CN113307762A - 一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的广谱性抗体的制备和应用 - Google Patents

一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的广谱性抗体的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于同时检测的广谱性抗体的制备方法和应用。本发明首先提供了两种半抗原：半抗原1和半抗原2，其中半抗原1结构式如式(Ⅰ)所示；半抗原2结构式如式(Ⅲ)所示。应用半抗原1制备得到了用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体，应用半抗原2制备得到了用于包被的人工抗原2，该抗体对减肥类保健食品中三种非法添加物均具有较高的灵敏度和特异性，满足市场监管所需的检出限，同时建立了一种低成本、高灵敏、稳定的同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的免疫分析方法，具有良好的应用前景。

Description

一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的广谱性抗 体的制备和应用
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域。更具体地，涉及一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的广谱性抗体的制备和应用。
背景技术
比沙可啶、脱乙酰比沙可啶、匹可硫酸钠是临床上使用率高的缓泻药物。比沙可啶主要通过直接接触黏膜并刺激其感觉神经末梢而增强反射性蠕动，促进排便，但食用过量会对结肠造成刺激或损伤作用。脱乙酰比沙可啶是比沙可啶合成过程中产生的一种杂质，具有与比沙可啶同样的功效。匹可硫酸钠可直接刺激肠道黏膜，促进肠道蠕动并抑制肠道中水分的吸收，从而导致腹泻，长期服用会导致腹痛、恶心、呕吐等不良症状。随着人们生活水平的提高，人们对饮食健康和体重方面也逐渐重视，对减肥类保健食品的需求日益增加，不法商家利用三种减肥类药物致泻的功效将其添加在青梅、玫瑰茄等果脯、蜜饯类保健食品等减肥类保健品中，使达到快速减肥的目的，但对人体危害巨大。
已报道的该类药物在减肥类保健食品中的检测方法主要是超高效液相色谱-串联质谱法(宋晓婉等，HPLC-MS/MS法检测减肥类保健品中4种减肥类非法添加物，食品科技，2020年第45卷第5期；肖之敏等，超高效液相色谱-串联质谱法测定减肥类保健食品中3种违法添加的缓泻药成分的含量，食品安全质量检测学报，2020年第11卷第5期)和icELISA方法(专利CN112142651A，一种快速检测比沙可啶的半抗原BIS、人工抗原及其抗体和检测方法；专利CN112250617A，一种匹可硫酸钠半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用)，超高效液相色谱-串联质谱方法对不同的食品基质净化效果好，灵敏度、准确度和精密度高，回收率稳定，可用于实验室的检测，但该方法需要大型仪器，且仪器昂贵，需专业人员操作，无法满足市场监管局的现场快速检测的要求。icELISA方法分别有针对比沙可啶和匹可硫酸钠单一对象的检测，从两者专利中对其他药物的交叉反应率可以看出，制备得到的抗体仅满足所需对象的检测，无法达到同时检测另外两种非法添加物的检测需求，目前未有对比沙可啶、脱乙酰比沙可啶和匹可硫酸钠同时进行快速检测的方法，因此十分有必要建立一种针对三种减肥药的快速免疫学检测方法，该方法的关键在于获得对三种非法添加物均具有高灵敏度的抗体。综上，制备一种稳定性强、灵敏度高的针对减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体，建立一种高效快速同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的检测方法是十分有必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有方法对脱乙酰比沙可啶检测的缺失和无法同时检测三种非法添加药物的不足，提供一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的广谱性抗体的制备和应用。
本发明的目的是提供一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的半抗原1。
本发明另一目的是提供所述半抗原1、半抗原2在制备用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的人工抗原中的应用。
本发明另一目的是提供一种用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的人工抗原。
本发明另一目的是提供所述半抗原1或所述人工抗原1在制备用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体中的应用。
本发明另一目的是提供一种用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体。
本发明另一目的是提供一种重组细胞。
本发明另一目的是提供所述抗体或所述重组细胞在同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的应用。
本发明另一目的是提供一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的半抗原1，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003039896810000031
所述半抗原1采用系统命名法为：2-(4-((4-hydroxyphenyl)(pyridin-2-yl)methyl)phenoxy)acetic acid，即2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸。
本发明所述半抗原1的制备方法为：
S1.将比沙可啶溶解于溶剂中，加入碱性水溶液，45℃～55℃冷凝回流4～6h，调酸，萃取，得到脱乙酰比沙可啶；
S2.将步骤S1所得脱乙酰比沙可啶加入溶剂中溶解后，加入溴乙酸乙酯，45℃～55℃冷凝回流9～11h，纯化洗脱，水解，得到水解产物；
S3.将步骤S2所得水解产物调酸、萃取、干燥，得所述半抗原1。
优选地，所选半抗原1的制备方法为：
S1.将比沙可啶充分溶解于乙腈中，加入3mol/L的氢氧化钠水溶液，45℃～55℃冷凝回流4～6h，冷却，用1mol/L盐酸调节pH至6～7，萃取，取酯层，旋蒸后得到脱乙酰比沙可啶；
S2.将步骤S1所得脱乙酰比沙可啶加入乙腈中溶解后，加入溴乙酸乙酯，45℃～55℃冷凝回流9～11h，纯化洗脱，水解，得到水解产物；
S3.将步骤S2所得水解产物调节pH至6～7，室温搅拌2h，萃取、干燥，得所述半抗原1。
优选地，步骤S1所述冷凝回流的温度为50℃，时间为5h。
优选地，步骤S2所述冷凝回流的温度为50℃，时间为10h。
优选地，步骤S1、S2所述萃取是用乙酸乙酯和水进行萃取。
优选地，步骤S2所述干燥是无水硫酸钠进行干燥。
所述半抗原1在制备用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的人工抗原中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的人工抗原1，其结构式如式(II)所示：
Figure BDA0003039896810000041
优选地，所述人工抗原1由所述半抗原1与载体蛋白KLH用活泼酯法偶联得到；所述载体为钥孔血蓝蛋白。
所述半抗原1或所述人工抗原1在制备用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物时用于包被的半抗原2，其结构式如(Ⅲ)所示：
Figure BDA0003039896810000042
所述半抗原2采用系统命名法命名为6-(4-((4-hydroxyphenyl)(pyridin-2-yl)methyl)phenoxy)hexanoic acid，即6-(4-((4-羟基苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)己酸。
本发明所述半抗原2的制备方法为：
S1.将比沙可啶充分溶解于溶剂中，加入碱性水溶液，45℃～55℃冷凝回流4～6h，调酸，萃取，得到脱乙酰比沙可啶；
S2.将步骤S1所得脱乙酰比沙可啶加入溶剂中溶解后，加入6-溴己酸乙酯，45℃～55℃冷凝回流9～11h，纯化洗脱，水解，得到水解产物；
S3.将步骤S2所得水解产物调酸、萃取、干燥，得所述半抗原2。
优选地，所述半抗原2的制备方法为：
S1.将比沙可啶充分溶解于乙腈中，加入3mol/L氢氧化钠水溶液，45℃～55℃冷凝回流4～6h，冷却，用盐酸调节pH至6～7，萃取，取酯层，旋蒸后得到脱乙酰比沙可啶；
S2.将步骤S1所得脱乙酰比沙可啶加入乙腈中溶解后，加入6-溴己酸乙酯，45℃～55℃冷凝回流9～11h，纯化洗脱，水解，得到水解产物；
S3.将步骤S2所得水解产物调节pH至6～7，50℃下搅拌2h，萃取、干燥，得所述半抗原2。
优选地，步骤S1所述冷凝回流的温度为55℃，时间为4h。
优选地，步骤S2所述冷凝回流的温度为50℃，时间为10h。
优选地，步骤S1、S2所述萃取是用乙酸乙酯和水进行萃取。
优选地，步骤S2所述干燥是无水硫酸钠进行干燥。
所述半抗原2在制备用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的人工抗原/包被原中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物时用于包被的的人工抗原2，其结构式如式(Ⅳ)所示：
Figure BDA0003039896810000051
优选地，所述人工抗原2由所述半抗原2与卵清蛋白用活泼酯法偶联得到；所述载体为卵清蛋白。
本发明还提供了一种用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体，由所述半抗原1与钥孔血蓝蛋白偶联得到的完全人工抗原1免疫新西兰大白兔制备得到。
本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞为能够表达所述抗体的细胞。
所述抗体或所述重组细胞在同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的免疫分析方法，以所述半抗原2与卵清蛋白偶联得到的完全人工抗原2作为包被原，以所述半抗原1与钥孔血蓝蛋白偶联得到的完全人工抗原1免疫新西兰大白兔制备得到的抗体作为检测抗体进行检测；所述减肥类保健食品中三种非法添加物为比沙可啶、脱乙酰比沙可啶及匹可硫酸钠。所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明制备得到了两种半抗原：半抗原1和半抗原2，应用半抗原1制备得到了用于检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体，应用半抗原2制备得到了用于包被的人工抗原2，该抗体对减肥类保健食品中三种非法添加物具有高灵敏度的识别能力，对比沙可啶的线性检测范围为0.36～7.33μg/kg，半抑制浓度IC50为1.63μg/kg，最低检测限为0.15μg/kg；对脱乙酰比沙可啶的线性检测范围为0.31～12.98μg/kg，半抑制浓度IC50为1.99μg/kg，最低检测限为0.10μg/kg；对匹可硫酸钠的线性检测范围为11.61～183.70μg/kg，半抑制浓度IC50为46.18μg/kg，最低检测限为5.18μg/kg。不与双醋酚丁、酚酞等减肥药物发生交叉反应。本发明制备得到的同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体能够满足检测要求，市场监管目前对比沙可啶的检测需求为5μg/kg，对匹可硫酸钠的检测需求为200μg/kg，对脱乙酰比沙可啶无确切说明；另外，该方法中半抗原1、半抗原2、人工抗原及抗体的制备方法简单、成本低，为建立同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的免疫学检测方法提供了核心材料，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明半抗原1的合成路线图。
图2为本发明半抗原2的合成路线图。
图3为人工抗原1的紫外全波长扫描鉴定结果图。
图4为人工抗原2的紫外全波长扫描鉴定结果图。
图5为用于检测比沙可啶的抗体间接竞争ELISA标准曲线图。
图6为用于检测脱乙酰比沙可啶的抗体间接竞争ELISA标准曲线图。
图7为用于检测匹可硫酸钠的抗体间接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明半抗原1的合成路线图如图1所示，半抗原2的合成路线如图2所示。
实施例1半抗原1的制备
一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的半抗原1的制备方法，包括以下步骤：
S1.将1g比沙可啶溶解在10mL乙腈中，加入12mL 3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，50℃冷凝回流5h，用1M盐酸水溶液酸化，再用乙酸乙酯和水进行萃取，收集酯层，得到脱乙酰比沙可啶10.99g，转化率为99％。
S2.取步骤S1所得脱乙酰比沙可啶溶解于10mL乙腈，加入40μL溴乙酸乙酯，50℃冷凝回流10h，得到棕褐色物质，用硅胶柱纯化，混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚的体积比为1:2)洗脱分离，将得到的洗脱产物溶于甲醇中，加入1mL 3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，室温搅拌2h，用乙酸乙酯和水萃取3次，再用1mL 3M的盐酸调节pH至6～7，无水硫酸钠进行干燥，得到半抗原1。
实施例2半抗原1的鉴定
1、实验方法
以实施例1中的制备得到的半抗原1进行核磁共振氢谱鉴定和质谱确定。
2、实验结果
半抗原1的MS-ESI+结果如下：MS:C20H17NO4:335，ESI+[M-H]+:336。
半抗原1的1H-NMR结果如下：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ8.47(ddd,J＝5.0,1.9,0.9Hz,2H),7.80(td,J＝7.7,1.8Hz,2H),7.31(ddd,J＝7.5,5.0,1.2Hz,2H),7.19(dt,J＝7.9,1.1Hz,2H),7.06-7.01(m,4H),6.95-6.88(m,6H),6.89(d,J＝6.7Hz,2H),6.76-6.70(m,4H),5.58(s,2H),4.85(s,39H),4.63(s,4H),4.11(q,J＝7.1Hz,1H),2.01(d,J＝13.3Hz,2H),1.35(s,1H),1.34(s,1H),1.33-1.22(m,8H),0.94-0.89(m,1H)。
根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，衍生位点正确且成功，说明本发明成功制备得到了半抗原1，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003039896810000081
半抗原1采用系统命名法为：2-(4-((4-hydroxyphenyl)(pyridin-2-yl)methyl)phenoxy)acetic acid，即2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸。
实施例3人工免疫抗原1的合成与鉴定
1、合成
取1mg实施例1制备得到的半抗原1，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解，加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.5mg、碳二亚胺(EDC)1.5mg，室温搅拌反应3h，得到半抗原溶液A液；取钥孔血蓝蛋白(KLH)10mg，加1mL PBS缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，4℃避光搅拌反应12h，用PBS缓冲液透析纯化两天，每天换液4次，得到与钥孔血蓝蛋白偶联的人工抗原，即人工抗原1，分装，-20℃保存。
取上述半抗原1、KLH、人工抗原1，分别用紫外全波长扫描法(200～400nm)进行鉴定。
2、鉴定
紫外全波长扫描鉴定结果如图3所示，比较偶连前后的KLH、半抗原1、人工抗原1的吸收曲线在280nm处的吸光值可知：人工抗原1的吸收曲线在此处的吸光值与半抗原1的吸收曲线吸光值接近，明显区别于KLH的吸收曲线，且相较于KLH的吸收曲线有一定的偏移。说明半抗原1与KLH偶联成功，本发明成功制备得到了人工免疫抗原1。
实施例4半抗原2的合成与鉴定
1、合成步骤
一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的半抗原2的制备方法，包括以下步骤：
S1.将1g比沙可啶溶解在10mL乙腈中，加入12mL 3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，55℃冷凝回流4h，用1M盐酸水溶液酸化，再用乙酸乙酯和水进行萃取，收集酯层，得到脱乙酰比沙可啶10.99g，转化率为99％。
S2.取步骤S1所得脱乙酰比沙可啶溶解于10mL乙腈，加入64μL 6-溴己酸乙酯，50℃冷凝回流10h，得到深紫色物质，用硅胶柱纯化，混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚的体积比为1:2)洗脱分离，将得到的洗脱产物溶于甲醇中，加入1mL3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，50℃搅拌2h，用乙酸乙酯和水萃取3次，调节pH至6～7，再用无水硫酸钠进行干燥，即得到半抗原2。
2、鉴定
半抗原2的MS-ESI+结果如下：MS:C24H25NO4:391，ESI+[M-H]+:392。
半抗原2的1H-NMR结果如下：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.51–8.46(m,2H),7.68(td,J＝7.7,1.9Hz,2H),7.21–7.14(m,4H),7.05(d,J＝2.0Hz,3H),7.04(s,1H),6.97–6.91(m,4H),6.83–6.78(m,4H),6.69–6.66(m,3H),5.44(s,2H),4.02(q,J＝7.1Hz,1H),3.87(t,J＝6.5Hz,4H),3.17(s,1H),2.09(s,1H),2.07(d,J＝7.4Hz,3H),1.97(s,2H),1.77(s,13H),1.65(p,J＝6.7Hz,4H),1.52(d,J＝7.6Hz,2H),1.49(d,J＝7.5Hz,2H),1.37(h,J＝7.1,6.3Hz,4H),1.16(t,J＝7.1Hz,2H)。
根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，衍生位点正确且成功，说明本发明成功制备得到了半抗原2，其结构式如式(Ⅲ)所示：
Figure BDA0003039896810000091
所述半抗原2采用系统命名法命名为6-(4-((4-hydroxyphenyl)(pyridin-2-yl)methyl)phenoxy)hexanoic acid，即6-(4-((4-羟基苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)己酸。
实施例5人工包被抗原2的合成与鉴定
1、合成
取5.5mg实施例4制备得到的半抗原2，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解，加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)2.4mg、碳二亚胺(EDC)8.0mg，室温搅拌反应3h，得到半抗原溶液A液；取卵清蛋白(OVA)10mg，加1mL PBS缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，4℃避光搅拌反应12h，用PBS缓冲液透析纯化两天，每天换液4次，得到与卵清蛋白偶联的人工抗原，即人工抗原2，分装，-20℃保存。
取上述半抗原2、OVA、人工抗原2，分别用紫外全波长扫描法(200～400nm)进行鉴定。
2、鉴定
紫外全波长扫描鉴定结果如图4所示，比较偶连前后的OVA、半抗原2、人工抗原2的吸收曲线在280nm处的吸光值可得：人工抗原2吸收曲线在该处的吸收值为半抗原2和OVA吸收曲线在该处吸收值的叠加，明显不同于OVA的吸收曲线，说明半抗原2与OVA成功偶联，成功制备得到了人工免疫抗原2。
实施例6抗体制备
用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体制备方法，包括以下步骤：
(1)取健康的6周的新西兰大白兔两只(雌、雄各一只)，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化后背部皮下多点注射，每只免疫剂量为500μg人工抗原1；之后每隔三周加强免疫，用弗氏不完全佐剂进行乳化，共加强免疫四次。
(2)第三次免疫后隔一周兔耳静脉取血，离心取上清，-20℃保存，用于ELISA检测免疫效果。
(3)第五次免疫后进行心脏取血，将所得兔血在37℃温育2h后，在4℃条件下放置过夜(12h)，第二天将水层清液取出，然后在4℃条件下，3000r/min离心10min，去除沉淀，获得上清液，分装，标记，-20℃保存，即得用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体。
实施例7比沙可啶、脱乙酰比沙可啶、匹可硫酸钠的间接竞争ELISA检测方法
1、实验方法
一种同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：
(1)将人工抗原2作为包被原，用包被液稀释至1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃孵育过夜(12h)；
(2)弃去包被液，洗涤2次，拍干；
(3)每孔加入120μL封闭液(即1％鱼胶蛋白)，37℃封闭30min；
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；
(5)用PBST 1:8000倍稀释抗体，并将比沙可啶、脱乙酰比沙可啶、匹可硫酸钠标准品分别稀释至1000ng/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL，0.001ng/mL；
(6)每孔加入50μL比沙可啶稀释液、50μL脱乙酰比沙可啶稀释液和50μL匹可硫酸钠稀释液(分别做三组平行)，最后一行不加药物稀释液，加50μLPBST，再加入50μL/孔的兔血清稀释液，37℃孵育40min，洗涤5次，拍干；
(7)加入羊抗兔二抗-HRP(4000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍干；
(8)加入显色液，每孔100μL，显色10min；
(9)加入50μL 10％H2SO4终止反应，并在450nm处读取OD值。
2、实验结果
用于检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体间接竞争ELISA标准曲线如图5～7所示，可知该抗体对比沙可啶的线性检测范围为0.36～7.33μg/kg，半抑制浓度IC50为1.63μg/kg，最低检测限为0.15μg/kg；对脱乙酰比沙可啶的线性检测范围为0.31～12.98μg/kg，半抑制浓度IC50为1.99μg/kg，最低检测限为0.10μg/kg；对匹可硫酸钠的线性检测范围为11.61～183.70μg/kg，半抑制浓度IC50为46.18μg/kg，最低检测限为5.18μg/kg。说明本发明制备得到的用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体可以满足检测需求。
实施例8抗体的特异性评价
1、实验方法
通过对比沙可啶、脱乙酰比沙可啶、匹可硫酸钠与其类似物进行交叉反应实验来确定该抗体的特异性，其抗体的特异性用交叉反应率(CR)表示，交叉反应率越小，特异性越强。将比沙可啶、脱乙酰比沙可啶、匹可硫酸钠及其类似物(双醋酚丁、酚酞、西布曲明)分别作倍比稀释，采用间接竞争ELISA法进行测定，步骤同实施例7的灵敏度验证方法，得到各类似物的IC50值，按照以下公式计算交叉反应率(CR)：
CR(％)＝IC50(脱乙酰比沙可啶)/IC50(类似物)×100％。
2、实验结果
减肥类保健食品中的三种非法添加物与其类似物的交叉反应结果如表1所示，可知用于检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体对脱乙酰比沙可啶的交叉反应率为100％，IC50为1.99μg/kg，对比沙可啶的交叉反应率为122％，IC50为1.63μg/kg，对匹可硫酸钠的交叉反应率为4％，IC50为46.18μg/kg，与双醋酚丁、酚酞、西布曲明的交叉反应率均小于1％；可以看出该抗体对本研究的减肥类保健食品中三种非法添加物的特异性较强，不与其他具有同种功效的减肥药发生交叉反应。
表1交叉反应实验结果
Figure BDA0003039896810000121
注：NR表示无反应。
实施例9添加回收率
1、实验方法
采用经测定不含有本研究的减肥类保健食品中三种非法添加物的青梅、减肥茶、减肥胶囊样品，分别添加比沙可啶、脱乙酰比沙可啶、匹可硫酸钠标准溶液，使总浓度分别为0μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg，进行添加回收率的测定。
2、实验结果
减肥类保健食品中三种非法添加物的添加回收率结果如表2所示，可知减肥类保健食品中三种非法添加物在5种不同总浓度时的添加回收率为90％～110％。
表2减肥类保健食品中三种非法添加物的添加回收率结果
Figure BDA0003039896810000131
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于同时检测减肥类保健食品中三种非法添加物的半抗原1，其特征在于，所述半抗原1的结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003039896800000011
2.权利要求1所述半抗原1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将比沙可啶溶解于溶剂中，加入碱性水溶液，45℃～55℃冷凝回流4～6h，调酸，萃取，得到脱乙酰比沙可啶；
S2.将步骤S1所得脱乙酰比沙可啶加入溶剂中溶解后，加入溴乙酸乙酯，45℃～55℃冷凝回流9～11h，纯化洗脱，水解，得到水解产物；
S3.将步骤S2所得水解产物调酸、萃取、干燥，得所述半抗原1。
3.权利要求1所述半抗原1在制备用于检测减肥类保健食品中三种非法添加物的人工抗原中的应用。
4.一种用于检测减肥类保健食品中三种非法添加物的人工抗原1，其特征在于，其结构式如式(II)所示：
Figure FDA0003039896800000012
其中，KLH为钥孔血蓝蛋白。
5.一种用于检测减肥类保健食品中三种非法添加物的半抗原2，其特征在于，其结构式如式(Ⅲ)所示：
Figure FDA0003039896800000021
6.权利要求5所述的半抗原2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将比沙可啶充分溶解于溶剂中，加入碱性水溶液，45℃～55℃冷凝回流4～6h，调酸，萃取，得到脱乙酰比沙可啶；
S2.将步骤S1所得脱乙酰比沙可啶加入溶剂中溶解后，加入6-溴己酸乙酯，45℃～55℃冷凝回流9～11h，纯化洗脱，水解，得到水解产物；
S3.将步骤S2所得水解产物调酸、萃取、干燥，得所述半抗原2。
7.一种用于检测减肥类保健食品中三种非法添加物的包被人工抗原2，其特征在于，其结构式如式(Ⅳ)所示：
Figure FDA0003039896800000022
其中，OVA为卵清蛋白。
8.权利要求1所述半抗原1或权利要求4所述人工抗原1在制备用于检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体中的应用。
9.一种用于检测减肥类保健食品中三种非法添加物的抗体，其特征在于，由权利要求4所述人工抗原1免疫新西兰大白兔制备得到。
10.一种检测减肥类保健食品中三种非法添加物的免疫分析方法，其特征在于，以权利要求7所述包被人工抗原2为包被原，以权利要求9所述抗体作为检测抗体进行检测；所述减肥类保健食品中三种非法添加物为比沙可啶、脱乙酰比沙可啶及匹可硫酸钠。
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