JP2005221425A

JP2005221425A - カルニチン類の測定方法

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Publication number: JP2005221425A
Application number: JP2004030744A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Majima; 康夫間嶋; Yoshinobu Tsuru; 義信鶴; Koreaki Miyawaki; 維章宮脇; Yoshiko Aoki; 美子青木; Kazuo Koyama; 和夫小山
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2005-08-18

Abstract

【課題】ＨＰＬＣによってカルニチンを測定する方法において、カルニチンは逆相の固定相にほとんど保持されないため他の夾雑物との分離が困難で、これを避けるためには煩雑な前処理を行う以外に方法がなかった。
【解決手段】水溶性成分であるカルニチンをＨＰＬＣの固定相に保持させるため、水を主成分とした移動相を用い、このとき水を主成分とした移動相でも保持時間が安定している固定相を用いることで、精度良くカルニチンの定量を行う。更に、分離能が改善されているために、これまで必要であった煩雑な前処理を全く行うことなく定量できる。

Description

本発明は、食品または飲料中に含まれているカルニチン類を簡便に測定する方法に関するものである。

Ｌ−カルニチンの塩酸塩であるＬ−塩化カルニチンは、従来医薬品や医薬部外品の原料として利用されてきたが、胃腸薬内服液や滋養強壮飲料には多様な生薬成分が含まれていることが多く、このような成分による妨害のため定量は非常に困難であった。２００２年１１月の食薬区分改正により、Ｌ−カルニチンは食品としての利用が可能となったことから、食品分野から注目を受けており、メーカーにおける品質検査や衛生研究所における行政検査の需要が高まる時期にあるが、このような測定の問題点は解決していない。

Ｌ−カルニチンの分析方法としては、カンジダ属酵母を用いた微生物定量法（特許文献１参照）や、Ｌ−カルニチン及びＮＡＤにＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼを作用させて生成するホルマザンを測定する方法などが知られている（特許文献２参照）。しかし、微生物定量法や酵素反応を利用するものは、試料の前処理が非常に煩雑である上に、熟練しないと測定者によるばらつきも解消できないという問題がある。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってカルニチンを測定する方法も試みられてきたが、他の夾雑物との分離を行う上で、カルニチンは一般的な逆相の固定相にほとんど保持されないことが問題であった。この問題を解決するため、Ｌ−カルニチンを蛍光ラベル化して測定する方法も知られているが（特許文献３参照）、蛍光ラベル化という前処理は煩雑で、実際の測定にはかなりの欠点があった。

このほかには、胃腸薬内服液や滋養強壮飲料中のＬ−カルニチンの定量方法として、固相抽出カートリッジを使用した前処理によって精製し、ＨＰＬＣによって測定するという方法も報告されているが（非特許文献１、２参照）、これらの方法によっても妨害ピークを完全に除くことができていないため、問題点を解決したとは言えず、Ｌ−カルニチンの分析に適当で簡便且つ精度の高い分析方法は開発されていない。

一方、水溶性化合物を逆相ＨＰＬＣの固定相に保持させて分離するためには、水を主成分とする移動相を用いることが好ましいが、一般的な逆相の固定相に水を主成分とした移動相を用いると、試料を注入してから検出されるまでの保持時間が次第に短くなったり、再現性が得られないという問題が生じる。このような問題を解決するために、固定相の担体表面に残存するシラノール基に炭素鎖の短いアルキル基や親水性の化合物を結合させた固定相や、炭素鎖が２４以上の長いアルキル基を用いた固定相などが開発されている。
特許第２６６１９４５号特許第２８０１６６２号特開２００２−２７７４５２号公報藤田章夫家庭薬研究、７、４０（１９８８）渡辺富士雄衛生化学、３７（１）５３（１９９１）

食品または飲料に含まれるカルニチンが、一般的な逆相系のＨＰＬＣ条件で他の水溶性化合物と容易に分離できない点である。

本発明は、カルニチン類と他の水溶性化合物とを容易に分離するために、水を主成分とした移動相と、それに対応した固定相とを組み合わせて分離することを最も主要な特徴とする。

本発明の測定方法は、水を主成分とする移動相を用いても保持が安定している固定相を用いることで、カルニチン類を固定相に保持させることができるため、他の水溶性化合物と容易に分離ができ、蛍光ラベル化剤を付加したり、固相抽出カートリッジによって精製するなどの煩雑な前処理を全く行うことなく、短時間で精度良くカルニチン類を定量できる。

本発明の目的のひとつに、食品または飲料中のカルニチン類を総量として測定することが挙げられ、この目的においては、試料中のカルニチン誘導体を加水分解処理する必要がある。一方、この加水分解を行わなければ、遊離状態のカルニチンの定量が可能であるし、各種（アシルエステル体）の定量も可能となる。試料の形態は、固体、半固体、液体の何れでもよく、固体及び半固体状であれば、ミキサーなどで粉砕した後に水などを加えて分散または溶液状にすれば良い。

本発明の装置は、移動相を貯めた溶媒槽、ポンプ、インジェクタ、カラム（固定相）、検出器、記録計などを組み合わせて用いることができる。検出器には、例えば紫外検出器が使用できるが、蛍光検出器などほかの検出器を用いることもできる。

固定相は、水を主成分とした移動相でも使用できるように加工されたものであれば良い。固定相の担体に結合したアルキル基の長さは、多様な夾雑物との分離を容易に行うためには、高い分離能を持つ炭素数１８〜４０程度のものが好ましい。１８より炭素数の少ないものを用いると、試料によっては夾雑物に妨害される場合もある。

移動相は、ｐＨ２〜５の緩衝液が好ましいが、ｐＨをこの範囲に限定するものではないし、緩衝作用がなくとも良い。特に、各種のイオンペア試薬を０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む移動相は、カルニチンや夾雑物を固定相に更に効率的に保持させることができるため、多様な夾雑物との分離が可能となり、最も好ましい。また、試験時間短縮などの目的で適宜有機溶媒を混合させることもできる。

移動相に加えるイオンペア試薬としては、ヘキサンスルホン酸塩、オクタンスルホン酸塩、などのアルキルスルホン酸塩や過塩素酸塩などが使用でき、試料に応じてどれを用いても良い。アルキルスルホン酸塩の場合、アルキル基の長いものほど保持時間の増加が期待できるが、アルキル基があまり長いものは低濃度で用いる必要があるため、カラムの安定化に時間がかかることから、ヘプタンスルホン酸塩、オクタンスルホン酸塩が最も好ましい。移動相に含まれるイオンペア試薬の量は、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以下ではカラムの安定化に相当の時間を要するばかりか効果があまり期待できないし、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上用いることは装置への負担や手間が大きいだけで効果の増加はあまり期待できない。

１ｍｇ／ｍＬの濃度のＬ−カルニチン溶液を孔径０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、炭素数３０のアルキル基が置換した固定相である野村化学製ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０−ＵＧ−５（内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍ）を接続したＨＰＬＣ装置（溶媒槽、ポンプ、インジェクタ、カラム、紫外吸収検出器、記録計を接続した装置）に注入し測定した。このときの測定条件は、カラム温度を４０℃、移動相を５０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ２．８）、移動相の流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎ、試料の注入量を２０μＬ、紫外吸収検出器の測定波長を２１０ｎｍとした。

この測定結果（図１）は、全く保持されない成分が現れる約２．３〜２．５分の溶媒ショックと呼ばれるピークと離れてＬ−カルニチンが溶出していることを示しており、有機溶媒を含まない移動相を用いることでＬ−カルニチンを保持、分離できている。同様の装置に水を主成分とした移動相で使用できるような加工がされていない炭素数１８のアルキル基が置換した固定相を接続し、リン酸緩衝液に５％のアセトニトリルを混合させた移動相を用いた場合には、Ｌ−カルニチンは全く保持されなかった。

市販のＬ−カルニチン配合飲料を孔径０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、炭素数３０のアルキル基が置換した固定相である野村化学製ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０−ＵＧ−５（内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍ）を接続したＨＰＬＣ装置に注入し測定した。このときの測定条件は、カラム温度を４０℃、移動相を５ｍｍｏｌ／Ｌの１−オクタンスルホン酸ナトリウムを含有した５０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ２．８）、移動相の流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎ、試料の注入量を２０μＬ、紫外吸収検出器の測定波長を２１０ｎｍとした。

この測定結果を図２に示した。比較例として、同様の条件で１−オクタンスルホン酸ナトリウムを含まない移動相を用いた結果を図３に示した。図２の場合、Ｌ−カルニチンは他の成分と分離しているが、図３の場合には、Ｌ−カルニチンはカラムに保持されていないため、他の夾雑物と重なってしまい、正確な定量ができない

０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のＬ−カルニチン水溶液を孔径０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、炭素数３０のアルキル基が置換した固定相である野村化学製ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０−ＵＧ−５（内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍ）を接続したＨＰＬＣ装置に注入し測定した。このときの測定条件は、カラム温度を４０℃、移動相を５ｍｍｏｌ／Ｌの１−オクタンスルホン酸ナトリウムを含有した５０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ２．８）、移動相の流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎ、試料の注入量を２０μＬ、紫外吸収検出器の測定波長を２１０ｎｍとした。

この測定結果（図４）は、Ｌ−カルニチン溶液の濃度とピーク面積とが相関関係にあることを示しており、定量性の高い測定方法であることがわかる。

Ｌ−カルニチンを含有した飲料Ａ（市販品）にＬ−カルニチン原末を全体に対して２．０ｍｇ／ｍＬとなるように添加したものと、元の含有飲料Ａとを水で希釈し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過して、それぞれ５回ずつ実施例２の方法で測定した。

この測定結果（表１）より、それぞれの繰り返し測定の変動係数は１％以下であり、９９．０％と高い添加回収率であることがわかる。

Ｌ−カルニチンを含有した健康食品Ｂ（市販品）を粉砕後、水を加えてよく振とうして分散させ、遠心分離して上清をとり、これを孔径０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過して試験溶液とした。また、Ｌ−カルニチン含有飲料ＣおよびＤ（いずれも市販品）を、水で希釈し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過して、それぞれ５回ずつ測定した。このときの測定条件は、固定相に炭素数１８のアルキル基が置換したダイソー製ダイソーパックカラムＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＢＰを用い、カラム温度を４０℃、移動相を５ｍｍｏｌ／Ｌの１−ヘプタンスルホン酸ナトリウムを含有した０．１％リン酸溶液（ｐＨ２．０）／メタノール混液（９９：１）、移動相の流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎ、試料の注入量を２０μＬ、紫外吸収検出器の測定波長を２１０ｎｍとした。

この測定結果（表２）より、それぞれの繰り返しの変動係数は１％以下と、試料の形態によらず精度の高い試験であることがわかる。

このように、本発明の測定方法では、液状の試料においては希釈するだけで、固体の試料においても水で分散させるだけの非常に簡単な前処理によって測定が可能となるため、同時に多数の試料を測定することが求められている各種検査機関には大いに役立つものである。

市場に多数存在するカルニチン含有食品または飲料の、メーカーにおける品質検査及び衛生研究所における行政検査に利用できる。

Ｌ−カルニチン溶液をリン酸緩衝液で分析したクロマトグラムである。（実施例１）市販のＬ−カルニチン配合飲料をイオンペア試薬を含むリン酸緩衝液で分析したクロマトグラムである。（実施例２）市販のＬ−カルニチン配合飲料をリン酸緩衝液で分析したクロマトグラムである。Ｌ−カルニチンの定量性を示すグラフである。（実施例３）

Claims

カルニチン類を液体クロマトグラフィーで測定する方法において、水を主成分とした移動相を用い、水を主成分とした移動相で使用できるように加工された固定相を用いることで、簡便に分離測定可能なカルニチン類の測定方法。
水を主成分とした移動相で使用できるように加工された固定相が、炭素数１８〜４０のアルキル基が置換した固定相である、請求項１の測定方法。
水を主成分とした移動相が、水に少なくとも０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのイオンペア試薬を含み、且つ液のｐＨが２〜５の緩衝液である請求項１又は請求項２の測定方法。
液体クロマトグラフィー用の移動相であって、水に少なくとも０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのイオンペア試薬を含み、且つ液のｐＨが２〜５の緩衝液である、カルニチン類測定用の移動相。
カルニチン類を液体クロマトグラフィーで測定する方法において、水を主成分とした移動相を用い、水を主成分とした移動相で使用できるように加工された固定相を用いることで、簡便に分離測定可能なカルニチン類の分析装置。