CN113533565A - Uplc-ms/ms法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法 - Google Patents

Uplc-ms/ms法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了UPLC‑MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，即槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素和山奈酚的检测，先利用超高效液相色谱将待测物与尿液基质分离，再利用质谱定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品中定量离子峰面积为Y轴，建立标准曲线，计算上述8种黄酮类化合物的浓度。本发明釆用冷冻干燥机对样品进行浓缩处理，复溶后进超高效液相色谱‑串联质谱联用仪(UPLC‑MS)分析，冷冻干燥机通过预冻样品中的水分及有机溶剂，在真空状态下直接升华，可利用冷阱捕获蒸发出来的气体，使蒸发过程快速进行，使用24小时冷冻干燥代替氮吹可简化样品前处理步骤，提高检测效率，适合大样本检测人体尿液中黄酮类化合物。

Description

UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法
技术领域
本发明涉及生物监测领域，具体是一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法。
背景技术
近年来，果蔬的健康促进效益日益受到国内外学者的关注。大量流行病学调查资料显示，水果蔬菜的摄入能够有效调节血糖、血脂代谢，降低2型糖尿病、代谢综合征、脑卒中等慢性病的发病风险。目前果蔬摄入常用的评价工具是膳食频率问卷(FFQ)，这种半定量的问卷由于自我报告摄入量不精确且难以控制回忆偏倚，因此反映机体果蔬摄入量最好结合生物标志物检测。大量研究表明，尿液中黄酮类化合物能够作为果蔬摄入的生物标志物，客观反应人体果蔬摄入情况，有助于研究果蔬摄入与疾病的关联。
黄酮类化合物(flavonoids，简称FVD)广泛存在于水果、蔬菜、牧草和药用植物中，是植物在长期的自然选择中产生的一些次级代谢产物，许多植物的叶、皮、根和果实中都含有一定量的FVD，具有抗氧化作用、抗炎、预防癌症等活性。然而大多数FVD还没有被开发为预防或治疗疾病的化学药物，主要与其在体内的生物利用度低有关，未吸收的FVD能够通过尿液排出。机体摄入富含黄酮类化合物的食物后经过代谢最终能够通过超高效液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS)在尿液中检测到。根据文献报道，目前使用UPLC-MS法检测尿液中FVD时采用的预处理方法主要通过氮吹浓缩样本，通过氮吹仪将氮气吹入样本的表面，使样本中的溶剂快速蒸发、分离，经过无氧浓缩后得到较纯净的样本。但是对于存放时间较长、尿液中FVD含量较低的样本，甚至需要氮吹两次进行浓缩，不但增加了工作量，还进一步放大了氮吹的缺陷。使用氮吹仪进行氮吹主要有以下缺点：
第一，使用氮吹仪进行氮吹时存在将样品中物质吹到实验室中的风险，必须在通风橱中操作；
第二，氮吹可燃溶剂存在爆炸危险，因此对于含有可燃溶剂的样本无法使用氮吹进行浓缩；
第三，浓缩有毒溶剂时，即使将整个系统置于通风柜中，操作者仍然存在中毒风险；
第四，氮吹时样品温度高，不适用于温度敏感性样品；
第五，氮吹仪的孔数与气针数量有限，常见的氮吹仪主要为12孔、24孔和36孔，样品处理量少，无法一次大批量处理样本；
第六，氮吹过程中需要保持氮气体流量恒定、均匀，因此操作者需要根据样品液面不断调节气流，对全过程进行监控；如果未能控制好气流，容易造成样本喷溅，既损失样本，还易造成样本相互污染；
第七，氮吹需要消耗氮气，增加额外成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，包括以下步骤：
步骤一：混标的制备：
按比例称取槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素、山奈酚后将八种黄酮类化合物粉末充分混匀，制得粉末混合物，称取适量粉末混合物后使用纯甲醇对其定容，得到混标；
步骤二：样品预处理：
S1：对冷冻的尿液进行解冻后，取适量尿液置于塑料Ep管，低温离心得到上清液A，取上清液A备用；
S2：在上清液A中分别加入混标、30-70ul乙酸钠缓冲盐(2mol/L)、5-20ul的β-葡萄糖醛苷酸酶和芳基硫酸酯酶的混合酶(GRD:15.2U/ml；ARS:23U/ml)，恒温水浴加热1-3h，得到水浴孵化好的样品；
S3：向水浴孵化好的样品中加入1ml纯乙腈，低温离心后得到上清液B；
S4：将上清液B移至西林瓶中，并在西林瓶瓶口包裹保鲜膜，低温冷冻，得到冷冻样品；
S5：在西林瓶瓶口的保鲜膜上扎至少一个小孔，将西林瓶连通冷冻样品置于冷冻干燥机中低温干燥15-30小时后取出；
S6：在干燥后的西林瓶内加入150-300ul纯甲醇后在涡旋仪上进行复溶，得到复溶样品；
S7：将复溶的样品移至塑料Ep管中，低温离心得到上清液C；
S8：将上清液C移至尼龙微孔滤膜中过滤至进样瓶中进UPLC-MS中检测分析。
作为本发明进一步的方案：所述步骤一种，槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素、山奈酚的比例为(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100)。
作为本发明进一步的方案：所述步骤一中，混标定容后的最终浓度为1000ng/mL。
作为本发明进一步的方案：所述S1中，尿液的解冻前的冷冻温度为-80℃，尿液的解冻温度为1-6℃，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。
作为本发明进一步的方案：所述S2中恒温水浴加热的温度为30-40℃。
作为本发明进一步的方案：所述S3中，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。
作为本发明进一步的方案：所述S6中，涡旋仪进行涡旋复溶的时长为20-45s。
作为本发明进一步的方案：所述S7中，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。
作为本发明再进一步的方案：所述预处理方法中所用水溶液均为超纯水，所用有机试剂均为色谱级。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明釆用冷冻干燥机对样品进行浓缩处理，复溶后进超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS)分析。冷冻干燥机通过预冻样品中的水分及有机溶剂，在真空状态下直接升华，可利用冷阱捕获蒸发出来的气体，使蒸发过程快速进行。使用24小时冷冻干燥代替氮吹可简化样品前处理步骤，提高检测效率，适合大样本检测人体尿液中黄酮类化合物。
本发明相比现有技术的优点是：
1、使用24小时冷冻干燥浓缩样品时不存在将样品中物质吹到实验室中的风险，且不受溶剂的限制，克服了氮吹易将样品中的物质吹到实验室中的风险和无法浓缩含有可燃溶剂样本的缺陷。
2、浓缩过程中样品温度低，适用于温度敏感性样品。
3、常见的氮吹仪主要为12孔、24孔和36孔，因此使用氮吹仪最多一次处理12、24、36个样本(一次处理的样本数≤氮吹仪孔位数)，无法一次大批量处理样本；由于冷冻干燥机容量大，因此使用冷冻干燥机可以一次处理几百个样本，干燥后的样品性状稳定，于4℃冰箱中保存3-4天后复溶检测效果依然稳定。对于存放时间较长、尿液中FVD含量较低的样本，使用氮吹甚至需要进行两次，而使用冷冻干燥机对样品干燥24小时，检测峰形良好，提高了分析效率。
4、将样品放入冷冻干燥机后不用反复调节仪器，无需人工全过程监控，只要确保仪器正常运转即可，节省了大量人力。
5、不存在样品喷溅、相互污染的现象。
6、无需消耗氮气，降低了额外成本，节能环保。
附图说明
图1为本发明中8种黄酮类化合物标准品的色谱图A。
图2为本发明中8中黄酮类化合物标准品的色谱图B。
图3为本发明中8中黄酮类化合物标准品的色谱图C。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，包括以下步骤：
步骤一：混标的制备：
按比例称取槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素、山奈酚后将八种黄酮类化合物粉末充分混匀，制得粉末混合物，称取适量粉末混合物后使用纯甲醇对其定容，得到混标；
步骤二：样品预处理：
S1：对冷冻的尿液进行解冻后，取适量尿液置于塑料Ep管，低温离心得到上清液A，取上清液A备用；
S2：在上清液A中分别加入混标、30-70ul的乙酸钠缓冲盐(2mol/L)、5-20ul的β-葡萄糖醛苷酸酶和芳基硫酸酯酶的混合酶(GRD:15.2U/ml；ARS:23U/ml)，恒温水浴加热1-3h，得到水浴孵化好的样品；
S3：向水浴孵化好的样品中加入1ml纯乙腈，低温离心后得到上清液B；
S4：将上清液B移至西林瓶中，并在西林瓶瓶口包裹保鲜膜，低温冷冻，得到冷冻样品；
S5：在西林瓶瓶口的保鲜膜上扎至少一个小孔，将西林瓶连通冷冻样品置于冷冻干燥机中低温干燥15-30小时后取出；
S6：在干燥后的西林瓶内加入150-300ul纯甲醇后在涡旋仪上进行复溶，得到复溶样品；
S7：将复溶的样品移至塑料Ep管中，低温离心得到上清液C；
S8：将上清液C移至尼龙微孔滤膜中过滤至进样瓶中进UPLC-MS中检测分析。
作为本发明进一步的方案：所述步骤一种，槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素、山奈酚的比例为(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100)。
所述步骤一中，混标定容后的最终浓度为1000ng/mL。
所述S1中，尿液的解冻前的冷冻温度为-80℃，尿液的解冻温度为1-6℃，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。
所述S2中恒温水浴加热的温度为30-40℃。
所述S3中，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。
所述S6中，涡旋仪进行涡旋复溶的时长为20-45s。
所述S7中，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。
所述预处理方法中所用水溶液均为超纯水，所用有机试剂均为色谱级。
UPLC-MS检测分析
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的尿液中的上述8种黄酮类化合物浓度。以标准品的浓度为X轴，标准品的峰面积为Y轴，建立标准曲线，计算上述8种黄酮类化合物的浓度，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：1％甲酸水溶液；流动相B：纯乙腈；
色谱柱型号：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)；预柱：ACQUITYHSS T3 1.8μmvanguard一体式保护柱；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至70:30；在1.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至为80:20；在5.0-7.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20。
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI-)；离子源温度为120℃；去溶剂温度为350℃，雾化气流速为500L/h，锥孔气流速为50L/h；同时监测各目标物。
(3)色谱和质谱条件的优化
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的尿液中的上述8种黄酮类化合物的浓度，色谱柱选择Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱。ACQUITY UPLC HSS T3固定相是与100％水溶液流动相兼容的C18固定相，设计用于解决分离保留水溶性、极性大的小分子有机化合物，黄酮类化合物在HSS T3色谱柱上有较好的保留，峰形较好，因此选择Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)用于分析。同时比较了甲醇－0.1％甲酸水、乙腈－0.1％甲酸水2种流动相对目标待测物分析的影响，结果表明，当用乙腈－0.1％甲酸水作为流动相，8种黄酮类化合物的分离结果良好，峰形尖锐，且响应信号最强。因此，实验选择乙腈－0.1％甲酸水作为分离的流动相。采用乙腈－0.1％甲酸水进行等度洗脱以改善峰形和减少基质效应。将起始流动相0.1％甲酸水比例在30％～90％范围内对混标进行分析，以8种黄酮类化合物的响应值、峰型和保留时间为考察指标。在本法最终选择的洗脱程序下，目标化合物的信号强度稳定，8种黄酮类化合物实现有效分离，峰形良好，灵敏度高，特异性强，7min之内可完成分离和检测。
为了最佳的质谱条件以保证对分析物定性和定量的准确性，必须对分析物的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等一系列质谱参数进行优化。进样1000ng/ml的混合标准溶液，依次进行质谱的一级以及碎片扫描，找出母离子，继而优化选择子离子。采用针泵进样、Q1Scan方式获取待测物母离子，Q3Scan通过优化碰撞能量获得子离子，最后采用MRM模式对待测物进行定性和定量分析。
进一步地，进样体积为2～10μL，优选为5μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的尿液中的上述8种黄酮类化合物浓度时，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)；采用梯度洗脱的方式。
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI-)；离子源温度为120℃；去溶剂温度为350℃，雾化气流速为500L/h，锥孔气流速为50L/h；同时监测各目标物。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
方法学研究实验的样本来自于国家重点研发计划“精准医学研究”重点专项中的“新疆多民族自然人群队列建设及健康随访研究”队列在伊犁霍城县收集的人体尿液样本。
(1)仪器：AcquityUPLC超高效液相色谱串联Xuvo TQD三重四极杆质谱仪(配有点喷雾离子源及MassLynx 4.0数据处理系统)(美国Waters公司)；低温高速离心机(德国Sigma公司)；冷冻干燥机(美国Thermo Fisher公司)；纯水机(美国Milli-Q公司)；涡流混合器(中国赛洛捷克公司)；KQ3200DE型数控超声波清洗机(中国昆山市超声仪器公司)；恒温水浴锅(中国群安仪器公司)；冰箱(中国海尔-4℃，-20℃，-80℃)；可调移液器(德国Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；容量瓶、量筒等。
(2)试剂：MS级甲醇(美国Thermo Fisher公司)；MS级乙腈(美国Thermo Fisher公司)；甲酸(纯度≥98％，美国Fluka公司)；乙酸钠缓冲液(2mol/L，pH＝5.0，中国源叶公司)；β-葡萄糖醛苷酸酶和芳基硫酸酯酶的混合酶(GRD:15.2U/ml；ARS:23U/ml，中国源叶公司)。
(3)标准品：槲皮素(批号：C01J10Y91727，纯度：HPLC≧98％，中国源叶公司)、橙皮素(批号：C03F6Y1，纯度：HPLC≧98％，中国源叶公司)、杨梅素(批号：YM0311YA13，纯度：HPLC≧98％，中国源叶公司)、柚皮素(批号：YJ0603HA13，纯度：HPLC≧98％，中国源叶公司)、根皮素(批号：X05M7C10458，纯度：HPLC≧98％，中国源叶公司)、异鼠李素(批号：P17S9F68615，纯度：HPLC≧98％，中国源叶公司)、芹菜素(批号：T04S8F43072，纯度：HPLC≧98％)、山奈酚(批号：C26J8Y38642，纯度：HPLC≧98％，中国源叶公司)。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)；采用梯度洗脱的方式，详见表1；流速为0.2mL/min，柱温为25℃，进样体积为5μL；
表1：流动相梯度洗脱参数
Figure BDA0003158730190000091
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI-)；离子源温度为120℃；去溶剂温度为350℃，雾化气流速为500L/h，锥孔气流速为50L/h；同时监测各目标物；各个目标物的去簇电压和碰撞电压等参数见表2。8种黄酮类化合物标准品色谱图见图1-3。
表2 8种黄酮成分的保留时间及质谱分析参数
Figure BDA0003158730190000092
Figure BDA0003158730190000101
注：*是最优子离子通道。
三、实验过程
(1)混标的制备
精确称量槲皮素10.54ng、橙皮素10.41ng、杨梅素10.72ng、柚皮素10.30ng、根皮素10.50ng、异鼠李素10.71ng、芹菜素10.25ng、山奈酚10.44ng，将8种黄酮类化合物粉末充分混匀；
精确称取10mg混合的对照品，于10mL容量瓶中使用纯甲醇定容，最终浓度为1000ng/mL。
(2)样品预处理
①将于-80℃存储的尿液置于4℃冰箱中解冻，待尿液解冻后取2ml尿液置于2ml的塑料Ep管中，在低温离心机中离心10分钟(转速：10000rrp；温度：4℃)；离心后取1ml上清液备用；
②在上清液中分别加入1000ng/ml的混标、50ul乙酸钠缓冲盐(2mol/L)、10ul的β-葡萄糖醛苷酸酶和芳基硫酸酯酶的混合酶(GRD:15.2U/ml；ARS:23U/ml)，于37℃水浴锅中恒温水浴2小时；
③将水浴孵化好的样品中加入1ml纯乙腈，置于低温离心机中离心10分钟(转速：10000rrp；温度：4℃)；
④将上清液移至西林瓶中，并在瓶口包裹保鲜膜，置于-80℃超低温冰箱中冷冻1小时后取出。在瓶口的保鲜膜上扎一个小孔，将冷冻的样本置于冷冻干燥机中低温干燥24小时后取出；
⑤在干燥的西林瓶内加入200ul纯甲醇后在涡旋仪上涡旋30秒进行复溶，将复溶的样品移至2ml的塑料Ep管中，在低温离心机中离心10分钟(转速：10000rrp；温度：4℃)，使用2mL注射器将上清液移至0.22um的尼龙微孔滤膜中过滤至进样瓶中进UPLC-MS中检测分析。
标准曲线
1.取1000ng/ml的混合标准品储备液适量，用甲醇分步稀释配制质量浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、62.5ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL和500ng/mL的系列混合标准品溶液(现配现用)，上机测定。以标准品中定量离子峰面积为纵坐标(Y)，对照品溶液浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，计算线性方程。见表3。
表3 8种黄酮类化合物的线性方程及相关系数
Figure BDA0003158730190000111
Figure BDA0003158730190000121
超高效液相色谱－串联质谱法具备超高效液相色谱的高效分离能力以及质谱的强定性能力，可简化样品前处理步骤，减少有机溶剂的使用，完成复杂基质中低浓度目标待测物的定量，具有较高的灵敏度和准确性。
本发明建立了UPLC-MS/MS一同测定人体尿液中8种黄酮类化合物的预处理方法。预处理经济高效，不需要固相萃取或衍生化反应，使用冷冻干燥技术替代氮吹对样品进行浓缩，能够大批量的处理样本，节省大量人力的同时能够降低样本污染的风险，提高了分析检测效率。适用于大样本人群中尿液黄酮类化合物的检测，为客观机体反映果蔬摄入，揭示黄酮类化合物和果蔬的健康效应提供了保障。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：混标的制备：
按比例称取槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素、山奈酚后将八种黄酮类化合物粉末充分混匀，制得粉末混合物，称取适量粉末混合物后使用纯甲醇对其定容，得到混标；
步骤二：样品预处理：
S1：对冷冻的尿液进行解冻后，取适量尿液置于塑料Ep管，低温离心得到上清液A，取上清液A备用；
S2：在上清液A中分别加入混标、30-70ul的乙酸钠缓冲盐(2mol/L)、5-20ul的β-葡萄糖醛苷酸酶和芳基硫酸酯酶的混合酶(GRD:15.2U/ml；ARS:23U/ml)，恒温水浴加热1-3h，得到水浴孵化好的样品；
S3：向水浴孵化好的样品中加入1ml纯乙腈，低温离心后得到上清液B；
S4：将上清液B移至西林瓶中，并在西林瓶瓶口包裹保鲜膜，低温冷冻，得到冷冻样品；
S5：在西林瓶瓶口的保鲜膜上扎至少一个小孔，将西林瓶连通冷冻样品置于冷冻干燥机中低温干燥15-30小时后取出；
S6：在干燥后的西林瓶内加入150-300ul纯甲醇后在涡旋仪上进行复溶，得到复溶样品；
S7：将复溶的样品移至塑料Ep管中，低温离心得到上清液C；
S8：将上清液C移至尼龙微孔滤膜中过滤至进样瓶中进UPLC-MS中检测分析。
2.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述步骤一种，槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素、山奈酚的比例为(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100)。
3.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述步骤一中，混标定容后的最终浓度为1000ng/mL。
4.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述S1中，尿液的解冻前的冷冻温度为-80℃，尿液的解冻温度为1-6℃，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。
5.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述S2中恒温水浴加热的温度为30-40℃。
6.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述S3中，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。
7.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述S6中，涡旋仪进行涡旋复溶的时长为20-45s。
8.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述S7中，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。
9.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述预处理方法中所用水溶液均为超纯水，所用有机试剂均为色谱级。
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