离子源气体流速900L/h。采用多反应监测(MRM)模式，各种物质的采集参数见表2。
表2采集参数
Figure BDA0002823228100000051
(2)重复性和变异系数
称取经测定空白试样5g，分别加入0.5，1和2ng/g浓度水平的磺胺类物质及其乙酰化代谢产物的混合标准溶液，充分混匀，按照实施例1的方法进行前处理并测定含量，每个添加水平平行测定6份，所有物质回收率和变异系数见表3。
表3回收率和变异系数
Figure BDA0002823228100000052
Figure BDA0002823228100000061
根据表3中的实验结果表明：各个物质的回收率较好，变异系数很小，说明检测过程误差小，而且检测结果稳定，符合检测要求。

Claims (8)

1.一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)预处理：将水产品的样品放入冷冻干燥仪中低温干燥，得到干燥样品；
(2)样品处理：将上述干燥样品置于50mL圆底离心管中，依次添加提取液和萃取液，涡旋混匀，再与第一净化盐充分混匀，进行离心取得一次上清液；再将一次上清液转移至15mL尖底离心管中，与第二净化盐充分混匀，进行离心取得二次上清液，然后浓缩干燥，再用复溶液进行复溶，经针式过滤器过滤得待检测的样品溶液；
(3)样品检测：通过高效液相色谱仪对过滤后的待检测的样品溶液进行磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测。
2.根据权利要求1所述的一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中提取液为超纯水。
3.根据权利要求1所述的一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中萃取液为含5％氨水的乙腈。
4.根据权利要求1所述的一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中第一净化盐为氯化钠和硫酸镁；第二净化盐为C18和硫酸镁。
5.根据权利要求1所述的一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中复溶液为甲醇。
6.根据权利要求1所述的一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中针式过滤器为孔径0.22微米的有机相过滤器。
7.根据权利要求1所述的一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中二次上清液浓缩干燥具体为：将二次上清液置于10mL玻璃试管中，45℃下旋蒸或氮气吹干。
8.根据权利要求1所述的一种水产品中磺胺类抗生素及其乙酰化代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中磺胺类抗生素乙酰化代谢产物为磺胺甲恶唑乙酰化代谢物、磺胺嘧啶乙酰化代谢物、磺胺甲基嘧啶乙酰化代谢物和磺胺二甲基嘧啶乙酰化代谢物中的一种或几种。
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