WO2010043112A1 - 一种用于检测左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的衍生化试剂的制备及其应用 - Google Patents

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carnitine
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compound
formula
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顾书华
李庆宜
王学成
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常州高新技术产业开发区三维工业技术研究所有限公司
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Definitions

  • the present invention relates to the preparation and use of a derivatization reagent for detecting the content of L-carnitine or dextran-carnitine.
  • L-carnitine has a variety of physiological functions, the most basic function of which is to "carry" long-chain fatty acids through the mitochondrial inner membrane and into the mitochondrial matrix for beta oxidation. L-carnitine plays an important role in fatty acid metabolism. Once carnitine synthesis is blocked, carnitine is excreted and degraded, and carnitine transferase is reduced or lost, it will cause disorder of lipid metabolism in the body, affecting energy supply. , leading to many diseases. A typical extraction method for natural L-carnitine is extracted from beef by Cater et al.
  • the natural carnitine is L-carnitine, only L-carnitine is physiologically active, while D-Carnitine is competitive with carnitine acetyltransferase (CAT) and carnitine fatty acyltransferase (PTC). Inhibition, approximately 10% of patients take symptoms of myasthenia gravis after taking the carnitine of the mixed-rotor (Martindale Pharmacopoeia, 33rd edition Pagel356), so accurately determine the right of synthetic L-carnitine The content of the isomer is very important and is related to the safety of human administration.
  • One of the objects of the present invention is to provide a reagent for determining the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) and a preparation method thereof, and the preparation method of the present invention is simple and economical, and is obtained by the preparation method of the present invention.
  • the reagents are stable and easy to use.
  • the second object of the present invention is to provide a raw material for measuring L-carnitine or dextran-carnitine and various pharmaceutical preparations or biological preparations, preserved products and cosmetics containing L-carnitine or/and dextran-carnitine. , human body fluids and various foods in the detection of L-carnitine (or dextrocarnitine) content.
  • the detection method of the invention has high sensitivity and is convenient and quick.
  • the derivatization reagent disclosed in the present invention for detecting L-carnitine (or dextrocarnitine) is an optically active pure compound of the following formula (I):
  • the carbon atom bearing a * in the formula (I) is a chiral carbon atom, and the compound used in the present invention is a single optically active chiral compound which is D type or L type;
  • R represents a straight line having 1 to 6 carbon atoms a chain or branched alkyl group, or an aryl fluorenyl group having 6 to 10 carbon atoms, or a linear or branched alkenyl or alkynyl group having 2 to 6 carbon atoms, or a ring having 3 to 6 carbon atoms Sulfhydryl;
  • X stands for halogen.
  • R represents a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group, a butyl group or a benzyl group; and X represents C1 or Br.
  • the present invention discloses preferably (+) ⁇ -methyl-6-methoxy-2-naphthylacetyl chloride as a derivatization reagent for detecting L-carnitine or dextran-carnitine.
  • the present invention discloses a derivatization reagent for speculating the content of L-carnitine or dextranatin, preferably a solid solution of an optically active pure compound of formula (I), and a solution of any other optically active pure compound of formula (I)
  • a derivatization reagent for speculating the content of L-carnitine or dextranatin preferably a solid solution of an optically active pure compound of formula (I), and a solution of any other optically active pure compound of formula (I)
  • solid crystals are more stable, less prone to decomposition, and easier to store.
  • the invention discloses a method for preparing a solid crystal of the optically active pure compound of formula (I) by recrystallization using a suitable solvent, the solvent is selected from the group consisting of: diethyl ether, propyl ether, tetrahydrofuran, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, propionitrile, Methylene chloride, chloroform, n-hexane, ethyl acetate, or a mixture of any two or more thereof.
  • the present invention discloses optically active pure (I) compound recrystallization solvent, preferably acetonitrile.
  • the invention also discloses using a solution of an optically active pure compound of the formula (I) as a derivatization reagent, which is prepared by dissolving an optically active pure compound of the formula (I) and a solid crystal thereof in a solvent to prepare a solution having a certain concentration, a solvent. It is selected from the group consisting of diethyl ether, propyl ether, tetrahydrofuran, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, propionitrile, ethyl acetate, or a mixture of any two or more thereof, and the solution concentration is 0.01 to 100 ing/ml. In the present invention, acetonitrile is preferably used as a solvent at a concentration of from 1 to 10 mg/ml.
  • (+) or (-) ⁇ -methyl-6-alkoxy-2-naphthylacetic acid is hydrolyzed, and other halogenated hydrocarbons are combined with the phenolic hydroxyl group, and the obtained product is subjected to an acid halide reaction to obtain a crude acid halide product.
  • the present invention discloses a process for preparing a solid crystal of the optically active pure compound of the formula (I):
  • the crude acid halide obtained by reacting the above acid halide is recrystallized using a suitable solvent to obtain a solid crystal.
  • the solvent is selected from the group consisting of diethyl ether, propyl ether, tetrahydrofuran, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, propionitrile, dichloromethane, chloroform, n-hexane, ethyl acetate, or a mixture of any two or more thereof.
  • the present invention discloses an optically active pure compound (I) recrystallization solvent, preferably acetonitrile, to obtain a high purity solid crystal having high optical purity and stable storage.
  • MS molecular weight 248, 250, is the isotope peak of chlorine, m / z 185 is the base peak, abundance is 100%, inferred broken
  • the chip ions are: .
  • the invention discloses a method for detecting the content of L-carnitine or D-carnitine in a sample, the detection method comprising the following steps: (1) Prepare a suitable amount of L-carnitine (or dextrocarnitine) and a racemic carnitine reference solution.
  • the present invention discloses a method for detecting the content of L-carnitine or D-carnitine in a sample, characterized in that the detection method comprises the following steps:
  • (1) preparing a derivatizing reagent the D-form- or L-form compound of the formula (I) according to any one of claims 1 to 5 is dissolved in the solvent described in claim 7 in a dark condition, and is set to a concentration A solution of 0.01 to 100 mg/ml. It is characterized in that the compound of the formula (I) is preferably (+) ⁇ -methyl-6-methoxy-2-naphthaleneacetyl chloride, the solvent is preferably acetonitrile, and the concentration of the solution is preferably 1-10 mg/mlo.
  • the derivatization reagent of the above step (1) is separately contacted with the test solution of the above step (2) and the reference solution for 20 min. ⁇ 180min.
  • test solution Accurately weigh the appropriate amount of the sample, dissolve it with water and dilute it to make a solution containing L-carnitine (or dextrocarnitine) 0. ⁇ g/ml ⁇ 3.0 wg/ml. Test solution.
  • the method for detecting the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) of the present invention is a buffer solution of triethylamine (8 ml of phosphoric acid, 15 ml of triethylamine, 1500 ml of water) and tetrahydrofuran. Mix solution composition.
  • the pH of the triethylamine buffer solution is 2.0 to 9.0.
  • the gradient of the two components is: 0 ⁇ 10min, triethylamine buffer solution 70% ⁇ 90%, tetrahydrofuran 30% ⁇ 10%; 10 ⁇ llmin, triethylamine buffer solution 70% ⁇ 30% ⁇ 90%-30%, Tetrahydrofuran 30% ⁇ 70% ⁇ 10%—70%; ll ⁇ 18min, triethylamine buffer solution 30%, tetrahydrofuran 70%; 18 ⁇ 19min, triethylamine buffer solution 30%—70% ⁇ 30%—90% Tetrahydrofuran 70% ⁇ 30% ⁇ 70% ⁇ 10%; 19 ⁇ 25min, triethylamine buffer solution 70% ⁇ 90%, tetrahydrofuran 30% ⁇ 10%.
  • the method for detecting the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) of the present invention is: accurately weighing the racemic carnitine 2 mg ⁇ 60 mg in a volumetric flask of 100 mL, Add water to dissolve, make up to volume, and then accurately transfer 10ml into a 100ml volumetric flask, add water to volume as a reference solution.
  • concentration of L-carnitine (or dextrocarnitine) was 0.1 u g/ml ⁇ 3.0 w g/ml
  • the recovery was 100.6%.
  • the method for detecting the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) of the present invention wherein the concentration of the derivatizing agent in the above (4) is 0.01 to 100 mg/ml, preferably 1-10 mg/ml, and most preferably 5 mg/ Ml.
  • the method for detecting the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) of the present invention the specific preparation method of the carbonic acid buffer solution in the above (4) is: taking 4.2 g of sodium hydrogencarbonate plus water 900 ml, using 5 mol/L of sodium hydroxide The solution was adjusted to pH 7.0 to 12.0, and water was added to 1000 mL.
  • the amount of the carbonate buffer solution in the above (4) is 5 ⁇ 1 to 500 ⁇ l.
  • the method for detecting the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) of the present invention has a reaction temperature of 20 ° C to 95 in the above (4).
  • C the reaction time is 20min ⁇ 180min.
  • the method for detecting the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) of the present invention the specific preparation method of the acetic acid buffer solution in the above (4) is: taking 3.0 mL of glacial acetic acid and water 900 mL, using a 5 mol/L sodium hydroxide solution Adjust the pH 2.0 ⁇ 7.0 and add water to 1000mL.
  • the invention discloses a derivatization reagent and a detection method of the invention, which are applied to the detection of various pharmaceutical preparations, biological preparations, health products, cosmetics and various foods containing L-carnitine or/and dextran-carnitine.
  • Nitin or / and dextran carnitine content such as: L-carnitine bulk drugs, injections, oral liquids, tablets, slimming capsules, drinks, etc.
  • the present invention discloses a derivatization reagent and a detection method of the present invention, which are useful for detecting the concentration of L-carnitine in mammalian tissues and plasma including various humans.
  • the invention discloses a derivatization reagent and a detection method of the invention, which are suitable for detecting the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) in various edible animal and plant foods. Such as: pigs, cattle, sheep, chicken, shrimp, fish, eggs, vegetables, fruits and other foods.
  • the invention discloses a derivatization reagent and a priming method of the invention, which are suitable for detecting the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) in various animal feeds.
  • the invention discloses a derivatization reagent and a detection method of the invention, which are suitable for detecting the content of L-carnitine (or dextrocarnitine) in various plant nutrients.
  • the present invention discloses a derivatization reagent of the present invention for detecting the optically active pure content of other chiral amino acids. Code description used in this article
  • (+) MNPC (+) ⁇ -methyl-6-methoxy-2-naphthylacetyl chloride
  • (+) ENPC (+) ⁇ -methyl-6-ethoxy-2-naphthylacetyl chloride
  • (+) PNPC (+) ⁇ -methyl-6-isopropoxy-2-naphthylacetyl chloride
  • (+) MNPC ⁇ -methyl-6-methoxy-2-naphthylacetyl chloride
  • MS molecular weight 248, 250, is the isotope peak of chlorine, m / z 185 is the base peak, abundance is 100%, inferred broken
  • the product obtained in the step 2 was made into an acid chloride having a melting point of 91.7 to 92.9 Torr.
  • Step 2 was prepared using 2-bromopropane as a raw material. Melting point: 77.8 ⁇ 79.4 °C ;
  • (+) BUNPC (+) ⁇ -methyl-6-butoxy-2-naphthylacetyl chloride
  • step 2 was prepared using bromo-n-butyl hydrazine as a raw material. Melting point: 56.3 ⁇ 57.3 °C;
  • (+) BNPC (+) ⁇ -methyl-6-benzyloxy-2-naphthylacetyl chloride
  • step 2 was prepared using benzyl bromide as a starting material. Melting point: 77.2 ⁇ 79.1 ⁇ ;
  • the number of theoretical plates was greater than 5000 according to dextran carnitine, and the peak resolutions of L-carnitine and dextrocarbidine were greater than 1.5.
  • 360 nm is used as the emission wavelength.
  • Derivatization reaction Take the reference solution and the test solution for each 30 u 1, respectively, in a 5 ml volumetric flask, add 0.05 mol/L carbonate buffer solution 100 ⁇ l each (take 4.2 g sodium carbonate and water 900 ml, use 5 mol/L sodium hydroxide solution to adjust the pH to 8.4), pyridine acetonitrile solution (containing 25 ⁇ l of pyridine per 1 ml of acetonitrile) 100 ⁇ ⁇ and derivatization reagent solution (0.5% (+) ⁇ -methyl-6 -Methoxy 2-naphthylacetyl chloride acetonitrile solution) 200 ⁇ 1, mixed hook, dense plug, heated in a 40 ° C water bath, sealed for 60 min, immediately after removal with acetic acid buffer (take 3.0 mL glacial acetic acid and water 900 mL) Adjust the pH to 7.0 with 5 mol/L sodium hydroxide solution, add water to 1000 mL), dilute to
  • Determination method respectively, accurately extract the solution of the test sample and the reference product after derivatization, and inject 10 ⁇ into the liquid chromatograph to record the chromatogram; calculate the L-carnitine in the sample by the external standard method. (or dextrocarnitine) content.
  • the compound of the formula (I) is an acid chloride, it is active in nature and easily decomposes in the presence of water. Therefore, it is necessary to find a suitable storage method and conditions of use, including selecting a suitable solvent to ensure the stability of the compound of the formula (I), thereby reducing the measurement error.
  • the solid crystal of the compound of the formula (I) is prepared into a corresponding solution by using diethyl ether, propyl ether, tetrahydrofuran, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, propionitrile, ethyl acetate or the like as a solvent, and is solid with the compound of the formula (I).
  • the crystallization was examined together for stability.
  • MNPC solid crystals have the best stability and are suitable for long-term storage and transportation as derivatization reagents.
  • MNPC acetonitrile solution is the most stable in all solutions.
  • Acetonitrile is suitable as a solvent for derivatization reagents for derivatization reagents and derivatization. Reaction.
  • Example 8
  • the precision reference solution 1, 2 and the test solution were each 30 ⁇ l, respectively, placed in a 5 ml volumetric flask, each adding 0.05 mol/L carbonate buffer solution 100 ⁇ l (take 4.2 g sodium bicarbonate plus water 900 ml, use 5 mol /L sodium hydroxide solution to adjust the pH to 8.4), pyridine acetonitrile solution (containing 25 ⁇ l of pyridine per 1 ml of acetonitrile) 100 ⁇ l and derivatization reagent (0.5% (+) ⁇ -methyl-6-A Ethyl 2-naphthylacetyl chloride acetonitrile solution) 200 ⁇ 1, Mix well, heat tightly, heat in 40 ° C water bath, seal reaction for 60 min, immediately after taking out with acetic acid buffer (take 3.0 mL glacial acetic acid and water 900 mL, use 5 mol / L sodium hydroxide solution to adjust the pH to 7.0, add water to 1000 mL)
  • L-carnitine oral solution Accurately remove L-carnitine oral solution (10ml: lg) lmL in a lOOmL volumetric flask, add water to volume, then accurately transfer 1ml in a 100ml volumetric flask, add water to volume, and then accurately transfer 10ml in a 100ml volumetric flask In, add water to volume, as a test solution.
  • Pretreatment of plasma test solution Pipette plasma (purchased at blood station) 100 ⁇ , add 400 ⁇ l of acetonitrile containing 10% methanol, shake well, shake on a vortex mixer for 5 min, centrifuge at 10000 r.min-l for 10 min, take The supernatant is the test solution.
  • Reference solution Accurately weighed 35mg of spinocaine in a volumetric flask of lOOmL, dissolved in water, and set to volume. Then carefully transfer 1ml into a 100ml volumetric flask and add water to volume.
  • the concentration of free carnitine in human plasma measured by the method used in Example 9 is shown in Table 13.
  • Meat sample pretreatment firstly pulverize the fresh meat, weigh 2g of the pulverized sample, add 25ml of acetonitrile containing 10% methanol, homogenize for 5min, sonicate for 30min, centrifuge 10000r.min-l for lOmin, transfer the supernatant, The residue was mixed with 25 ml of acetonitrile containing 10% methanol, sonicated for 30 min, centrifuged at 10000 r.min-l for 10 min, and the supernatant was combined to prepare a test solution.
  • the carnitine content of the meat measured by the method used in Example 9 is shown in Table 14.

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Description

一种用于检测左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的衍生化试剂的 制备及其应用 技术领域：
本发明涉及一种用于检测左旋卡尼汀或和右旋卡尼汀含量的衍生化试剂的制备及应用。 技术背景：
左旋卡尼汀具有多种生理功能， 其最基本的功能是 "运载"长链脂肪酸通过线粒体内膜， 进入线粒体基质进行 β氧化。 左旋卡尼汀在脂肪酸代谢中起着重要的作用， 一旦体内肉碱合 成受阻、 肉碱排出和降解过盛、 肉碱转移酶降低或丧失， 都将造成机体脂类代谢的紊乱， 影 响能量供应， 导致许多疾病。天然左旋卡尼汀的典型提取方法是 Cater等在 1952年报道的从 牛肉中提取， 由于肉类食物中左旋卡尼汀的绝对含量很低， 并且肉汁中胆碱的存在 (其结构与 左旋卡尼汀非常相似） ， 很难分离， 因而直接提取法的步骤比较复杂、 得率低、 价格昂贵， 因此不易于大量获得天然左旋卡尼汀。
目前药用的左旋卡尼汀通常都是使用人工合成获得的。 一般使用外消旋化合物进行拆分 制备左旋卡尼汀， 该方法原料易得、 价格低廉， 工艺简单方便， 易于实现工业化。 但是由于 传统的化学拆分法的缺陷， 化学拆分不可能完全去除右旋异构体， 因此人工合成的左旋卡尼 汀不是绝对的左旋卡尼汀， 还含有右旋卡尼汀。
天然的卡尼汀都是左旋卡尼汀， 只有左旋卡尼汀才具有生理活性， 而右旋卡尼汀对肉碱 乙酰转移酶 (CAT)和肉碱脂肪酰转移酶 (PTC)有竞争性抑制作用，大约有 10%的患者服用混旋 体的卡尼汀后发生重症肌无力样的症状 （《马丁戴尔大药典》第 33版 Pagel356), 因此准确 测定人工合成左旋卡尼汀中的右旋异构体含量非常重要， 关系到人类用药安全。
目前一般通过测定比旋度的方法来检测左旋卡尼汀产品中右旋卡尼汀的含量， 但是该方 法测定精度不高。 为了能精确测定左旋卡尼汀产品中右旋卡尼汀的含量， 为人们提供更安全 有效的药物和保健品、 食品， 我们有必要发展更准确和灵敏的测定左旋卡尼汀中的右旋卡尼 汀的方法。 发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于测定左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 含量的试剂及其 制备方法， 本发明的制备方法简单、 经济， 釆用本发明制备方法所得到的试剂保存稳定， 使 用方便。 本发明的目的之二在于提供一种测定左旋卡尼汀或右旋卡尼汀原料及含有左旋卡尼汀或 /和右旋卡尼汀的各种药物制剂或生物制剂、 保徤品、 化妆品、 人体体液和各种食品中的左旋 卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 含量的检测方法。 本发明的检测方法灵敏度高， 方便快捷。 本发明公开了的用于检测左旋卡尼汀 (或右旋卡尼汀) 的衍生化试剂是含有光学活性纯 的下式 （I)化合物：
Figure imgf000003_0001
式 （I) 中带 * 的碳原子是手性碳原子， 本发明使用的化合物是其单一光学活性的手性 化合物， 其是 D型或 L型； R代表具有 1-6个碳原子的直链或支链烷基， 或具有 6-10个碳 原子的芳垸基， 或具有 2-6个碳原子的直链或支链烯基或炔基， 或具有 3-6个碳原子的环垸 基； X代表卤素。
本发明使用的式 （ I ) 化合物， 其中 R代表甲基、 乙基、 异丙基、 丁基或苄基； X代表 C1或 Br。
本发明公开了优选（+) α -甲基 -6-甲氧基 -2-萘乙酰氯作为检测左旋卡尼汀或右旋卡尼汀 的衍生化试剂。
本发明公开了用于捡测左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的衍生化试剂， 优选光学活性纯式 ( I ) 化合物的固体结晶， 与其他任何光学活性纯式 （ I ) 化合物的溶液相比， 固体结晶更 加稳定， 不易分解， 便于保存。
本发明公开了光学活性纯式 （ I ) 化合物固体结晶的制备方法是通过使用适当溶剂进行 重结晶， 溶剂选自： 乙醚、 丙醚、 四氢呋喃、 丙酮、 甲基乙基酮、 乙腈、 丙腈、 二氯甲烷、 氯仿、 正己烷、 乙酸乙酯， 或它们任意两种或多种的混合物。
本发明公开了光学活性纯式 （ I ) 化合物重结晶溶剂优选乙腈。
本发明同时公开了使用光学活性纯式 （ I ) 化合物的溶液作为衍生化试剂， 其制备方法 是将光学活性纯式（ I )化合物及其固体结晶溶于溶剂中配置成一定浓度的溶液， 溶剂选自： 乙醚、 丙醚、 四氢呋喃、 丙酮、 甲基乙基酮、 乙腈、 丙腈、 乙酸乙酯， 或他们任意两种或多 种的混合物， 溶液浓度为 0.01 〜100 ing/ml。 本发明优选乙腈为溶剂， 浓度为 l-10 mg/ml。
本发明衍生化试剂包含的有效成分式 （1) 化合物粗产物的制备方法是通过以下步骤：
Figure imgf000004_0001
将（+)或（-) α—甲基一6—烷氧基一 2—萘乙酸水解， 再用其它卤代烃与酚羟基结合， 用所得产物进行酰卤反应后制得酰卤粗产物。
本发明公开了制备光学活性纯式 （ I )化合物固体结晶的方法： 将以上酰卤反应所得的 酰卤粗产物使用适当溶剂进行重结晶制得固体结晶。 溶剂选自： 乙醚、 丙醚、 四氢呋喃、 丙 酮、 甲基乙基酮、 乙腈、 丙腈、 二氯甲烷、 氯仿、 正己垸、 乙酸乙酯， 或它们任意两种或多 种的混合物。
本发明公开了光学活性纯式 （ I )化合物重结晶溶剂优选乙腈而得到光学纯度高、 保存 稳定的高纯度的固体结晶。
本发明公开了光学活性纯式 （ I )化合物 （+) α -甲基 -6-甲氧基 -2-萘乙酰氯固体结晶， 其特征为白色针状晶体，熔点 92.3〜93.5°C ; X衍射图谱数据：衍射角（2Θ)在 6.579(d=13.4231， 1/10=54.4), 10.979 (d=8.0522, I/I0-34.1 ), 13.218 (d=6.6925, I/I0=72.2), 13.499 (d=6.5539, I/I0=45.8), 18.222 (d=4.8646, I/I0=21.2)， 18.780(d=4.7211 , I/I0 =100.0)， 19.901(d-4.4577, I/Io =21.7), 21.619(d=4.1072, I/I0 =26.2), 22.100 (d=4.0188， I/I0=75.3), 27.139 (d=3.2830, 1/10=19.0)，47.681 ((1=1.9057，1/10=15.0)处具有特征峰；11 : 3414.5cm—1 , 2983.2cm— 1 , 1786.2cm-1， 1605.0cm"1 , 1390.6cm"1 , 1270.4cm"1 , 1183.1cm"1 , 823.8cm"1 , 701.6cm"1 , 472.2cm—1; 1HNMR (CD3COCD3 , 500MHz): 1.66 (m, 3H), 3.78 (s， 3H)， 4.46 (m, 1H)， 7.19 (m， 1H)， 7.29 (m， 1H)， 7.43 (m, 1H), 7.82 (m, 1H)， 7.83 (s， 1H), 7.85 (s， 1H); 碳氢氮元 素分析： C%: 67.76 (理论值 67.61 )， H%: 5.25(5.27)
MS: 分子量为 248、 250, 是氯的同位素峰， m/z 185是基峰， 丰度为 100%， 推断碎
片离子为：
Figure imgf000004_0002
。 本发明公开了一种捡测样品中左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的方法， 该检测方法包括以 下步骤： ( 1 ) 配制适量左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 的供试品和消旋卡尼汀对照品溶液。
(2)取适量本发明的衍生化试剂，与含左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀）的供试品溶液混匀， 使试品溶液中的左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 发生衍生化反应， 产生左旋卡尼汀 （或右旋卡 尼汀）衍生物。
(3)用高效液相色谱法检测， 并计算出供试品溶液中左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀） 的含 里。 本发明公开了一种检测样品中左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的方法， 其特征在于该检测 方法包括以下步骤：
( 1 )制备衍生化试剂：在避光条件下，使权利要求 1 - 5任一项的含 D型-或 L型式（ I ) 化合物溶解于权利要求 7中所述的溶剂中， 配置成浓度为 0.01 〜100 mg/ml的溶液。 其特征 在于式 （ I )化合物优选 （+) α -甲基 -6-甲氧基 -2-萘乙酰氯， 溶剂优选乙腈， 溶液的浓度优 选 1—10 mg/mlo
(2) 分别制备浓度合适的左旋卡尼汀或右旋卡尼汀供试品溶液和消旋卡尼汀对照品溶 液。
' (3)在溶剂的存在下， 在 2(TC〜95O的水浴中， 使上述步骤 （1 ) 的衍生化试剂分别与 上述步骤 （2) 的供试品溶液和对照品溶液接触密闭反应 20min〜180min。
(4)通过高效液相色谱仪分离和检测反应后的对照品溶液和供试品溶液， 按外标法分别 以峰面积计算样品中左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 的含量。
详细检测方法还包括：
( 1 )色谱条件： 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 以三乙胺缓冲溶液（磷酸 8ml， 三 乙胺 15ml，加水 1500ml)—四氢呋喃为流动相进行梯度洗脱。荧光激发波长为 230nm〜260nm， 发射波长为 340nm〜380nm。
(2)供试品溶液的制备： 精密称取样品适量， 加水溶解并稀释制成含左旋卡尼汀（或右 旋卡尼汀） 0.^g/ml〜3.0 w g/ml的溶液， 作为供试品溶液。
(3)对照品溶液的制备： 精密称取消旋卡尼汀适量加水溶解并稀释制成 0.2 y g/ml〜6.0 μ g/ml的溶液， 作为参比对照品溶液。
(4)衍生化反应： 取对照品溶液和供试品溶液各 30 μ 1， 分别置 5ml量瓶中， 各加入 0.01mol L〜0.5mol/L碳酸缓冲溶液适量， 吡啶乙腈溶液 （每 1ml 乙腈中含吡啶 1 μ 1〜50 μ 1 适量和本发明的衍生化试剂溶液适量， 混匀， 密塞， 于 20°C~95°C水浴中加热密闭反应， 取 出后立即用乙酸缓冲液稀释至刻度， 摇匀， 滤过。 (5)含量测定方法： 分别精密吸取等量的供试品和对照品衍生化反应后的溶液注入液相 色谱仪， 记录色谱图； 按外标法分别以峰面积计算样品中左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 的含 里。
本发明左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀） 的含量检测方法， 上述（1 ) 中色谱条件的流动相由 三乙胺缓冲溶液（磷酸 8ml, 三乙胺 15ml， 加水 1500ml)和四氢呋喃的混合溶液组成。三乙 胺缓冲溶液的 pH值为 2.0〜9.0。两组分的梯度为： 0〜10min， 三乙胺缓冲溶液 70%〜90% , 四氢呋喃 30%〜10%； 10〜llmin， 三乙胺缓冲溶液 70%→30%〜90%— 30%， 四氢呋喃 30 %→70%〜10%— 70% ; ll〜18min，三乙胺缓冲溶液 30%， 四氢呋喃 70% ; 18〜19min， 三 乙胺缓冲溶液 30%— 70%〜30%— 90% , 四氢呋喃 70%→30%〜70%→10%； 19〜25min， 三乙胺缓冲溶液 70%〜90%， 四氢呋喃 30%〜10%。
本发明左旋卡尼汀 (或右旋卡尼汀) 的含量检测方法， 上述（3) 中对照品溶液的具体制 备是： 精密称量消旋卡尼汀 2mg〜60mg于 lOOmL的容量瓶中， 加水溶解， 定容， 再精密移 取 10ml于 100ml容量瓶中， 加水定容作为对照品溶液。 当左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀）样品 浓度为 0.1 u g/ml〜3.0 w g/ml有较好的线性关系，其线性相关系数为 r=0.9991，回收率为 100.6 %。
本发明左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀） 的含量检测方法， 上述（4) 中衍生化试剂的浓度为 0.01 〜100 mg/ml， 优选 1-10 mg/ml， 最优选 5 mg/ml。
本发明左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀） 的含量检测方法， 上述（4) 中碳酸缓冲溶液的具体 制备方法为： 取 4.2g碳酸氢钠加水 900ml， 用 5mol/L的氢氧化钠溶液调节 pH7.0〜12.0， 加 水至 1000mL。
本发明左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀） 的含量检测方法， 上述（4) 中碳酸缓冲溶液的加入 量为 5 μ 1〜500 μ 1。
本发明左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 的含量检测方法， 上述 （4) 中反应温度为 20°C〜 95。C， 反应时间为 20min〜 180min。
本发明左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀） 的含量检测方法， 上述（4) 中乙酸缓冲溶液的具体 制备方法为： 取 3.0mL冰醋酸加水 900mL， 用 5mol/L的氢氧化钠溶液调节 pH2.0〜7.0， 加 水至 1000mL。
本发明公开了本发明的衍生化试剂和检测方法， 应用于检测各种含有左旋卡尼汀或 /和右 旋卡尼汀的药物制剂、 生物制剂、 保健品、 化妆品和各种食品中左旋卡尼汀或 /和右旋卡尼汀 含量， 如： 左旋卡尼汀原料药、 注射液、 口服液、 片、 减肥胶囊、 饮料等。
本发明公开了本发明的衍生化试剂和检测方法， 应用于检测各种包括人在内的哺乳动物 组织和血浆中左旋肉碱的浓度。 本发明公开了本发明的衍生化试剂和检测方法， 适用于检测各种可食用的动植物食品中 左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 的含量。 如： 猪、 牛、 羊、 鸡、 虾、 鱼、 蛋、 蔬菜、 水果等食 物。
本发明公开了本发明的衍生化试剂和检卿方法， 适用于检测各种动物饲料中左旋卡尼汀 (或右旋卡尼汀） 的含量。
本发明公开了本发明的衍生化试剂和检测方法， 适用于检测各种植物养料中左旋卡尼汀 (或右旋卡尼汀） 的含量。
本发明公开了本发明的衍生化试剂， 应用于检测其他手性氨基酸的光学活性纯的含量。 本文中所使用的代号说明
D型： 右旋异构体
L型： 左旋异构体
IR ： 红外吸收光谱
H MR.- 核磁共振氢谱
MS: 质谱
HPLC: 高效液相色谱
(+) MNPC: (+) α一甲基一6—甲氧基一 2—萘乙酰氯
(+) ENPC: (+) α—甲基一 6—乙氧基一2—萘乙酰氯
(+) PNPC: (+) α—甲基一 6—异丙氧基一 2—萘乙酰氯
(+) BUNPC ： (+) α—甲基一 6—丁氧基— 2—萘乙酰氯
(+) BNPC: (+) α一甲基一 6—苄氧基一 2—萘乙酰氯 附图说明
附图 1 左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 含量测定激发波长光谱扫描图
附图 2 左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀）含量测定发射波长光谱扫描图
附图 3 左旋卡尼汀含量测定高效液相色谱图【左旋卡尼汀 （tR=5.139min)】 附图 4 消旋卡尼汀含量测定高效液相色谱图【右旋卡尼汀（tR=4.389min)左旋卡尼汀 (tR=5.136min)】 具体实施方式：
下述实施例用于解释本发明， 而不是对本发明范围的限制。 实施例 1
(+)α—甲基一 6—甲氧基一2—萘乙酰氯 （即 （+) MNPC) 的制备
在 100ml单口瓶中加入 4.6g(+) α一甲基一 6—甲氧基一2—萘乙酸和 50mlTHF,冰水浴冷 却， 磁力搅拌， 加入 2mlSOCl2， 再加入适量吡啶， 反应 6小时后旋蒸至干， 加入 20ml乙腈， 冷冻析出淡黄色固体， 用 15ml乙腈重结晶， 得到白色针状晶体。常温下真空干燥产品得 2.87 g， 收率 57%, 瑢点 92.3〜93.5°C。
IR: 3414.5cm-1, 2983.2cm"1, 1786.2cm"1, 1605.0cm"1, 1390.6cm"1, 1270.4cm-'， 1183.1cm-1， 823.8cm-1, 701.6cm—1, 472.2cm—
■MR (CD3COCD3, 500MHz): 1.66 (m, 3H), 3.78 (s， 3H), 4.46 (m， 1H), 7.19 (m， 1H), 7.29 (m, 1H)， 7.43 (m， 1H), 7.82 (m, 1H), 7.83 (s， 1H), 7.85 (s, 1H)。
X衍射图谱数据：衍射角（ 2Θ )在 6.579( d=l 3.4231， 1/10=54.4 ) , 10.979C d-8.0522， 1/10=34.1 )， 13.218 (d=6.6925， I/I0=72.2), 13.499 (d=6.5539, I/I0=45.8), 18.222 (d=4.8646, I/I0=21.2)， 18.780(d=4.7211, I/I0 =100.0)， 19.901(d=4.4577, I/I0=21.7), 21.619(d=4.1072, I/I0=26.2), 22.100 (d=4.0188, I/I0=75.3)， 27.139 (d=3.2830, I/I0=19.0), 47.681 (d=1.9057, I/I0=15.0) 处具有特征峰。
MS: 分子量为 248、 250, 是氯的同位素峰， m/z 185是基峰， 丰度为 100%， 推断碎
Figure imgf000008_0001
碳氢氮元素分析： C%: 67.76 (理论值 67.61)， H%: 5.25(5.27)。 实施例 2
甲基一 6—乙氧基一2—萘乙酰氯 （即 （+) ENPC) 的制备
步骤 1
将 50g(+)a—甲基一 6—甲氧基一 2—萘乙酸溶于 250ml冰醋酸，加热至回流，每 30分钟 加入 36%的浓盐酸 20ml， 反应 6小时后将反应液倒入 600g冰水中， 抽滤， 固体用乙醇一水 重结晶， 干燥后得无色晶体 9.87g (收率 90.5%)。 熔点： 189.4〜191.3°C;
IR: 3411.1cm"1, 1701.4cm"1, 1632.5cm"', 1606.2cm"1, 1509.1cm-', 1384.4cm"1, 1189.0cm"1, 1147.3cm"1, 865.9cm"1, 477.8cm—1;;
1HNMR (CD3COCD3, 500MHz): δ 1.53 (m, 3H)， 3.98 (m， 1H)， 7.15 (m, 1H), 7.20 (m, 1H)， 7.42 (ra, 1H), 7.67 (m, 1H)， 7.73 (s， 1H), 7.76 (m, 1H)， 8.55 (s, 步骤 2
在 200ml甲醇中溶解 32.0g氢氧化钾和 41.0g步骤 1的产物， 再加入 35.5ml溴乙垸， 加 热回流 2h， 稍冷却后加入 200ml的 5%氢氧化钠回流反应 3〜4h， 结束后加入 600 ml冰水， 搅拌后静置抽滤， 滤液用稀盐酸调 pH至 1〜2， 搅拌均匀后静置抽滤， 并用水洗涤， 抽干后 固体用 500ml 乙醇重结晶， 80°C干燥 4小时得产 37.2g， 收率 80.3%， 熔点 151.8〜155·6Ό；
IR: 3453.5cm"1 , 1729.6cm"1, 1690.5cm-1, 1604.5cm-1, 1393.7cm"1, 1181.9cm"1, 1158.4cm-1, 862.4cm"1 , 481.8cm"1;
1HNMR (CD3COCD3, 500MHz): δ 1.43 (m, 3H)， 1.53 (m, 3H), 3.90 (m， 1H)， 4.16 (m， 2H), 7.15 (m, 1H)， 7.25 (m, 1H), 7.46 (m， 1H)， 7.75 (s， 1H)， 7.76 (s, 1H), 7.79 (s, 1H)。
步骤 3
参照实施例 1所用方法， 将步骤 2所得产物制成酰氯， 熔点 91.7〜92.9Ό。
IR: 3416.7cm'1, 2982.1cm-1, 1785.9cm"1, 1605.2cm"1, 1390.5cm"1, 1269.1cm"', 1182.6cm-1,
823.8cm 701.8cm-', 472.6cm"1;
1HNMR (CD3COCD3, 500MHz): δ 1.43 (m, 3H), 1.66 (m, 3H), 4.18 (m， 2H),
4.46 (m， 1H), 7.19 (m， 1H)， .7.29 (m, 1H)， 7.43 (m, 1H), 7.82 (m， 1H)， 7.83 (s,
1H), 7.85 (s， lH)o 实施例 3
—甲基 _6—异丙氧基一 2—萘乙酰氯 （即 （+) PNPC) 的制备
用实施例 2所用方法， 步骤 2采用 2-溴丙烷为原料制得。 熔点： 77.8〜79.4°C;
IR: 3416.3cm"1, 1784.5cm—1, 1604.8cm-1, 1390.2cm"1, 1270.3 cm"1, 1182.5cm-1, 854.6cm"1 , 699.2cm ， 469.5cm-1;
1HNMR (CD3COCD3, 500MHz): δ 1.06 (m， 3H)， 1.65 (m, 3H)， 1.83 (m， 2H), 4.07 (m， 2H)， 4.45 (m， 1H), 7.19 (m， 1H)， 7.29 (m, 1H), 7.42 (m, 】H)， 7.81 (m， 1H), 7.82 (s， 1H), 7.84 (m, 1H)。 实施例 4
(+)α—甲基一 6—丁氧基一2—萘乙酰氯 （即 （+) BUNPC) 的制备
用实施例 1所用方法， 步骤 2采用溴代正丁垸为原料制得。 熔点： 56.3〜57.3°C;
IR: 3415.7cm-1, 1785.3cm—1, 1605.2cm"1, 1468.3cm'1, 1392.3cm"1, 1268.9cm ， 1178.3cm-1, 921.8cm-1, 819.9cm-1, 727.45cm"1 , 474.6cm"1; 1HNMR (CD3COCD3, 500MHz): δ 1.00 (m， 3H)， 1.55 (m， 2H), 1.67 (m， 3H), 1.82 (m， 2H)， 4.14 (m， 2H)， 4.48 (m， 1H)， 7.19 (m, 1H), 7.31 (m, 1H), 7.42 (m, 1H), 7.82 (m, 1H)， 7.83 (s， 1H), 7.85 (m, 1H)。 实施例 5
(+) α—甲基一6—苄氧基 _2—萘乙酰氯 （即 （+) BNPC) 的制备
用实施例 1所用方法， 步骤 2釆用溴化苄为原料制得。 熔点： 77.2〜79.1 Ό ;
1HNMR (CD3COCD3, 500MHz): δ 1.6 (d, 3Η)' 3.81 (m, 1H)， 4.14 (m, 2H), 4.48 (m, 1H)， 5.26 (s, 2H)， 7.19 (m， 1H)， 7.22 (m， 1H)， 7.38 (m, 3H)， 7.42 (m， 1H), 7.47(m, 2H)， 7.83 (m， 1H), 7.87 (m, 1H)， 7.90 (m， 1H)。 实施例 6
衍生化反应及色谱条件 - 1 . 色谱条件与系统适用性试验：
Agilent 1100 型高效液相色谱仪;荧光检测器； 色谱柱： 8· -ODS 柱 （4.6 X I 50mm， 5 u m); 总流速： Iml/min;流动相： 以三乙胺缓冲溶液（磷酸 8ml,三乙胺 15ml,加水 1500ml， 调 pH至 5.4) ·一四氢呋喃混合液为流动相， 时间梯度如下表 1 :
表 1 HPLC时间梯度表
时间 (min) 三乙胺缓冲溶液（％) 四氢呋喃（％)
0 75 25
10 75 25
11 30 70
18 30 70
19 75 25
25 75 25
理论板数按右旋卡尼汀计算大于 5000 ，左旋卡尼汀和右旋卡尼汀各峰分离度均大于 1.5。 2.检测波长的选择
将衍生化反应之后的产物进行光谱扫描 （附图 1， 2)。 最终选用 234mn作为激发波长，
360nm作为发射波长。
3.对照品溶液的制备
精密称量消旋卡尼汀 20mg于 lOOmL的容量瓶中， 加水溶解， 定容， 再精密移取 10ml 于 100ml容量瓶中， 加水定容作为对照品溶液。 4.衍生化反应:取对照品溶液和供试品溶液各 30 u 1，分别置 5ml量瓶中，各加入 0.05mol/L 碳酸缓冲溶液 100 μ 1(取 4.2g碳酸氛钠加水 900ml，用 5mol/L的氢氧化钠溶液调节 pH至 8.4)， 吡啶乙腈溶液 （每 lml乙腈中含吡啶 25 μ 1) 100 μ ΐ和的衍生化试剂溶液 (0.5%的 (+) α—甲 基一 6—甲氧基一2—萘乙酰氯乙腈溶液） 200 μ 1， 混勾， 密塞， 于 40°C水浴中加热， 密闭反 应 60min， 取出后立即用乙酸缓冲液（取 3.0mL冰醋酸加水 900mL， 用 5mol/L的氢氧化钠溶 液调节 pH至 7.0， 加水至 lOOOmL)稀释至刻度， 摇匀， 滤过。
5.含量测定方法： 分别精密吸取供试品和对照品衍生化反应后的溶液各 10 μ ΐ注入液相 色谱仪， 记录色谱图； 按外标法分别以峰面积计算样品中左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 的含 量。
当左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀）样品浓度为 0.33 g/ml〜1.64 μ g/ml有较好的线性关 系， 其线性相关系数为 r=0.9991， 回收率为 100.6%。 实施例 7
式（I)化合物固体结晶和该化合物溶液的稳定性研究
首先要保证衍生化试剂的含量准确，才能保证测定结果准确。 由于式（I)化合物为酰氯， 性质活泼， 遇水极易分解， 因此必须寻找合适的保存方式和使用条件， 包括选择合适的溶剂， 保证式（I)化合物稳定， 从而减少测定的误差。 选用乙醚、 丙醚、 四氢呋喃、 丙酮、 甲基乙 基酮、 乙腈、 丙腈、 乙酸乙酯等作为溶剂， 将式 （I)化合物固体结晶配成相应的溶液， 并与 式 （I)化合物固体结晶一起进行考察其稳定性。
选取 5mg/ml 的 —甲基一 6—甲氧基一2—萘乙酰氯（即 （+) M PC) 乙腈溶液、 丙 酮溶液、 乙酸乙酯溶液及固体结晶分别进行了稳定性试验考察， 实验数据见表 2、表 3、表 4、 表 5。
(+) MNPC固体稳定性考察实验数据
冷藏保存时间 （月） 新制 0. 5 1 2 3 6 12
(+) MNPC的含量 (%) 99. 55 99. 50 99. 53 99. 39 99. 30 99. 09 98. 52
(-） MNPC的含量 (%) 0. 12 0. 13 0. 12 0. 13 0. 14 0. 15 0. 15 其他杂质的含量 (%) 0. 33 0. 37 0. 35 0. 48 0. 56 0. 76 1. 33 备注： 保存条件， 棕色玻璃瓶分装， 密封冷冻 (-15¾)保存
表 3 (+) MNPC乙腈溶液稳定性考察实验数据 冷冻保存时间（天） 新配 3 10 20 30 50 80
(+) 寶 C的含量 (¾) 99. 55 99. 55 99. 51 99. 09 99. 55 99. 15 97. 48
(-） 薦的含量 (¾) 0. 12 0. 13 0. 16 0. 19 0. 16 0. 23 0. 31 其他杂质的含量 (%) 0. 33 0. 32 0. 33 0. 72 0. 29 0. 62 2. 21 备注： 保存条件， 棕色玻璃瓶分装， 密封冷冻 (-15Ό)保存 表 4 (+) MNPC丙酮溶液稳定性考察实验数据
冷冻保存时间（天） 新配 3 10 20 30 50 80
C+) MNPC的含量 (%) 99. 55 99. 04 98. 64 97. 33 96. 21 94. 83 90. 51 ο
(-) MNPC的含量 (%) 0. 12 0. 15 0. 17 0. 21 0. 24 0. 42 0. 73 其他杂质的含量 (%) 0. 33 0. 81 1. 19 2. 46 3. 55 4. 75 8. 76 备注： 保存条件， 棕色玻璃瓶分装， 密封冷冻 (-15ϋ)保存 表 5 (+) MNPC乙酸乙酯溶液稳定性考察实验数据 冷冻保存时间 （天） 新配 3 10 20 30 50 80
(+) MNPC的含量 (56) 99. 55 84. 13 67. 96 50. 22 16. 52
(-) MNPC的含量 (%) 0. 12 0. 98 1. 77 3. 11 3. 85 4. 01 4. 82 其他杂质的含量 (%) 0. 33 3. 14 7. 33 12. 76 28. 19 45. 77 78. 66 保存条件， 棕色玻璃瓶分装， 密封冷冻 (-15^)保存 对比上面表 2〜表 5中的实验数据， 可以看出在所有固体结晶和溶液样品中， MNPC固 体结晶稳定性比其任何溶液的稳定性都好，在 MNPC溶液中以乙腈做溶剂的溶液的稳定性最 好， 到 60天时含量开始明显下降， 而用其他溶剂做溶液的稳定性更差。 因此， MNPC固体结 晶的稳定性最好， 适宜作为衍生化试剂长期保存、 运输； 在所有溶液中 MNPC的乙腈溶液最 为稳定， 乙腈适宜作为衍生化试剂的溶剂用于配置衍生化试剂溶液和进行衍生化反应。 实施例 8
测定人工合成的左旋卡尼汀中右旋卡尼汀的含量
精密称取左旋卡尼汀样品 lOOmg于 lOOmL容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取 10ml 于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作为供试品溶液； 另精密称量消旋卡尼汀 20mg于 lOOmL的 容量瓶中， 加水溶解， 定容， 再精密移取 lml于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作为对照品溶 液。
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 30 u 1， 分别置 5ml量瓶中， 各加入 0.05mol/L 碳酸缓冲溶液 100 μ 1(取 4.2g碳酸氢钠加水 900ml，用 5mol L的氢氧化钠溶液调节 pH至 8.4)， 吡啶乙腈溶液（每 lml乙腈中含吡啶 25 μ 1) ΙΟΟ μ Ι和的衍生化试剂（0.5%的 (+) α—甲基 _6 —甲氧基一 2—萘乙酰氯乙腈溶液）200 μ 1，混匀，密塞，于 40°C水浴中加热，密闭反应 60min， 取出后立即用乙酸缓冲液 （取 3.0mL冰醋酸加水 900mL， 用 5mol/L的氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.0， 加水至 lOOOmL)稀释至刻度， 摇匀， 滤过。 分别精密吸取供试品和对照品衍生化反 应后的溶液各 10 μ ΐ注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法分别以峰面积计算样品中右旋 卡尼汀的含量， 结果见表 6。
合成的左旋卡尼汀中右旋卡尼汀的含量测定结果
1 2 3 4 5 6 平均值 RSD 右旋卡尼汀的含量 (%) 0. 99 0. 97 1. 00 0. 98 1. 00 0. 98 0. 99 1. 22% 实施例 9
测定左旋卡尼汀的含量
精密称取左旋卡尼汀样品 10mg于 lOOmL的容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取 lml 于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作为供试品溶液； 另精密称量消旋卡尼汀 20mg于 lOOmL的 容量瓶中， 加水溶解， 定容， 再精密移取 lml于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作为对照品溶 液。
分别精密吸取 30 对照品溶液、 供试品溶液至 5mL 棕色容量瓶中， 再各自加入 0.05mol/L碳酸缓冲液（pH=8.4) 100 L、 吡啶乙腈溶液 ΙΟΟ μ 1和 0.5 %的衍生化试剂的乙腈 溶液 200 w L，混勾，密塞于 40Ό水浴中反应 60min，取出，用 0.05mol/L乙酸缓冲液（pH=7.0) 稀释至刻度，过滤。分别精密吸取供试品和对照品衍生化反应后的溶液各 10 μ ΐ注入液相色 谱仪， 记录色谱图； 按外标法分别以峰面积计算样品中右旋卡尼汀的含量， 结果见表 8。
表 8 左旋卡尼汀的含量测定结果
1 2 3 4 5 6 平均值 RSD 左旋卡尼汀的含量 (%) 98. 53 98. 88
Figure imgf000013_0001
98. 67 99. 13 98. 72 98. 79 0. 21 % 实施例 10
同时测定左旋卡尼汀原料中左旋卡尼汀和右旋卡尼汀的含量 精密称取左旋卡尼汀供食供试品 lOOmg于 lOOmL容量瓶中， 加水溶解， 定容， 再精密 移取 10ml于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作为供试品溶液；另精密称量消旋卡尼汀 20mg于 lOOmL 的容量瓶中， 加水溶解， 定容， 即为对照品溶液 1 ; 精密移取 "对照品溶液 1 " 1ml 于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作为对照品溶液 2。
分别精密吸取对照品溶液 1， 2 和供试品溶液各 30 μ 1， 分别置 5ml 量瓶中， 各加入 0.05mol/L碳酸缓冲溶液 100 μ 1 (取 4.2g碳酸氢钠加水 900ml， 用 5mol/L的氢氧化钠溶液调 节 pH至 8.4)， 吡啶乙腈溶液（每 lml乙腈中含吡啶 25 u 1) 100 μ 1和的衍生化试剂 (0.5%的 (+) α—甲基一6—甲氧基一2—萘乙酰氯乙腈溶液） 200 μ 1， 混匀， 密塞， 于 40°C水浴中加热， 密闭反应 60min， 取出后立即用乙酸缓冲液（取 3.0mL冰醋酸加水 900mL， 用 5mol/L的氢氧 化钠溶液调节 pH至 7.0, 加水至 lOOOmL)稀释至刻度， 摇匀， 滤过。 分别精密吸取供试品 和对照品衍生化反应后的溶液各 10 μ ΐ注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法分别以峰面 积计算样品中左旋卡尼汀和右旋卡尼汀的含量， 结果见表 9。
表 9 左旋卡尼汀原料的测定结果
1 2 3 4 5 6 平均值 RSD 左旋卡尼汀的含量 (%) 98.01 97.75 98.57 97.83 98.19 97.64 98. 00 0. 35 % 右旋卡尼汀的含量 (%) 0.58 0.61 0.59 0.59 0.61 0.60 0. 60 2. 03 % 实施例 11
测定左旋卡尼汀注射液的含量
精密移取左旋卡尼汀注射液 （5ml: lg) lmL于 lOOmL的容量瓶中， 加水定容， 再精密 移取 lml于 100ml容量瓶中， 加水定容， 再精密移取 5ml于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作 为供试品溶液。
用实施例 9所用方法测得结果见表 10。
表 10 左旋卡尼汀注射液的含量测定结果 （标示量)
1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
P服液含量 (%) 100. 55 99. 81 100. 19 99. 72 100. 3 100. 39 100. 16 0. 33 % 实施例 12
测定左旋卡尼汀口服液中的含量 精密移取左旋卡尼汀口服液（10ml: lg) lmL于 lOOmL的容量瓶中， 加水定容， 再精密 移取 1ml于 100ml容量瓶中， 加水定容， 再精密移取 10ml于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作为供试品溶液。
用实施例 9所用方法测得结果见表 11
表en 1 •1 左旋卡尼汀口服液的含量测定结果 （标示量)
1 2 3 4 5 6 平均值 RSD 口服液含量 W 97. 88 98. 05 97. 55 98. 23 97. 77 97. 71 97. 86 0. 25 % 实施例 13
测定减肥胶囊中左旋卡尼汀的含量
取含左旋卡尼汀的减肥胶囊 20粒， 精密称定后， 倾出内容物（不得损失胶囊壳）， 胶囊 壳用小刷拭净后精密称定； 取胶囊内容物混合均匀， 研细， 精密称取适量 （约相当于左旋卡 尼汀 10mg)置 100ml容量瓶中， 加水超声溶解 30min， 完全溶解后加水定容， 滤过， 再精密 移取 lml于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作为供试品溶液。
用实施例 9所用方法测得其中左旋卡尼汀的含量结果见表 12
表 12 某品牌左旋卡尼汀减肥胶囊中左旋卡尼汀含量检测结果
1 2 3 4 5 6 平均值 RSD 左旋卡尼汀含量 (mg/100mg) 20. 27 1. 87% 实施例 14
测定人血浆中的游离肉碱水平
血浆供试液预处理： 吸取血浆（血站购买） 100 μ ΐ, 加入含 10%甲醇的乙腈 400 μ 1， 摇 匀后， 于漩涡混合器上振荡 5min 10000r.min-l离心 lOmin后， 取上清液为供试液。
对照品溶液： 精密称取消旋卡尼汀 35mg于 lOOmL的容量瓶中， 加水溶解， 定容， 再精 密移取 1ml于 100ml容量瓶中， 加水定容即得。
用实施例 9所用方法测得人体血浆中游离肉碱的浓度见表 13
表 13 人血浆中游离肉碱水平的测定结果
1 2 3 4 5 6 平均值 RSD 人体血桨中游离肉碱浓度
45. 92 1. 06%
(^ mol/L) 测定肉类中的肉碱水平
肉类样品预处理： 先将鲜肉粉碎， 称取粉碎后的样品 2g， 加入含 10%甲醇的乙腈 25ml 均质 5min, 超声处理 30min， 10000r.min-l离心 lOmin后， 转移上清液， 残渣中加入含 10% 甲醇的乙腈 25ml混合， 超声处理 30min， 10000r.min-l离心 lOmin后， 合并上清液作为供试 品溶液。
另精密称取消旋卡尼汀 lOOmg于 lOOmL的容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取 10ml 于 100ml容量瓶中， 加水定容， 作为对照品溶液。
用实施例 9所用方法测得肉中的肉碱含量结果见表 14。
猪、 牛、 羊肉中肉碱水平检测结果
1 2 3 4 5 平均值 RSD 猪肉 (g/kg) 0. 22 0. 22 0. 23 0. 24 0. 24 0. 23 4. 35% 牛肉 (g/kg) 0. G4 0. 68 0. 66 0. 65 0. 62 0. 65 3. 44% 羊肉 (g/kg) 2. 01 2. 2 2. 15 2. 12 2. 22 2. 14 3. 87 %

Claims

权利要求
1.含有光学活性纯的下式（ I ) 的化合物作为衍生化试剂在分离左旋卡尼汀或右旋卡尼 汀或测定样品中左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量中的用途。
Figure imgf000017_0001
式 （I) 中带 * 的碳原子是手性碳原子， 本发明使用的化合物是其单一光学活性的手性 化合物， 其是 D型或 L型； R代表具有 1-6个碳原子的直链或支链垸基， 或具有 6-10个碳 原子的芳烷基， 或具有 2-6个碳原子的直链或支链烯基或炔基， 或具有 3-6个碳原子的环烷 基； X代表卤素。
2.权利要求 1所述的用途， 其中在式（I)化合物中， R代表甲基、 乙基、 异丙基、 丁基 或苄基； X代表 CI或 Br。
3. 权利要求 1所述的用途， 其中式 （I)化合物为固体结晶形式。
4. 权利要求 3所述的用途， 其中所述的式 （I)化合物选自 （+) α -甲基 -6-甲氧基 -2-萘 乙酰氯， （-) α -甲基 -6-甲氧基 -2-萘乙酰氯， （+) α -甲基 -6-乙氧基 -2-萘乙酰氯和 （- ) α -甲 基 -6-乙氧基 -2-萘乙酰氯。
5. 权利要求 1-4任一项所述的用途， 其中将光学活性纯式 （I) 化合物以其固体结晶溶 于溶剂中配置成一定浓度的溶液使用。 其溶剂选自： 乙醚、 丙醚、 四氢呋喃、 丙酮、 甲基乙 基酮、 乙腈、 丙腈、 乙酸乙酯， 或他们任意两种或多种的混合物； 其溶液浓度为 0.01 〜100
6.权利要求 5的用途， 其中所述的溶剂是乙腈， 浓度为 l-10 mg/ml。
7. 一种检测样品中左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的方法， 其特征在于， 该检测方法包括 以下步骤：
( 1 )配制适量左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 的供试品和消旋卡尼汀对照品溶液。
(2)取适量本发明的衍生化试剂，与含左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀）的供试品溶液混匀， 使试品溶液中的左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 发生衍生化反应， 产生左旋卡尼汀 （或右旋卡 尼汀） 衍生物。
(3 )用高效液相色谱法捡测， 并计算出供试品溶液中左旋卡尼汀（或右旋卡尼汀）的含 里。
8. 权利要求 7所述的方法，， 其特征在于该检测方法还包括以下步骤- ( 1 )制备衍生化试剂：在避光条件下，使权利要求 1 - 5任一项的含 D型-或 L型式（ I ) 化合物溶解于权利要求 6所述的溶剂中， 配置成浓度为 0.01 〜100 mg/ml的溶液。 其特征在 于式 （ I )化合物优选 （+) α -甲基 -6-甲氧基 -2-萘乙酰氯， 溶剂优选乙腈， 溶液的浓度优选 1-10 mg/mL
(2 ) 分别制备浓度合适的左旋卡尼汀或右旋卡尼汀供试品溶液和消旋卡尼汀对照品溶 液。 .
(3 )在溶剂的存在下， 在 20Ό〜95Ό的水浴中， 使上述步骤 （1 ) 的衍生化试剂分别与 上述步骤 （2) 的供试品溶液和对照品溶液接触密闭反应 20min〜180min。
(4)通过高效液相色 i¼仪分离和检测反应后的对照品溶液和供试品溶液，按外标法分别 以峰面积计算样品中左旋卡尼汀 （或右旋卡尼汀） 的含量。
9、 权利要求 7或 8所述的方法， 其中所述供试品包括各种含有左旋卡尼汀或 /和右旋卡 尼汀的药物制剂、 生物制剂、 保健品、 化妆品和各种食品， 如： 左旋卡尼汀原料药及其注射 液、 口服液、 片、 减肥胶囊、 饮料等。
10、 权利要求 7或 8所述的方法， 其中所述供试品包括含人在内的各种哺乳动物组织和 血浆。
11、权利要求 7或 8所述的方法， 其中所述供试品包括各种可食用的动、 植物食品， 如： 猪、 牛、 羊、 鸡、 虾、 鱼、 蛋、 蔬菜、 水果等食物。
12、 权利要求 7或 8所述的方法， 其中所述供试品包括各种动物饲料。
13、 权利要求 7或 8所述的方法， 其中所述供试品包括各种植物养料。
14、 权利要求 1-4任一项中所述的光学活性纯式 （I )化合物在检测手性氨基酸含量中的 用途。
15、光学活性纯的下式 （ I ) 的化合物：
Figure imgf000018_0001
式 （I) 中带 * 的碳原子是手性碳原子， 本发明使用的化合物是其单一光学活性的手性 化合物， 其是 D型或 L型； R代表具有 1-6个碳原子的直链或支链烷基， 或具有 6-10个碳 原子的芳烷基， 或具有 2-6个碳原子的直链或支链烯基或炔基， 或具有 3-6个碳原子的环烷 基； X代表卤素。
16.权利要求 15所述的式 （I)化合物， 其中 R代表甲基、 乙基、 异丙基、 丁基或苄基; X代表 C1或 Br。 81
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