CN108414661B - 一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法 - Google Patents

一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法 Download PDF

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Abstract

一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱‑质谱方法，该方法包括如下步骤：（1）检测条件；（2）样品处理；（3）图谱分析；(4)标准血氨样品的制备；（5）含量计算。本方法通过柱前衍生化气相色谱‑质谱联用法，能够有针对性的检测出生物样品中的氨含量，是临床检验血氨光谱法的补充，可以有效降低检血凝固状况和溶血对检测结果的影响。提高了检测的灵敏度，同时大大简化了检测步骤，节省了时间和成本。

Description

一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法
技术领域
本发明属于生物材料检测领域，具体涉及一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法。
背景技术
以血氨(Blood ammonia，BAN)为代表的生物样品中的氨是非蛋白氮重要的化学表现形式。血氨的来源包括内源性：体内代谢产生的氨称为内源性氨，主要来自氨基酸的脱氨基作用；部分来自肾小管上皮细胞中谷氨酰胺分解产生的氨；胺类的分解也可产生氨；服用胺类药物。外源性：由消化道吸收人体内的氨称为外源性氨，如肠道内未被消化的蛋白质和未被吸收的氨基酸，经肠道细菌作用产生的氨；血中尿素扩散到肠道，经细菌尿素酶作用水解生成的氨。
氨是有毒物质，人体内的氨通过以下途径解毒:①肝内经鸟氨酸循环合成尿素，经肾脏排出体外；②转变为氨基酸上的氨基；③在肾脏泌氨中与肾小管腔中的H+形成铵盐，随尿排出体外。肝脏将氨合成尿素，是保证血氨正常的关键。当肝脏功能严重损伤时，氨不能被解毒，在中枢神经系统聚集，会引起肝性脑病。
现在普遍采用的临床检验血氨的方法为酶法。利用酶反应中NH4 +与NADPH的等摩尔消耗关系。用分光光度计波长340nm，监测吸光度下降速率，即NADPH消耗速率，与标准管比较，可计算出血浆氨含量。这是一种间接的测定方法，且受到光谱测定法固有局限性的干扰。在溶血的情况下，不能准确测定。同时血浆中LDH、AST等也能利用NADPH，影响血浆氨测定结果的准确性。干扰因素较多。
血氨和尿氨是临床评价非蛋白氮的重要指标之一。人的血氨浓度的正常值范围比尿素氮(尿素)低的多，为18-72μmol/L。换算成法医毒物分析常用质量单位为306-1224ng/ml，上限即约为1.22μg/ml。肝昏迷患者的血氨值会大幅度突破上限。申请人在严重肝病死者的血中检出了20μg/ml以上的氨。
因此，研制开发一种可快速准确的检测生物样品中氨的方法一直是亟待解决的新课题。
发明内容
本发明提供一种准确的检测生物样品中氨的方法，通过柱前衍生化气相色谱-质谱联用法，能够有针对性的检测出生物样品中的氨含量，而不是间接的检测，可排除许多外界因素的干扰，提高了检测的灵敏度，同时大大简化了检测步骤，节省了时间和成本。
本发明的目的是这样实现的：一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法，该方法包括如下步骤：
(1)检测条件：
气质联用仪：采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)；
色谱柱：HP-5ms毛细管柱，规格：30m×0.25mm，0.25μm；
电子离子轰击源(EI源，70eV)，全离子扫描，扫描质量范围为40amu～600amu；
载气为高纯氦气(99.9％)，流速1.0ml/min；
升温程序：初始柱温为60℃，保持1min，以15℃/min升温至180℃,保持8min，再以30℃/min升温至260℃,进样口温度为265℃，离子源温度为230℃；
(2)样品处理：
精密称取生物样品0.5g于10ml规格的试管内，加入1M NaOH(pH＝14)溶液0.5ml，加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl，漩涡震荡30s后，微波1min，加入乙酸乙酯2.0ml震荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析；
(3)图谱分析：
衍生化产物七氟丁酰胺，保留时间3.25min，特征质量数为m/z 166(分子离子峰)、m/z194、m/z 214、m/z 146、m/z 100、m/z 69和m/z 44(基峰)；
(4)标准血氨样品的制备：
稀释标准氨溶液浓度(500μg/ml)，用去氨蒸馏水定容于100ml规格容量瓶中。分别向0.5ml正常人新鲜静脉血中添加不同浓度的氨标准液，制作成质量浓度分别为1、10、50、100和200μg/ml的标准工作曲线样品溶液。
(5)含量计算：
将步骤(4)中制成的标准工作曲线样品溶液按照步骤(2)中样品处理的方法进行处理后进样分析。选择检测m/z166的选择离子色谱图，以衍生化产物七氟丁酰胺的峰面积为纵坐标，以血中添加氨的质量浓度为横坐标，计算回归方程得到y＝82 815x+63 766，R2＝0.9 877。计算含量时，将待测样品中七氟丁酰胺的峰面积代入回归方程即得到待测样品含量。
该检测方法所使用的生物材料为尿液、胃内容物或血浆样品。
该方法的最低检出限以S/N＝3进行计算，对于血氨的最低检出限为0.2μg/ml，定量限为1.0μg/ml。
与现有技术相比，具有如下有益效果。
1、检测原理为直接测定生物样品中的氨，而非间接测定。
2、采用的是衍生化后的质谱法，而非传统的光谱法。可将血液凝固状态、溶血、试剂干扰等一些外界影响因素有效降低。
3、所用到的试剂种类更少，操作简单快速。
4、可检测的生物材料包括尿液、胃内容物或血浆样品。
附图说明
图1血氨衍生化反应示意图。
图2衍生化产物七氟丁酰胺典型质谱图。
图3衍生化产物七氟丁酰胺典型色谱图。
图4空白血加氨标准曲线。
具体实施方式
实施例1衍生化反应相关条件的优化。
1.对衍生化反应pH值的考察：
酰氯和胺(氨)反应生成酰胺，需要在碱性条件下进行，产物中生成氯化氢，加入缚酸剂可提高反应效率，本研究对pH＝9以上的碱性条件进行考察。认为一个较强的碱性条件有助于产物的稳定。
实验过程如下：
精密称取0.5ml全血于10ml规格的试管内，分别加入pH为9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0的硼酸缓冲溶液(用NaOH调节缓冲液的pH值)0.5ml。加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl。漩涡振荡30s后，微波1min。加入乙酸乙酯2.0ml振荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析，结果见表1。
表1不同碱性条件下衍生化反应进行程度
Figure BDA0001595437280000051
结果表明：随着反应溶液pH值的增加，反应产物生成量增加。这可能是由于强碱性溶液中的OH-能够与反应产生的HCl中和，促进反应向正向进行从而使反应产率增加。
2.对衍生化振荡时间的考察实验过程如下：
精密称取0.5ml全血于10ml规格的试管内，加入1M NaOH溶液0.5ml。加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl。分别漩涡振荡反应30s、1min、5min、10min、20min后，微波1min。加入乙酸乙酯2.0ml振荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析，结果见表2。
表2振荡时间对衍生化程度的影响
Figure BDA0001595437280000052
结果表明：衍生化反应通常预留出一定的反应时间，加入衍生化试剂后随即进行下一步操作的情况并不多见。申请人对20min以内的衍生化时间进程进行了考察，并没发现产率的明显提高。申请人默认为衍生化反应是瞬间完成的，因此申请人将反应的时间设定为30s。
3.对衍生化反应温度的考察实验过程如下：
精密称取0.5ml全血于10ml规格的试管内，加入1M NaOH溶液0.5ml。加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl。分别于20℃、30℃、40℃、50℃条件下漩涡振荡反应30s后，微波1min。加入乙酸乙酯2.0ml振荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析，结果见表3。
表3反应温度对衍生化程度的影响
Figure BDA0001595437280000061
结果表明：反应温度对衍生化反应的影响微弱，为了简化实验过程，申请人将反应温度设定为室温25℃。
4.对微波反应时间的考察实验过程如下：
精密称取0.5ml全血于10ml规格的试管内，加入1M NaOH溶液0.5ml。加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl。分别漩涡振荡反应30s后，分别微波反应1min、2min、3min。加入乙酸乙酯2.0ml振荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析，结果见表4。
表4微波反应时间对衍生化程度的影响
Figure BDA0001595437280000062
结果表明：微波反应时间的延长并没有使衍生化产物的量升高，表明衍生化反应已经进行完全，申请人从缩短反应过程和节约能源的角度考虑，将微波反应时间设定为1min。
5.提取溶剂的选择最近些年一直在加强绿色化学的理念。过去大量使用的苯类和烷烃类的高挥发不溶于水的高毒有机提取溶剂逐渐淡出实验室，转而应用少量的酯类有机溶剂完成提取。在非衍生化的毒物筛查提取的场合，无毒的乙酸乙酯提取逐渐占据主导地位。氨或七氟丁酰胺理论上可以与乙酸乙酯发生氨解反应生成乙酰胺。但有七氟丁酰氯存在的条件下，此反应可忽略不计。综合分析，仍然沿用常见毒物筛查的场合使用的乙酸乙酯作为提取溶剂。
6.衍生化试剂的选择
GC-MS常用的柱前衍生化方法包括硅烷化衍生化、酯化衍生化、酰化衍生化等。其中硅烷化衍生化可用于分析羟基、羧酸、硫醇和胺类物质，但通常需要在非质子性溶剂如二甲基亚砜和四氢呋喃等溶剂中才能进行，不适用于直接检测生物样品中的氨。
酯化衍生化是基于在催化条件下醇与酸的缩合反应，一般用来调整酸类目标分析物的挥发性和极性以及柱保留行为。
酰化能降低羟基、氨基、巯基的极性，改善这些化合物的色谱性能(减少峰的拖尾)，并能提高这些化合物的挥发性，也能增加某些易氧化化合物(如儿茶酚胺)的稳定性。当酰化时引入含有卤离子的酰基时，还可提高使用电子捕获检测器(ECD)的灵敏度。
酰化反应通常在非水介质中进行，但胺类和酚类化合物乙酰化时可在水溶液中进行。根据本发明检验生物样品中氨的特点，属于在水溶液中直接进行的反应，采用七氟丁酰氯这种酰化试剂能够很好的适应这一反应特点，且在碱性条件下，反应时间短，产率高。适用于生物样品中氨含量的快速分析检测。
实施例2
一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法，包括如下步骤：(1)检测条件：
气质联用仪：采用7890B-5977A气质联用仪；
色谱柱：HP-5ms毛细管柱，规格：30m×0.25mm，0.25μm；
电子离子轰击源(EI源，70eV)，全离子扫描，扫描质量范围为40amu～600amu；
载气为高纯氦气(99.9％)，流速1.0ml/min；
升温程序:初始柱温为60℃，保持1min，以15℃/min升温至180℃,保持8min，再以30℃/min升温至260℃,进样口温度为265℃，离子源温度为230℃。
(2)样品处理：
精密称取肝病死者全血0.5g于10ml规格的试管内，加入1M NaOH(PH＝14)溶液0.5ml，加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl。漩涡震荡30s后，微波1min。加入乙酸乙酯2.0ml震荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析。
(3)图谱分析：
衍生化产物七氟丁酰胺，保留时间3.25min，特征质量数为m/z 214(分子离子峰)、m/z194、m/z 166、m/z 146、m/z 100、m/z 69和m/z 44(基峰)，分别如图2和图3所示；
(4)标准血氨样品的制备：
稀释标准氨溶液浓度(500μg/ml)，用去氨蒸馏水定容于100ml规格容量瓶中。分别向0.5ml正常人新鲜静脉血中添加不同浓度的氨标准液，制作成质量浓度分别为1、10、50、100和200μg/ml的标准工作曲线样品溶液。
(5)含量计算：
将步骤(4)中制成的标准工作曲线样品溶液按照步骤(2)中样品处理的方法进行处理后进样分析。选择检测m/z166的选择离子色谱图，以衍生化产物七氟丁酰胺的峰面积为纵坐标，以血中添加氨的质量浓度为横坐标，计算回归方程得到y＝82 815x+63 766，R2＝0.9 877。计算含量时，将待测样品中七氟丁酰胺的峰面积代入回归方程即得到待测样品含量。
经检测，样品衍生化产物七氟丁酰胺的峰面积为1709635，带入回归方程，计算出肝病死者的血中检出的氨含量为21.4μg/ml。
实施例3
精密称取肝病死者尿液0.5g，其余条件不变，经计算，尿液的氨含量为5.2μg/ml。
实施例4
精密称取肝病死者胃内容物0.5g，其余条件不变，经计算，胃内容物的氨含量为8.7μg/ml。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
检测条件：
气质联用仪：采用气相色谱-质谱联用仪；
色谱柱：HP-5ms毛细管柱，规格：30 m×0.25 mm，0.25 μm；
电子离子轰击源，70 eV，全离子扫描，扫描质量范围为40 amu～600 amu；
载气为高纯氦气，纯度为99.9%，流速1.0 ml/min；
升温程序：初始柱温为60 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升温至180℃，保持8 min，再以30 ℃/min升温至260 ℃，进样口温度为265 ℃，离子源温度为230 ℃；
（2）样品处理：
精密称取生物样品0.5 g于10 ml规格的试管内，加入pH=14浓度为1M NaOH溶液0.5ml，加入七氟丁酰氯衍生化试剂10 µl，漩涡震荡30s后，微波1min，加入乙酸乙酯2.0 ml震荡1 min，3500转离心10 min，用移液器取出1.5 ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1 ml体积后进样GC-MS检测分析；
(3) 图谱分析：
衍生化产物七氟丁酰胺，保留时间3.25 min，特征质量数为m/z 214、m/z 166、m/z194、m/z 146 、m/z 100、 m/z 69 和m/z 44，其中m/z 214为分子离子峰，m/z 44为基峰；
（4）标准血氨样品的制备：
稀释标准氨溶液浓度500 µg/ml，用去氨蒸馏水定容于100 ml规格容量瓶中，分别向0.5ml正常人新鲜静脉血中添加不同浓度的氨标准液，制作成质量浓度分别为1、10、50、100和200 µg/ml的标准工作曲线样品溶液；
（5）含量计算：
将步骤（4）中制成的标准工作曲线样品溶液按照步骤（2）中样品处理的方法进行处理后进样分析，选择检测m/z166的选择离子色谱图，以衍生化产物七氟丁酰胺的峰面积为纵坐标，以血中添加氨的质量浓度为横坐标，计算回归方程得到 y = 82 815x + 63 766，R2=0.9 877，计算含量时，将待测样品中七氟丁酰胺的峰面积代入回归方程即得到待测样品含量。
2.根据权利要求1所述的一种生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法，其特征在于：所述的生物样本为尿液、胃内容物或血浆样品。
3.根据权利要求1所述的一种生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法，其特征在于：该方法的最低检出限以S/N=3进行计算，对于血氨的最低检出限为0.2 µg/ml，定量限为1.0 µg/ml。
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