CN103439444A

CN103439444A - 检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法

Info

Publication number: CN103439444A
Application number: CN2013104089429A
Authority: CN
Inventors: 黄凯; 司红彬; 杨淇龄; 程远; 黄秀芸
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2013-12-11

Abstract

本发明公开了一种检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，采用具有强紫外吸收的对溴苯乙酰基溴(p-BPB)衍生化试剂与肉碱经柱前衍生化反应来减小极性，增加紫外吸收，提高方法检测的灵敏度，结合正相高效液相色谱分离检测。本发明为肉碱在水产品中的检测及其在水生动物体内的药代动力学研究提供了可靠的分析方法，为水产业合理用药提供了基础理论依据。总之，本发明对水产品中该类化合物的含量分析及食品营养及安全的评定有着重要的、深远的意义，同时也是其研究开发的必备前提和条件。

Description

检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法

技术领域

本发明属于肉碱含量检测技术领域，尤其涉及一种检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法。

背景技术

大量研究表明，L-肉碱使用方便，在饲料中添加Ｌ-肉碱具有提高水产动物生长、抗脂肪肝、提高鱼肉品质、减轻杀虫剂、药物、氨等毒性物质对水产动物的毒害作用等效果，其作为一种新型的饲料添加剂被重视起来，并在医药和食品行业也进行了相关的研究利用。

L-肉碱的价格较高，若使用量过多，经济上不划算，但若使用量过小，则达不到理想效果。因此，需要根据动物的种类、生长阶段，饲粮中粗蛋白质、脂肪水平及赖氨酸与蛋氨酸含量添加期等确定L-肉碱的使用剂量，才能有效保证一定的作用效果而又节约成本。根据大量的研究表明，猪的最适添加量30-500mg/kg饲料，鸡添加量为50-150mg/kg饲料，水产动物建议用量在100-400mg/kg饲料。L-肉碱添加量在实际生产应用中，尚可适当调整。

在研究中，肉碱具有含量较少，微生物发酵法产生量低的特点，因此，其检测要求较高，测定困难。真正意义上进行肉碱测定是从本世纪60年代开始的，由Morquis和Fritz提出酶法测定理论，在此以后在其基础上建立了多种测定方法（如色谱法、生物法、化学比色法、光谱法、质谱法），用以确定食物和组织内肉碱的含量。目前荧光检测器和质谱检测器较为昂贵，大多数实验室尚不具备其实验条件，而高效液相色谱早已普及，若能建立相应有效的方法将十分有益。然而，L-肉碱极性大，只有末端紫外吸收等结构特点，给直接分析带来一定困难。

衍生化是一种利用化学变换，将化合物转化成类似该化学结构的物质，例如当检测物质由于无紫外吸收等原因不容易被检测时，可以将其进行衍生化，如加上生色团等，使其生成可被检测的物质。根据所用的衍生化试剂，柱前衍生化高效液相色谱测定法有两种：(1)柱前紫外衍生高效液相色谱法：对溴苯乙酰基溴(p-BPB)是该法最常选用的衍生化试剂，其在波长260nm处有强的紫外吸收，价格便宜且易于购得，Poorthuis等用该方法检测了患有先天性代谢缺陷病的病人尿液中肉碱含量，但根据进一步的研究发现，衍生化试剂p-BPB与肉碱的衍生反应生成的衍生产物含量很低，而且含有较多杂质，难以达到血样检测的要求。Minkler P等为了加快肉碱与衍生化试剂的反应，在二异丙基乙胺的催化作用下选用对溴苯乙酰基三氟甲磺酸盐作为衍生化试剂，约10min便可与肉碱衍生化完全，但缺点是对溴苯乙酰基三氟甲磺酸盐价格昂贵、难以提纯和购得，而且该法测定回收率多低于80％。2002年，Rosenthal报道了采用四丁基氢氧化铵为催化剂，p-BPB与肉碱可获得高反应产率的衍生化物，该法适用于测定血中游离和总肉毒碱含量，回收率为97％，其在一定程度上改进了p-BPB肉碱衍生法，但样品反应时间比较长，需经振摇、离心、加热等反应步骤，至少需3h以上才能完成一次样品预处理。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确快速、灵敏度高、重现性好的检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，为水产品中该类化合物的含量分析、食品营养及安全的评定提供可靠的技术手段。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，先用对溴苯乙酰基溴衍生化试剂与样品肉碱进行柱前衍生化反应，然后采用正相高效液相色谱分离检测。

上述检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，包括以下步骤：取鱼类血浆样品300μl，加1mL蛋白沉淀剂，混均后，加入400mg无水磷酸氢二钠和氧化银的混合物及400mg无水磷酸二氢钾，漩涡振荡仪上漩涡振荡5min，8000r/min离心5min，吸取上清液600μL再加入衍生化试剂50μL混均后，70℃水浴90min；冷却后进样20μL作HPLC分析。

蛋白沉淀剂是体积比9∶1的乙腈和甲醇混合液。

无水磷酸氢二钠和氧化银的混合物中磷酸二氢钠和氧化银质量比为9∶1。

衍生化试剂按以下配制：称取40mg p-BPB于试管中，加入1mL乙腈溶解后，再加入100μL 10%四丁基氢氧化铵混匀即可。

HPLC分析色谱条件为：Kromasil Sil色谱柱，规格250mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈-柠檬酸缓冲液，体积比90∶10，每1000mL流动相中加入0.25mL三乙胺,使用前以0.45μm滤膜减压过滤；流速1.2ml/min；柱温35℃；检测波长260nm；进样量20μl。

柠檬酸缓冲液按以下配制：称取1.89g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)溶于约400mL水中，溶解混匀后以水稀释至500mL。

鱼类包括罗非鱼。

针对目前缺乏简单可靠有效的水产品肉碱含量的检测方法，发明人建立了柱前紫外衍生正相高效液相色谱法检测L-肉碱。由于肉碱极性强、紫外吸收弱，本发明根据其理化性质，采用具有强紫外吸收的对溴苯乙酰基溴(p-BPB)衍生化试剂与肉碱经柱前衍生化反应来减小极性，增加紫外吸收，提高方法检测的灵敏度，并结合正相色谱分离技术，完成了本发明。此外，发明人从专属性、重复性、标准曲线和精密度等角度验证了该分析方法的可行性。方法学上考察结果表明，该方法专属性高，具有较好的重复性，且线性关系、精密度均达到要求，可将其作为检测L-肉碱的分析方法。

发明人比较研究不同剂量的肉碱在罗非鱼体内及相同剂量在不同规格罗非鱼体内的药物代谢动力学模型及特征参数(达峰时间、达峰浓度、曲线下面积、消除半衰期等)，从而为肉碱在水产品中的检测及其在水生动物体内的药代动力学研究提供可靠的分析方法，为水产业合理用药提供基础理论依据。总之，本发明对水产品中该类化合物的含量分析及食品营养及安全的评定有着重要的、深远的意义，同时也是其研究开发的必备前提和条件。

附图说明

图1是不同色谱方法检测肉碱标准品的色谱图，图中：A反相高效液相色谱法，B正相高效液相色谱法。

图2是流动相乙腈比例对肉碱衍生物保留时间的影响曲线图。

图3是流动相柠檬酸比例对肉碱衍生物保留时间的影响曲线图。

图4是流动相三乙胺含量对肉碱衍生物保留时间的影响曲线图。

图5是柱温为25℃时肉碱标准品色谱图。

图6是柱温为30℃时肉碱标准品色谱图。

图7是柱温为35℃时肉碱标准品色谱图。

图8是不同处理方法对肉碱衍生物色谱峰的影响图，图中：A方法1处理，B方法2处理。

图9是肉碱衍生物随衍生温度和衍生时间的改变的变化趋势图，图中：1水浴40度，2水浴50度，3水浴60度，4水浴65度，5水浴70度，6水浴90度。

图10是肉碱标准品色谱图。

图11是罗非鱼血清样品色谱图。

图12是肉碱标准曲线。

具体实施方式

罗非鱼为中小型鱼类，具有食性杂、耐低氧、繁殖强等特点，是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类。因此，本发明以罗非鱼中为对象测定血浆中的肉碱含量，通过考察流动相、柱温对色谱峰的影响和对样品处理方法及衍生化反应的优化等方面，建立了相应的高效液相色谱法。具体研究如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康的吉富罗非鱼，体重（82.71±1.28）g，由广西引育种中心提供。实验期间在水温实验前暂养于室内水泥池一周，24h连续充氧，每天早上9:00，下午17:00定量投喂罗非鱼膨化配合饲料（百洋水产集团股份有限公司）。实验前3d停止投喂饵料，实验在玻璃水族箱(105cm×50cm×60cm)中进行，水温控制在(28±1)℃，pH(6.9±0.1)，持续保持充气状态。

1.2 实验药品与试剂

1.3 实验仪器

UltiMate 3000高效液相色谱系统（包括双泵3200A，手动进样器3200，恒温柱温箱330，可见波长检测器3400RS）（Chromeleon戴安中国有限公司）；

1.4 实验方法

1.4.1 L-肉碱标准样反相高效液相色谱法检测

L-肉碱贮备液：精密称取肉碱标准品16.1mg，10mL双蒸水溶解，配制成10mmol/L的肉碱储备液，4℃保存备用，以此配制肉碱标准溶液。

50μmol/L肉碱工作液的配置：从储备液中移取0.25ml的肉碱储备液到50ml的容量瓶中，加入超纯水到刻度。

（1）标准溶液的配置

衍生化试剂配制：称取40mg p-BPB于试管中，加入1mL乙腈溶解后，再加入50μL 40%四丁基氢氧化铵混匀即可，避光存放并于当天使用。

蛋白沉淀剂：乙腈∶甲醇=9∶1(V/V)。

磷酸二氢钠和氧化银混合物：磷酸二氢钠：氧化银混合物=9∶1(m/m)

（2）色谱条件

色谱柱：Atlantis C18(4.6mm×250mm，5um)；流动相：甲醇-异丙醇(含4mmol／L三乙醇胺，1.6mmol／L柠檬酸)-乙腈，体积为35：45：20；流速1.0ml／min；检测波长260nm；进样量10μl。

(3)标准品的柱前衍生

取肉碱标准品300μl，加入乙腈：甲醇(9：1)1.0ml进行蛋白沉淀。加入400mg的磷酸氢二钠和氧化银混合物(9：1)及400mg磷酸二氢钾，漩涡振荡5min后离心5min，取上清液600μl，加入肉碱衍生化试剂60μl，混合后置于60℃恒温水温箱120min，吸取20μl进样分析。

1.4.2 L-肉碱标准样正相高效液相色谱法检测

（1）溶剂配制

衍生化试剂配制：称取40mg p-BPB于试管中，加入1mL乙腈溶解后，再加入100μL10%四丁基氢氧化铵混匀即可，避光存放并于当天使用。

蛋白沉淀剂：乙腈∶甲醇=9∶1(V/V)。

磷酸二氢钾和氧化银混合物：磷酸二氢钾：氧化银混合物=9∶1(m/m)

柠檬酸缓冲液的配置：称取1.89g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)溶于约400mL水中，溶解混匀后以水稀释至500mL。

（2）色谱条件

色谱柱：Kromasil Sil色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相配制：乙腈-柠檬酸缓冲液(90∶10;V/V)，每1 000mL流动相中加入0.25mL三乙胺，使用前以0.45μm滤膜减压过滤；流速1.2ml/min；柱温：35℃；检测波长260nm；进样量20μl。

（3）样品柱前衍生

取标准品300μl，加1mL蛋白沉淀剂，混均后，加入400mg无水磷酸氢二钠＋氧化银（9∶1）和400mg无水磷酸二氢钾，立即剧烈振摇5min，8 000r/min离心5min，吸取上清液600μL再加入衍生化试剂50μL混均后，60℃水浴90min。冷却后进样20μL作HPLC分析。

1.4.3 两种检测方法进行比较

根据进样后得出的结果对两种方法进行比较，找出较为合适的检测方法。

1.5 衍生化试剂及衍生方法的确定

1.5.1 衍生化试剂的选择

肉碱极性强，紫外吸收弱，无荧光基团，直接测量有一定的难度，需对其进行柱前衍生来减弱肉碱的极性。取50μmol/L的标准品300μl，加1mL蛋白沉淀剂，混均后，加入400mg无水磷酸氢二钠＋氧化银（9∶1）和400mg无水磷酸二氢钾，立即剧烈振摇5min，8000r/min离心5min，吸取上清液600μL用以下配置的衍生化试剂1、2分别进行衍生，60℃水浴90min。冷却后进样20μL作HPLC分析。

（1）衍生化试剂1的配置：称取40mg p-BPB于试管中，加入1mL乙腈溶解后，再加入100μL 10%四丁基氢氧化铵混匀即可，避光存放并于当天使用。

（2）衍生化试剂2的配置：称取40mg p-BPB于试管中，加入1mL乙腈溶解后，再加入50μL40%四丁基氢氧化铵混匀即可，避光存放并于当天使用。

1.5.2 衍生条件的优化

经过比较以上衍生化试剂后选择合适的衍生化试剂进行衍生，在此基础上，对其衍生条件进行优化。水浴温度和时间对衍生效果有着重要的影响，本部分实验重点考察了以p-BPB为衍生化试剂，在相同的反应体系中，衍生温度和衍生时间对肉碱衍生效果的影响。取肉碱储备液各300μL，振荡混匀，衍生后在确定的色谱条件下进样分析，记录色谱图。具体实验设计见下表（表1）。

表1 优化衍生温度及衍生时间的试验设计

试验号	温度(℃)	时间(min)	试验号	温度(℃)	时间(min)
						1．	40	15	16．	65	15
2．	40	30	17．	65	30
						3．	40	60	18．	65	60
4．	40	90	19．	65	90
						5．	40	120	20．	65	120
6．	50	15	21．	70	15
						7．	50	30	22．	70	30
8．	50	60	23．	70	60
						9．	50	90	24．	70	90
10．	50	120	25．	70	120
						11．	60	15	26．	90	15
12．	60	30	27．	90	30
						13．	60	60	28．	90	60
14．	60	90	29．	90	90
						15．	60	120	30．	90	120

1.6 样品的处理方法

配置浓度为50μmol/L的肉碱标准品分别按以下方法处理：

（1）肉碱标准品中移取0.3ml的溶液至离心管，加入乙腈：甲醇（9:1）1ml，混匀后加入400mg的磷酸氢二钠和氧化银混合物（9:1）及400mg的磷酸二氢钾，漩涡振荡5min，离心5min，用移液枪移取上清液900μl，再次加入NaH₂PO₄～Ag₂O(9∶1)混合物及KH₂PO₄各250mg，漩涡振荡2min后静置20min，10 000r/min离心10min。取上清600μL，加入衍生化试剂50μL，混匀后70℃水浴90min，取出流水冷却后吸取20μl按上述色谱条件进样测定。

（2）取标准品储备液300μl，加1mL蛋白沉淀剂，混均后，加入400mg无水磷酸氢二钠＋氧化银（9∶1）和400mg无水磷酸二氢钾，立即剧烈振摇5min，8 000r/min离心5min，吸取上清液600μL再加入衍生化试剂50μL混均后，60℃水浴90min。冷却后进样20μL作HPLC分析。

1.7 标准曲线的制备

吸取适量肉碱储备液，用超纯水稀释至1、5、25、50、100、200、400μmol·L-1即可。按制样方法各步骤进行处理后，进行测定，重复3次。经HPLC分析后得到峰面积与浓度的标准曲线。根据相关系数估计样本中肉碱的定量的线性范围。

1.8 检测限

取罗非鱼空白血浆，按照样品处理程序处理后上机测定。另取多份空白血浆分别加入不同的较低浓度的肉碱标准液，按样品衍生化反应后，上机测定，对比二者，即可得出血浆中肉碱的最低检测限，重复三次。

1.9 回收率与精密度试验

回收率：取混合罗非鱼血桨样品混匀后，平行5次测得其肉毒碱含量。相同的混合鱼血清样品20份，平均分为4组，分别加入肉毒碱标准品配置成1、25、100、200μmol/L溶液，按步骤进行处理方法制样，在相同条件下进行相对回收率测定。相对回收率计算公式为：相对回收率（%）=样品中实测肉碱浓度/样品中实际药物浓度×100%。

精密度试验：

（1）日内精密度：取浓度分别为5μg/mL、100μg/mL、400μg/mL的肉碱标准溶液，按照2.5中的衍生条件进行衍生，在2.4的色谱条件下进样分析，每一浓度每隔1h测定一次，连续测定6次，记录色谱图，根据峰面积计算相对标准偏差。

（2）日间精密度：取浓度分别为5μg/mL、100μg/mL、400μg/mL的肉碱标准溶液；按照2.5中进行衍生，在2.4的色谱条件下进样分析，每一浓度一天测定一次，重复三次，连续测三天，记录色谱图，计算各浓度水平响应值峰面积的变异系数(C.V.%)和总平均变异系数(∑C.V.%)，以此衡量定量方法的精密度。

1.10 样品稳定性

配置浓度为50μmol/L的肉碱标准品，在本实验建立色谱条件下，按样品制备方法制样，将其置于室温下（25-30℃），分别在其衍生反应完成后每隔3个小时测一次，重复三次，连续测定12h以观其稳定性。记录实验结果，计算峰面积相对标准偏差。

2 实验结果

2.1 实验方法的选择

本实验分别采用反相高效液相色谱法和正相高效液相色谱法对L-肉碱进行检测，色谱对比如图1所示。

实验结果表明，两种不同的方法检测L-肉碱，其吸收情况有很大的差异。在反相高效液相色谱体系中，血样中的肉碱组分保留时间很短，并难以与其共存的内源性物质、溶剂分开。而正相柱前衍生高效液相色谱法结合正相色谱的分离机制，色谱峰的相互干扰少，肉碱衍生物的出峰时间约为11.0min，血清中的肉碱共存组分得到很好的分离。因此，本实验选择正相高效液相色谱法较为适宜。

取肉碱储备液各25μL，振荡混匀，经过衍生反应后，以此为分析对象建立高效液相色谱法，并对检测波长、流动相及柱温三方面进行考察和优化。

2.2 检测波长的选择

本实验采用紫外分光光度计将衍生化前及衍生化之后的L-肉碱标准品分别进行光谱扫描，记录实验数据，选出最佳实验检测波长。实验结果显示L-肉碱经过衍生化处理后，在波长260nm处有一强的吸收波，表明衍生化反应可以提高L-肉碱的检测灵敏度。本实验选用260nm作为检测波长。

2.3 流动相的选择

试验考查了不同流动相组成及比例对肉碱衍生物分离情况影响，分别考察流动相乙腈的比例（86%，88%，90%，92%）、柠檬酸缓冲液比例（5%，10%，15%，20%）及每1000ml流动相相中三乙胺的含量（0.10ml、0.20ml、0.25ml、0.30ml及0.35ml）对本实验结果的影响。结果显示，肉碱衍生物随着流动相中乙腈比例的增大保留时间延长（见图2），同时色谱压降低，但乙腈比例过高，色谱峰易变形。在流动相中改变柠檬酸缓冲液的比例可改变肉碱衍生物的出峰时间，随着柠檬酸比例的上升，肉碱的出峰时间提前（见图3），柱压上升，但流动相中柠檬酸的比例对肉碱衍生物的影响不大。在流动相中添加三乙胺可延长肉碱衍生物在色谱柱上的保留时间（见图4），并有效改变肉碱衍生物与其他内存物的分离，峰形也得到改善，但色谱柱压上升，过高的三乙胺会损坏色谱柱。本实验选择的流动相为乙腈-柠檬酸缓冲液(90∶10;V/V)，每1 000mL流动相中加入0.25mL三乙胺。

2.4 柱温的选择

考察了以乙腈-柠檬酸缓冲液(90∶10;V/V)，每1 000mL流动相中加入0.25mL三乙胺为流动相时，将相同浓度的肉碱标准品制样后，在柱温分别为25℃，30℃，35℃时进样，考察其柱温温度变化对衍生后的肉碱衍生物分离效果的影响，实验结果见色谱图5，图6和图7。

实验结果表明，检测柱温的变化对肉碱衍生化合物分离效果没有显著影响，肉碱与内源性物质及溶剂分离良好，且峰型良好。肉碱衍生物的出峰时间随着柱温的升高而保留时间缩短，25℃、30℃、35℃时肉碱保留时间为11.213min、11.113min、11.073min，为缩短分析时间，因此我们选择35℃为检测柱温。

2.5 衍生方法的选择

2.5.1 衍生化试剂的选择

选择合适的衍生化试剂是衍生化的关键。本实验根据肉碱的化学结构及特点，分别使用衍生化试剂1及衍生化试剂2对肉碱衍生效果的影响。实验结果表明，两种衍生化试剂均具有较好的衍生效果，无明显差异，但由于40%四丁基氢氧化铵与10%四丁基氢氧化铵相比，其生产工艺成本高，因此本实验选择10%四丁基氢氧化铵为衍生化试剂。

2.5.2 衍生条件的优化

以对溴苯乙酰基溴(p-BPB)为衍生化试剂，使其与肉碱产生反应生成对紫外线敏感的p-苯酰溴酯化物，同时加入四丁基氢氧化铵，使该反应需要在碱性条件下进行反应。反应过程中起决定性作用的条件有4个：衍生化试剂的浓度、反应体系pH、衍生温度和衍生时间。为了使肉碱与p-BPB衍生化反应完全、稳定，本部分实验重点考察了以对溴苯乙酰基溴(p-BPB)为衍生化试剂，在相同的反应体系中，衍生温度和衍生时间对肉碱衍生化合物色谱峰的影响。实验结果表明：衍生温度和衍生时间的变化对肉碱与对溴苯乙酰基溴(p-BPB)的反应均具有显著的影响，是影响该衍生反应的主要因素。在相同的温度下，衍生产物峰面积随着水浴时间的增多而呈增大的趋势，在相同水浴时间下，肉碱衍生产物峰面积随着水浴温度的上升呈上升的趋势。即肉碱和衍生化试剂的反应与反应温度、反应时间均成正比。根据实验数据以衍生时间为横坐标，衍生产物峰面积为纵坐标作图，如图9所示。

由图9可知，肉碱在水浴温度为65℃的条件下，反应时间为120min时，反应产率达到最高，且无明显增加，稳定性良好；在衍生温度为70℃的条件下，当衍生时间为90min时，反应产率即达到最高，且不再增加，稳定性良好；当水浴温度为90℃时，衍生化反应与水浴时间呈正相关关系，在90min时反应趋于完全，120min处肉碱衍生物的量无明显增加。由此可见，水浴温度70℃与60℃相比，缩短了30min的反应时间；水浴温度70°与90°相比，温度降低了30°，综合分析，选用反应温度70℃，反应时间90min为肉碱的最佳衍生条件。

2.5.3 样品的处理方法

实验结果显示，两种样品处理方法对肉碱标准品色谱峰的影响差异显著，方法2相对于方法1操作更简便，缩短样品处理时间，但两者对肉碱衍生物出峰时间影响较小，另外，相同浓度肉碱标准品，按方法2处理制备样品，肉碱提取量增加，肉碱与衍生化试剂反应更完全，在本实验色谱条件下，肉碱衍生物色谱峰峰形良好，不受其他杂质干扰峰的干扰，峰面积增大。因此，本实验采用方法2来处理样品。两种不同的处理方法制备出的肉碱衍生物色谱图见图8。

2.5.4 方法学上的验证

2.5.4.1 专属性实验

肉碱标准品及罗非鱼血清样品按制样方法各步骤进行处理后，在本实验色谱系统条件下进行测定，肉碱标准品反应产生肉碱衍生物色谱峰保留时间约为11.03min，血清样品肉碱衍生物的保留时间为11.82min。肉碱衍生物在本实验色谱条件下可达到完全分离，且色谱峰对称性良好，无杂峰干扰，与内源性物质分离完全。约15分钟内可完成一次进样分析。肉碱标准品及罗非鱼血清样品色谱图如图10和图11所示。

2.5.4.2 标准曲线与线性范围

肉碱的标准溶液衍生后进样分析。结果表明，在1～400μmol/L浓度范围内，肉碱衍生物色谱峰面积与待测肉碱的浓度呈良好的线性关系。以不同标准溶液的质量浓度(μmoL/L)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，建立回归方程，求得标准曲线回归方程分别为：

肉碱：y=0.08376x+0.09663（n=6，R²=0.9995）

标准曲线如图12所示。

2.5.4.3 最低检测限

配置不同浓度的肉碱样品，测得在本实验色谱条件下肉碱的最低检测限为1μmol/L。

2.5.4.4 精密度

本实验分别考察了高、中、低三种不同浓度的肉碱标准溶液（1、25、100、400μmol/L）衍生后的日内、日间精密度，结果如下表2：

表2 不同浓度肉碱标准品的日内、日间精密度

由实验结果可知，肉碱标准品的日内变异系数在1.79%～5.56%之间，日间变异系数在9.83%～11.81%范围内，即该分析方法日内精密度良好，满足生物样品分析要求。

2.5.4.5 回收率

本实验通过配置低、中、高三种不同浓度（1、25、100、200μmol/L）罗非鱼血清样品测定肉碱回收率。实现结果显示，罗非鱼混合空白血清样品中肉碱含量为(2.10±0.34)μmol/L，本方法测定回收率范围88.16%～101.48%之间，平均回收率为95.83%（见表3）。

表3 不同浓度肉碱的相对回收率

2.5.4.6 样品稳定性

配置浓度为50μmol/L的肉碱标准品，在本实验建立色谱条件下，按样品制备方法制样，将其置于室温下（25-30℃），分别在其衍生反应完成后每隔3个小时测一次，重复三次，连续测定12h以观其稳定性。实验结果表明（表4），肉碱衍生物在反应12h内稳定，12h峰面积变化相对标准偏差（RSD）为8.33%，符合检测要求。

表4 12h内肉碱稳定性的测定

2.6 讨论

2.6.1 衍生化试剂的选择

肉碱的结构式为β-羟-γ-三甲氨基丁酸，由肉碱结构分析可知，肉碱极性较强，通过检测证明反相色谱柱C₁₈对其保留时间很弱，不易于共存物质及溶剂分开；另外，溶剂紫外吸收弱，无荧光基团，给直接检测带来一定的困难。通过加入离子对试剂庚烷磺酸钠溶剂、辛烷磺酸钠溶液可增加L-肉碱在色谱柱中的保留时间，但对色谱柱具有一定的吸附作用，对色谱柱损害较大，不利于色谱柱的使用效率及寿命，另外柱子的平衡和冲洗时间长。本实验采用柱前衍生的方法，通过加入具有强紫外吸收的衍生化试剂，与肉碱反应后生成对紫外吸收敏感的酯化物，从而达到降低肉碱极性，增加其紫外吸收，增长肉碱保留时间的作用。肉碱中具有活性基团羟基及羧基，因此衍生肉碱常用的衍生化试剂有芴甲氧羰酰氯(FMOC)、邻苯二甲醛（OPA）、9-氰酸蒽、L-丙氨酸-β-萘胺(L-Ala-β-NA)、4-溴苯酰三氟甲烷磺胺、对-溴苯乙酰基溴(p-BPB)等。本实验选用对溴苯乙酰基溴（p-BPB），它是一种芳香族衍生化试剂，其与肉碱的羧基发生反应，该反应条件温和，产物稳定，适用范围广泛。本实验考查两种衍生化试剂对肉碱衍生效果的影响，实验结果表明两种不同的衍生化试剂对衍生反应无显著性差异。但10%的四丁基氢化铵相对于40%的四丁基氢化铵加工工艺简单，价格相对较低，本实验选择10%的四丁基氢化铵作为衍生化试剂。王聪等根据肉碱的活性基团-NH₂选择FMOC作为衍生化试剂与肉碱进行柱前衍生，但过量的FMOC及其水解产物会对样品分析造成影响，需在反应结束后加入正乙烷来萃取过量的FMOC。

2.6.2 L-肉碱的检测方法的选择

目前，关于测定血中游离肉碱测定已有大量的文献报道，较为实用的是酶法，放射同位素酶法、质谱法。酶法步骤繁琐，费时较长，且检测结果的准确性受酶活性及共存物干扰等因素影响较大，放射同位素相对于酶法灵敏、敏感度高，但其检测步骤仍然繁琐，测定精密度也较差，而且存在同位素环境污染和对操作者的损伤问题。质谱法精确度好、灵敏度高，但需要昂贵的仪器，操作复杂，无法大规模的推广应用。近年来也有文献报道有关于采用反相色谱测定肉碱，本实验将血清样品用蛋白沉淀剂沉淀蛋白后，加入肉碱衍生化试剂，60℃恒温水浴2h后在色谱柱为C18柱(4.6mm×250mm，5um)，流动相为甲醇、异丙醇、乙腈(甲醇：异丙醇：乙腈=35：45：20，v／v)，流速为1.0ml／min，紫外检测波长为260nm的色谱条件下进样检测。实验结果表明，由于血样中组分复杂，而肉碱极性强，在反相液相色谱体系中，肉碱组分色谱保留时间很短，难以与共存的内源性物质及溶剂峰分离。冯一等人也采用相似的处理方法和色谱条件来测定L-肉碱，肉碱出峰时间约为3min，肉碱分离良好，与本实验的结果差异可能原因为方向色谱柱的不同。通过比较两种反相液相色谱法和正相液相色谱法，实验结果表明正向色谱柱相对于反向色谱柱对肉碱的保留时间延长，出峰时间约为11.1min，肉碱衍生物与其他物质分离完全，峰型良好。孙庆宝等将肉碱衍生化反应后，以Lichrospher SiO₂为固定相，在乙腈-柠檬酸缓冲液为流动相，260nm波长的色谱条件下定量检测兔血清游离肉碱的含量。肉碱衍生物的出峰时间约为12.5min，峰形清晰对称，与样品中其余内源性物质分离完全。但其与本实验比较处理样品时间长，操作相对繁琐。李克等也用相同方法测定人血清中游离肉碱和总肉碱水平，其肉碱保留时间为10.7min，灵敏度、特异性和重复性达到检测要求。丁峰，朱秋毓等用正向HPLC方法测定血液透析患者的血浆游离肉碱，其使用色谱柱为Kromasil Sil柱（150mm×4.6mm，5um)，流动相由20%A和80%B组成，其中A为1.6mmol/L柠檬酸和4mmol/L三乙胺的水溶液，pH6.4；B为含10%异丙醇的甲醇溶液，检测波长260nm，流速0.7ml/min。肉碱的保留时间约为5.4min。

2.6.3 测定血浆样品分析

HPLC法检测在血浆左旋肉碱的应用中，应注意：

1.冻融影响

检测血清中肉碱所要求的变异系数（RSD%）需<10％。本实验的血浆L-肉碱的日内变异系数（RSD%）均<7％，达到了血清检测要求。而日间变异系数（RSD%）>10％，未达到检测要求。本实验血样的保存是采用-20℃冷冻保存的方法，故需在每次测定前解冻，这可能导致本实验的罗非鱼血浆日间变异系数（RSD%）达不到检测标准的原因之一，新鲜血样的精密度较高，建议在进行左旋肉碱浓度的测定尽可能使用新鲜血样。

2.水分影响

肉碱衍生化反应对水分的要求很高，所用试剂需经严格干燥脱水，另外在做加样回收的试验时，血浆中的水分也需去除，否则将影响到衍生化反应的进行，进而影响结果的准确性。

3.时间影响

（1）衍生化反应的时间和温度对本实验的衍生化反应有着一定的影响，为了使肉碱与p-BPB衍生化反应能进行的完全、稳定，本实验为此进行了实验优化设计，分别研究了不同反应时间和不同水浴温度对衍生物色谱峰的影响。实验结果显示，本实验肉碱的最佳衍生化反应的温度是70℃，反应时间是90分钟。(2)本实验所用的有机溶剂均有挥发性，因此整个试验对容器的密封性要求较高，在衍生化反应结束后，样品会随时间变化而浓度变大，故在测定血清中肉碱时，应在衍生化完成后尽快进样检测，防止溶剂挥发。本实验进行了肉碱稳定性测定，实验结果显示12h后浓度开始升高为试剂挥发导致，而12h内稳定较好，变异系数（RSD%）<10，因此，样品的测定应在12h内完成。

4.血浆特性

血浆中存在大量的水分、蛋白、氯离子，这对衍生化的进行有极大的干扰，在样品处理时需将其去除。由于L-肉碱在血浆中以一种与蛋白结合的状态存在，所以需用蛋白沉淀剂将其提取出来，并加入磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)和氧化银(Ag₂O)的混合物将试剂严格地脱水，并清除血浆中对肉碱衍生物干扰较大的氯离子，并方能进行正常的衍生化反应。由于血浆成分复杂，本实验在制样过程中发现样品在解冻离心后出现少量絮状物质，这将影响血样测定的重现性。这也是血浆左旋肉碱精密度测定中日间精密度>10％的原因之一。因此，建议测定肉碱时尽可能用新鲜血浆。

5.混合影响

血浆中的氯离子和水分对实验衍生物的分离度有较大的干扰，故需要将衍生化试剂与肉碱充分的混合使试剂中的银离子能与血浆中的氯离子充分作用达到去除血浆中的氯离子的作用；同时，充分混合可去除血浆中的水分，提高肉碱衍生物的产率。有文献报道在处理样品时通过振摇1h的方法以保证反应能充分完全的反应。本实验则采用在漩涡振荡仪上漩涡振荡5min，实验结果表明这种方法也能达到同样的效果，且缩短了样品的处理时间。

6.回收率

检测要求回收率应到达70％以上，本实验的回收率均到达80％以上，符合检测要求。

本方法所测定罗非鱼血浆中L-肉碱的含量为（2.10±0.34）μmol/L，血透病人在补充肉碱前肉碱水平为（20.55±10.43）μmol/L，测定健康人血浆中肉碱含量为（64.1±11.4）μmol/L，孙庆宝等人测定兔血清中的肉碱含量为（18.17±5.17）μmol/L，与本实验结果有所差别，其原因可能为①所用的仪器及检测方法不同，如测定方法有酶反应法、同位素法、HPLC法、质谱法，且各种仪器的精密度有所不同。②所测对象不同。由于测定对象饮食情况或喂养情况不一致会导致测定结果不一致。

本实验线性范围在1～400μmol/L之间，其浓度信号间的相关性良好，在本实验建立的条件下，血浆中的肉碱与氢氧化四丁胺及p-BPB反应完全生成稳定的酯酰化肉碱衍生化物质，色谱保留时间适中，与其他内源性物质分离良好。同时该方法具有很好的重复性，标准曲线、精密度与回收度均达到满意的结果，适合于批量测定血浆中肉碱含量。为进一步研究肉碱在罗非鱼体内的药代动力学奠定了方法学基础。

Claims

1.一种检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，其特征在于先用对溴苯乙酰基溴衍生化试剂与样品肉碱进行柱前衍生化反应，然后采用正相高效液相色谱分离检测。

2.根据权利要求1所述的检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，其特征在于包括以下步骤：取鱼类血浆样品300μl，加1mL蛋白沉淀剂，混均后，加入400mg无水磷酸氢二钠和氧化银的混合物及400mg无水磷酸二氢钾，漩涡振荡5min，8 000r/min离心5min，吸取上清液600μL再加入衍生化试剂50μL混均后，70℃水浴90min；冷却后进样20μL作HPLC分析。

3.根据权利要求2所述的检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂是体积比9∶1的乙腈和甲醇混合液。

4.根据权利要求2所述的检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，其特征在于：所述无水磷酸氢二钠和氧化银的混合物中磷酸二氢钠和氧化银质量比为9∶1。

5.根据权利要求2所述的检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，其特征在于所述衍生化试剂按以下配制：称取40mg p-BPB于试管中，加入1mL乙腈溶解后，再加入100μL 10%四丁基氢氧化铵混匀即可。

6.根据权利要求2所述的检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，其特征在于所述HPLC分析色谱条件为：Kromasil Sil色谱柱，规格250mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈-柠檬酸缓冲液，体积比90∶10，每1000mL流动相中加入0.25mL三乙胺,使用前以0.45μm滤膜减压过滤；流速1.2ml/min；柱温35℃；检测波长260nm；进样量20μl。

7.根据权利要求6所述的检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，其特征在于：所述柠檬酸缓冲液按以下配制：称取1.89g柠檬酸溶于约400mL水中，溶解混匀后以水稀释至500mL。

8.根据权利要求7所述的检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，其特征在于：所述鱼类包括罗非鱼。