CN110426470B - 一种鸡蛋中生物素含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡蛋中生物素含量的测定方法，建立了同位素稀释超高液相色谱‑串联质谱法测定鸡蛋中生物素含量，使用固相萃取柱有效去鸡蛋中的脂肪、磷脂等杂质，有效降低了基质效应，延长了色谱柱的使用寿命，减少了对质谱的污染。同位素内标的加入有效校正了实验过程中基质效应的影响和前处理过程中生物素损失所带来的偏差，提高分析方法的准确性及稳定性。本方法检验周期短、灵敏度高、准确性高、精密度好。本方法对准确评定鸡蛋中生物素含量提供了技术支持。

Description

一种鸡蛋中生物素含量的测定方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种鸡蛋中生物素含量的测定方法。

背景技术

生物素(Biotin)又称维生素B7、维生素H，是一种水溶性维生素，普遍存在于动植物体内，尤其在动物肝组织和蛋黄中含量比较丰富。生物素作为羧化、脱羧和脱氢反应酶系的辅助因子，参与蛋白质、脂肪和糖类的代谢，是动物机体维持正常生理机能所必需的维生素之一。生物素在动物体内细胞中常以游离状态或与蛋白质相结合的状态存在，是一个脲基环含有一个硫原子和一条戊酸的侧链，现已知有8种异构体，天然存在的仅有D-生物素有活性。

鸡蛋营养成分全面，蛋白质、脂肪、维生素、碳水化合物、常量和微量元素等各种营养成分的含量也较高，是人类优良的天然营养食品。生物素是鸡蛋中含量丰富的维生素之一。随着经济发展和人民生活水平的提高，人们对优质、安全、营养健康的食品需求日益增加，因此准确测定鸡蛋中生物素含量对鸡蛋营养价值的评定和研究具有重要意义。

目前，生物素的测定方法主要是微生物法、酶联免疫法、荧光免疫层析法、生物传感器法、毛细管电泳法、液相色谱法、液相色谱质谱联用法。其中微生物法灵敏度高，但是实验周期长、重复性差，对实验操作环境有比较严格的要求；酶联免疫法基于生物素和亲和素的特定反应，但所用试剂价格昂贵；生物素无典型的紫外和荧光发色团，液相色谱法采用紫外检测器直接测定灵敏度比较低，用荧光检测器需要衍生过程比较繁琐。鸡蛋中生物素与其它动植物组织相比虽然含量较高，但一般在十几到几十个微克/100克，仍属于低含量样品。液相色谱-质谱联用法具有灵敏性高、选择性好、分析速度快等优点，比较适合低含量样品的测定。鸡蛋是卵磷脂(磷脂)含量最高的食物之一，此外还含有大量的脂肪和蛋白质。传统的样品处理方法主要采用蛋白质沉淀和离心去除蛋白质，然后再采用繁琐的正己烷脱脂步骤或使用反相吸附剂去除脂肪。虽然这些技术可有效去除样品提取液中的大部分脂肪，但它们都无法去除磷脂。大量磷脂和少量脂肪会随着目标物一起被提取出来，这些共提物会对生物素的分析过程有显著的干扰，导致明显的基质效应，从而影响分析结果的准确性和重复性，除此之外，对超高效液相色谱系统的色谱柱和其它部件以及质谱仪污染严重。

发明内容

本发明提供了一种鸡蛋中生物素含量的测定方法，以解决鸡蛋中生物素含量低，基质复杂，难以准确测定的问题。

本发明提供的鸡蛋中生物素含量的测定方法，包括以下步骤：

(1)分别以生物素标准品和生物素同位素标准品配制生物素标准储备液和生物素同位素标准储备液；用甲醇水溶液分别对生物素标准储备液和生物素同位素标准储备液稀释，得到生物素标准中间液和生物素同位素标准中间液。

(2)分别取不同体积的生物素标准中间液，各加入相同体积的生物素同位素标准中间液，以初始流动相定容，得到标准系列工作液。

(3)称取一定质量的鸡蛋试样于容量瓶中，加入生物素同位素标准中间液后，再加入硫酸溶液充分摇匀，高温加热充分水解，冷却至室温，用水定容，摇匀，经滤纸过滤，得到鸡蛋样品提取液。

(4)将固相萃取柱连接到固相萃取装置上，取鸡蛋样品提取液上样，先用水和甲醇溶液淋洗，再用乙腈-甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮吹至近干，用初始流动相复溶，经有机相微孔滤膜过滤后，得到鸡蛋样品待测液。

(5)分别吸取标准系列工作液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得标准系列工作液的色谱图；根据标准工作液的色谱图中，生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值以及生物素浓度，建立生物素标准曲线。

(6)吸取鸡蛋样品待测液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得鸡蛋样品色谱图；将鸡蛋样品色谱图中生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值，代入生物素标准曲线中，得到鸡蛋样品中生物素含量。

优选地，超高效液相色谱质谱联用仪的色谱条件如下：

色谱柱：C18液相色谱柱，其柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒度1.7μm；

柱温：40℃；

进样量：5μL；

流动相：0.1％甲酸溶液和乙腈；

流速：0.3mL/min。

优选地，超高效液相色谱质谱联用仪的质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式；毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：30V；脱溶剂气温度450℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气流速：850L/h：锥孔反吹气流速：150L/h；碰撞气流速：0.12mL/min；采集模式：多反应监测。

优选地，步骤(3)中，硫酸的浓度为0.1mol/L，水解温度为121℃，水解时间为30min。

优选地，步骤(4)中，所述固相萃取柱为QASIS PRiME HLB固相萃取柱。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种鸡蛋中生物素含量的测定方法，建立了同位素稀释超高液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中生物素含量，使用固相萃取柱有效去鸡蛋中的脂肪、磷脂等杂质，有效降低了基质效应，延长了色谱柱的使用寿命，减少了对质谱的污染。同位素内标的加入有效校正了实验过程中基质效应的影响和前处理过程中生物素损失所带来的偏差，提高分析方法的准确性及稳定性。本方法检验周期短、灵敏度高、准确性高、精密度好。本方法对准确评定鸡蛋中生物素含量提供了技术支持。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同提取方式对生物素提取的影响；

图2为不同固相萃取柱对生物素基质效应的影响；

图3为本发明提供的标准溶液(10ng/mL)和鸡蛋样品的MRM和TIC色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种鸡蛋中生物素含量的测定方法，以解决鸡蛋中生物素含量难以准确测的问题。下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1仪器、试剂与材料

ACQUITYTM超高效液相色谱仪和Xevo TQ-S质谱仪配有电喷雾(ESI)电离源和MasslynxTM色谱工作站(美国Waters公司)；超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)；MS3涡旋混合器(IKA公司)；N-EVAP-45位氮吹仪(美国Organomation公司)；SQP-电子天平(塞多利斯科学仪器有限公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

D-生物素标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司)；生物素-d2即氘代生物素同位素(ISOREAG公司)；实验用鸡蛋样品购自于当地超市。甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；QASIS PRiME HLB固相萃取柱(60mg，3mL，美国Waters公司)；硫酸、乙酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；有机微孔滤膜(0.22μm，上海安谱科学仪器有限公司)。

2标准溶液的配制

D-生物素标准储备液(100μg/mL)：准确称取5mg(精确至0.1mg)生物素标准品于50mL容量瓶中，用甲醇-水(1:1，v/v)定容至刻度。储存于棕色玻璃瓶中，-18℃密封保存。

D-生物素标准中间液(100ng/mL)：取适量1.00mL生物素标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇-水(1:1，v/v)定容至刻度；然后用甲醇-水(1:1，v/v)逐级稀释到100ng/mL，储存于棕色玻璃瓶中，2℃～4℃保存。

生物素-d2标准储备液(100μg/mL)：准确称取5mg(精确至0.1mg)生物素-d2于50mL容量瓶中，用甲醇-水(1:1，v/v)定容至刻度。储存于棕色玻璃瓶中，-18℃密封保存。

生物素-d2标准中间液(2μg/mL)：吸取2.00mL生物素-d2标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇-水(1:1，v/v)定容至刻度，储存于棕色玻璃瓶中，2℃～4℃保存。

标准工作液配制：分别准确吸取适量生物素标准中间液于10mL容量瓶中，各加入生物素-d2标准中间液75μL，用初始流动相定容至刻度，使该系列标准生物素的浓度分别为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL，使用前配制。

3样品制备

将鸡蛋用粉碎机匀浆混匀，避光、4℃冰箱保存，1周内测定。

4样品前处理

4.1提取

称取1g(精确到0.001g)粉碎均匀的鸡蛋样品于50mL容量瓶中，加入375μL生物素-d2标准中间液，加入25mL的0.1mol/L硫酸溶液充分摇匀，在121℃下水解30min，冷却至室温后，用水定容至50mL，摇匀，经滤纸过滤，得到鸡蛋样品提取液。

实验分别考察了a.硫酸水解、b.硫酸水解后酶解、c.柠檬酸缓冲溶液水解后酶解三种提取方式对鸡蛋中生物素提取效果(图1)。实验条件如下：a.样品用0.1mol/L硫酸溶解后，在121℃下水解30min；b.样品经与a相同的方式水解后，调节试样溶液的pH至4.5±0.2，加入1mL蛋白酶-淀粉酶液(分别称取0.2g淀粉酶和0.2g木瓜蛋白酶，加入20mL水混匀)，在36℃±1℃下酶解16h；c.样品经柠檬酸盐缓冲溶液(称取1.5g柠檬酸加入适量水溶解，调pH至4.5±0.2，定容至100mL)溶解后，在121℃下水解30min，加入1mL蛋白酶-淀粉酶液(分别称取0.2g淀粉酶和0.2g木瓜蛋白酶，加入20mL水混匀)，在36℃±1℃下酶解16h。实验发现(图1)，三种提取方式都能有效沉淀蛋白，而且对于样品中生物素的提取效果没有明显的差异，但是后两种提取方式需要酶解16h，检验周期长。实验选择用硫酸水解提取。

除此之外，还考察了硫酸不同浓度、水解时间和水解温度对鸡蛋样品中生物素的提取效果。结果表明，随着硫酸浓度的增加，鸡蛋样品中生物素的含量逐渐增加，超过0.1mol/L之后又轻微下降的趋势。原因可能是生物素在鸡蛋中以游离状态或与蛋白质相结合的状态存在，酸度较低时，水解不完全，生物素释放不完全，导致样品中生物素含量偏低；但生物素在强酸中稳定性会变差，所以硫酸浓度超过0.1mol/L后生物素含量降低。因此，硫酸浓度为0.1mol/L为优选。随着水解时间的增加，水解效率增加，生物素提取效率提高，30min后略微有下降趋势。优选水解时间为30min。生物素的提取率随着温度的增加，先增加后下降。原因可能是因为温度较低时，不能有效的水解蛋白，鸡蛋中结合态的生物素不能完全释放出来；但温度过高时对生物素产生破坏，反而不利于生物素的提取，所以对生物素提取的影响先增加后下降。优选水解温度确定为121℃。

4.2净化

将QASIS PRiME HLB固相萃取柱连接到固相萃取装置上，取1mL上述鸡蛋样品提取液上样，然后分别用3mL水和3mL 5％甲醇溶液淋洗，最后用1mL乙腈-甲醇(9:1，V/V)洗脱，收集全部洗脱液，45℃氮吹至近干，用1mL初始流动相复溶，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤后，得到鸡蛋样品待测液。

由于鸡蛋含有丰富的蛋白、脂肪和磷脂(包括卵磷脂、脑磷脂和神经磷脂)，如果沉淀蛋白质后直接上机，会污染色谱柱和离子源，影响色谱柱的寿命，增加仪器维护成本。本发明考察了Sep-Pak C18固相萃取柱(500mg，3mL)、QASIS HLB固相萃取柱(60mg，3mL)、QASIS PRiME HLB固相萃取柱(60mg，3mL)三种固相萃取柱对鸡蛋中生物素的回收率和基质效应的影响，实验结果见图2。由图2可见，三种固相萃取柱对鸡蛋样品中生物素回收率的影响无明显差异，但是QASIS PRiME HLB的基质效应明显低于Sep-Pak C18和QASIS HLB。

5生物素含量分析

5.1色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)美国Waters公司；流速：0.3mL/min；流动相：0.1％甲酸溶液(A)和乙腈(B)；柱温：40℃；梯度洗脱流程：0～1.0min，97％A；1.0～3.0min，97％A～85％A；3.0～4.5min，85％A；4.5～5.0min，85％A～1％A；5.0～6.0min，1％A；6.0～6.1min，1％A～97％A；6.1～9.0min，97％A。进样量：5μL。

在相同的梯度洗脱条件下，比较了乙腈-0.1％甲酸、乙腈-10mmol/L甲酸铵(含0.1％甲酸)、乙腈-10mmol/L甲酸铵、乙腈-0.1％乙酸、乙腈-10mmol/L乙酸铵(含0.1％乙酸)、乙腈-10mmol/L乙酸铵、甲醇-0.1％甲酸对目标物分离效果、灵敏度、峰形的影响。实验表明，甲酸铵和乙酸铵保留较弱，乙酸和乙酸铵(含0.1％乙酸)响应值低，甲醇-0.1％甲酸响应值低且分离效果不好，甲酸和甲酸铵(含0.1％甲酸)响应值、分离和峰形无明显差异。所以实验选择乙腈-0.1％甲酸为流动相。

5.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；离子化模式：正离子模式(ESI+)；毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：30V；脱溶剂气温度450℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气流速：850L/h：锥孔反吹气流速：150L/h；碰撞气流速：0.12mL/min；采集模式：多反应监测(MRM)。

生物素采用电喷雾电离源正离子扫描模式，将浓度为100ng/mL的D-生物素和生物素-d2标准溶液标准溶液，分别通过蠕动泵注入质谱仪，调谐并优化锥孔电压、碰撞能量等参数，最终确定D-生物素和生物素-d2的定性定量离子对，具体质谱参数见表1。

表1生物素的质谱参数

注：*为定量离子

5.3生物素含量检测

将配制的标准系列工作液按浓度由低到高依次注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得标准系列工作液的色谱图。根据标准工作液的色谱图中，生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值以及生物素浓度，建立生物素标准曲线，以生物素质量浓度(X，ng/mL)为横坐标，生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积即D-生物素与生物素-d2峰面积之比(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，在0.5～25ng/mL范围内，线性回归方程为Y＝1.04308x+0.0133202，R2＝0.9975，线性关系良好。

按本方法样品前处理方法处理后，吸取鸡蛋样品待测液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得鸡蛋样品待测液的色谱图。将鸡蛋样品待测液的色谱图中生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值，代入生物素标准曲线中，得到鸡蛋样品中生物素含量。

采用上述方法对市场上购买的41批次鸡蛋样品进行分析，样品涉及柴鸡蛋、山鸡蛋、笨鸡蛋、草鸡蛋等土鸡蛋23批次和普通鸡蛋18批次，结果见表2。结果表明，鸡蛋中均含有生物素，含量为18.9μg/100g～43.2μg/100g；且土鸡蛋和普通鸡蛋中生物素含量没有明显差异。

表2鸡蛋中的生物素含量(n＝3)

按本方法样品前处理方法处理后，测试鸡蛋样品待测液的信噪比，分别确定检出限和定量限。以信噪比S/N≥3得到目标物的检出限(LOD)，以信噪比S/N≥10得到目标物的定量限(LOQ)。生物素的LOD为0.75μg/100g，LOQ为2.5μg/100g。标准溶液及鸡蛋样品的色谱图见图3。

6基质效应评价

分别测定添加同水平同位素内标的纯溶剂与鸡蛋样品待测液中的峰面积响应值，计算二者的相对比值来评价基质效应(Matrix effect)。Matrix effect factor(MEF,％)＝(A-B)/A×100，其中MEF为基质效应因子，A为纯溶剂中内标物质的峰面积响应值，B为鸡蛋样品待测液中内标物质的峰面积响应值。MEF为0表示无基质效应，绝对值越大基质效应越强，在-15％～15％之间，表示基质效应影响不明显。

由于鸡蛋中含有生物素没有空白样品，无法使用基质标的方法定量。在液相色谱串联质谱中同位素内标的引入可以有效抵消基质影响和前处理操作损失，提高分析方法的准确性及稳定性，因此本方法采用同位素稀释质谱法来消除基质干扰实现准确定量。实验采用稳定同位素来评价基质效应，这种评价方式更适合于内源性物质。研究发现，采用本方法对鸡蛋样品进行检测时，基质效应均在-15.0％～15.0％之间，基质效应影响较小，表明净方法化效果良好。

7回收率和精密度

选取三个生物素本底含量不同的鸡蛋样品，分别添加3个水平的标准溶液，每个水平平行测定6次，得到方法的回收率及精密度，见表3。结果显示，3个水平的加标回收率在95.8％～110.8％之间，相对标准偏差在1.59％～4.62％之间。

表3方法的回收率和精密度(n＝6)

综上本发明提供的一种鸡蛋中生物素含量的测定方法，建立了同位素稀释超高液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中生物素含量的分析方法。样品采用0.1mol/L H₂SO₄ 121℃水解30min提取后，QASIS PRiME HLB固相萃取柱净化，经超高效液相色谱分离，以0.1％甲酸溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，三重四极杆质谱电喷雾电离(ESI+)检测，多反应监测模式(MRM)，内标法定量。生物素在0.5～25ng/mL范围内线性关系良好，相关系数(R²)为0.9975。在高、中、低3个加标水平的回收率在95.8％～110.8％之间，相对标准偏差范围小于4.62％。方法检出限(S/N≥3)为0.75μg/100g，定量限(S/N≥10)为2.5μg/100g。该方法简单、快速、灵敏、重现性好，可为鸡蛋中生物素的含量水平测定和研究提供技术支持。

以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

Claims (4)

1.一种鸡蛋中生物素含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别以生物素标准品和生物素同位素标准品配制生物素标准储备液和生物素同位素标准储备液；用甲醇水溶液分别对生物素标准储备液和生物素同位素标准储备液稀释，得到生物素标准中间液和生物素同位素标准中间液；

(2)分别取不同体积的生物素标准中间液，各加入相同体积的生物素同位素标准中间液，以初始流动相定容，得到标准系列工作液；

(3)称取一定质量的鸡蛋试样于容量瓶中，加入生物素同位素标准中间液后，再加入硫酸溶液充分摇匀，高温加热充分水解，冷却至室温，用水定容，摇匀，经滤纸过滤，得到鸡蛋样品提取液；

(4)将固相萃取柱连接到固相萃取装置上，取鸡蛋样品提取液上样，先用水和5％甲醇溶液淋洗，再用乙腈-甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮吹至近干，用初始流动相复溶，经有机相微孔滤膜过滤后，得到鸡蛋样品待测液；

(5)分别吸取标准系列工作液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得标准系列工作液的色谱图；根据标准系列工作液的色谱图中，生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值以及生物素浓度，建立生物素标准曲线；

(6)吸取鸡蛋样品待测液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得鸡蛋样品色谱图；将鸡蛋样品色谱图中生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值，代入生物素标准曲线中，得到鸡蛋样品中生物素含量；

所述步骤(4)中，所述固相萃取柱为QASIS PRiME HLB固相萃取柱。

2.根据权利要求1所述的鸡蛋中生物素含量的测定方法，其特征在于，超高效液相色谱质谱联用仪的色谱条件如下：

色谱柱：C18液相色谱柱，其柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒度1.7μm；

柱温：40℃；

进样量：5μL；

流动相：0.1％甲酸溶液和乙腈；

流速：0.3mL/min。

3.根据权利要求1所述的鸡蛋中生物素含量的测定方法，其特征在于，超高效液相色谱质谱联用仪的质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式；毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：30V；脱溶剂气温度450℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气流速：850L/h：锥孔反吹气流速：150L/h；碰撞气流速：0.12mL/min；采集模式：多反应监测。

4.根据权利要求1所述的鸡蛋中生物素含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，硫酸的浓度为0.1mol/L，水解温度为121℃，水解时间为30min。

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