CN113248596B - 一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明制备得到人工抗原1和2，应用人工抗原1制备得到用于同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的双特异性抗体，应用人工抗原2作为人工包被原，该抗体对对乙酰氨基酚和非那西丁具有高灵敏度和高特异性的识别能力，最低检测限分别为2.8ng/mL和2.1ng/mL，对结构类似物的交叉反应率均低于0.1％，建立了对乙酰氨基酚和非那西丁的免疫分析方法，实现了快速准确检测食品中对乙酰氨基酚和非那西丁的目的。

Description

一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原、抗体 及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
对乙酰氨基酚(Acetaminophen)，属于乙酰苯胺类解热镇痛药，解热作用缓慢而持久，耐受性良好，是许多抗感冒和流感药物的主要成分，在治疗浓度下使用对乙酰氨基酚是安全的，但长期或者过量服用会导致肝损伤、急性肝衰竭甚至死亡。非那西丁(Phenacetin)是一种乙酰苯胺类解热镇痛药，药理作用类似于对乙酰氨基酚，但毒性较大，有研究表明长期或者过量服用损害肾脏，导致溶血性贫血，诱发癌症。
近年来有一些不法商家在草本植物饮料、酒类制品中添加这类解热镇痛药成分以达到治疗感冒和头痛的效果，消费者在不知情的情况下，饮用草本植物饮料或酒类制品可能会无谓增加药物摄入，对生命健康安全造成危害，因此，《食品安全法》第三十八条规定：生产经营的食品中不得添加药品，但是可以添加按照传统既是食品又是中药材的物质。对乙酰氨基酚和非那西丁属于药品，不得添加在食品中。
目前，检测食品中对乙酰氨基酚和非那西丁的方法有：《饮料、茶叶及相关制品中对乙酰氨基酚等59种化合物的测定》(BJS 201713)的高效液相色谱法(HPLC)或液相色谱-串联质谱测定法(HPLC-MS/MS)；专利《一种检测草本饮料中对乙酰氨基酚及其他化学药物的方法》(公开号CN107655993A)中利用超高效液相色谱技术，建立了同时检测草本饮料中包括对乙酰氨基酚和非那西丁在内的25种化合物快速检测方法；专利《一种同时对酒中解热镇痛类药品非法添加物定性定量检测的方法及应用》(公开号CN111650307A)中利用HPLC-MS/MS法，建立了同时检测酒中四种解热镇痛类非法添加物定性定量检测的方法。文献《高效液相色谱-串联质谱法测定凉茶中19种非法添加药物》利用HPLC-MS/MS法测定凉茶中19种非法添加药物；文献《凉茶中对乙酰氨基酚酶联免疫检测方法的研究》中通过制备特异性抗体，建立酶联免疫检测方法检测凉茶中对乙酰氨基酚。
这些方法中，仪器法虽然可以对样品中对乙酰氨基酚和非那西丁进行精确定量，但存在前处理相对复杂、检测周期长、设备昂贵、对操作人员有专业要求较高，只能实验室操作，难以满足现场快速检测的食品监管需求。而文献中所建立的凉茶中对乙酰氨基酚酶联免疫检测方法只能满足单一检测需求，因此，开发出一种可同时检测食品中对乙酰氨基酚和非那西丁的快速检测方法更具有应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中无法同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的缺陷和不足，提供一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
本发明的目的在于提供一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原。
本发明的目的在于提供2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酸作为半抗原在制备同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁人工抗原中的应用。
本发明的目的还在于提供一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的抗体。
本发明的目的还在于提供所述抗体在同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁中的应用。
本发明的目的还在于提供一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的免疫分析方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酸作为半抗原在制备同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁人工抗原中的应用，已知，2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酸结构式如式(I)所示，本发明研究表明可利用对乙酰氨基酚衍生物-2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酸作为半抗原制备同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁人工抗原；
Figure BDA0003022561460000031
一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原1，其结构式如式(II)所示，
Figure BDA0003022561460000032
所述人工抗原1的制备方法：以2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酸(ACE1)为半抗原，通过活泼酯法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
S1.将半抗原ACE1、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下避光搅拌，得到半抗原ACE1活化液；
S2.将载体蛋白加入到PBS缓冲液中；
S3.将半抗原ACE1活化液加入载体蛋白溶液中，4℃反应；
S4.用PBS缓冲液透析S3所得反应液即得人工抗原1。
优选地，步骤S1所述搅拌时间为2～4h。
优选地，步骤S1所述ACE1、NHS与EDC的质量比为1:0.1～1:1～3。
进一步优选地，步骤S1所述ACE1、NHS与EDC的质量比为1:0.8:2.6。
优选地，步骤S2所述载体蛋白与PBS缓冲液的质量体积比为10mg:1mL。
优选地，步骤S2、S4所述PBS缓冲液浓度为0.01moL/L，pH＝7.4。
优选地，步骤S3所述反应时间为12h。
优选地，步骤S4所述透析为3天，每天3次。
一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原2，其结构式如式(III)所示，
Figure BDA0003022561460000041
所述人工抗原2的制备方法：以对乙酰氨基酚(ACE2)为半抗原，通过羰基二咪唑法偶联载体蛋白。已知，对乙酰氨基酚结构式如式(IV)所示，
Figure BDA0003022561460000042
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原2的制备方法，包括如下步骤：
S1.将ACE2和羰基二咪唑(CDI)溶解于DMF中，室温下避光搅拌，得到半抗原ACE2活化液；
S2.将载体蛋白加入到PBS缓冲液中；
S3.将半抗原ACE2活化液缓慢逐滴加入载体蛋白溶液中，4℃反应；
S4.用PBS缓冲液透析即得人工抗原2。
优选地，步骤S1所述搅拌为搅拌过夜。
优选地，步骤S1所述ACE2、CDI的质量比为1:1～10。
进一步优选地，步骤S1所述ACE2、CDI的质量比为1:5。
优选地，步骤S2所述载体蛋白与PBS缓冲液的质量体积比为10mg:1mL。
优选地，步骤S2、S4所述PBS缓冲液浓度为0.01moL/L，pH＝7.4。
优选地，步骤S3所述反应时间为12h。
优选地，步骤S4所述透析为3天，每天3次。
上述制备方法中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白任意一种或几种。
优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白中的一种或两种。
一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原组，以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(ACE1-BSA)或人工抗原2(ACE2-BSA)作为人工免疫原，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原1(ACE1-OVA)或人工抗原2(ACE2-OVA)作为人工包被原。
优选地，所述人工抗原组以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(ACE1-BSA)作为人工免疫原，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原2(ACE2-OVA)作为人工包被原。
所述人工抗原组在同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁中的应用，也在本发明的保护范围之内。
一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的双特异性抗体，所述抗体由人工抗原1或人工抗原2免疫动物制备得到。
优选地，所述双特异性抗体为单克隆抗体、多克隆抗体中一种或两种。
所述抗体在同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁中的应用，也在本发明的保护范围之内。
一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的试剂盒，包含以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(ACE1-BSA)或人工抗原2(ACE2-BSA)作为人工免疫原，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原1(ACE1-OVA)或人工抗原2(ACE2-OVA)作为人工包被原的人工抗原组和人工抗原1(ACE1-BSA)或人工抗原2(ACE2-BSA)免疫动物制备得到的双特异性抗体。
优选地，所述试剂盒包含以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(ACE1-BSA)作为人工免疫原，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原2(ACE2-OVA)作为人工包被原的人工抗原组和人工抗原1(ACE1-BSA)免疫动物制备得到的双特异性抗体。
一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的免疫分析方法，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原1(ACE1-OVA)或人工抗原2(ACE2-OVA)为人工包被原，以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(ACE1-BSA)或人工抗原2(ACE2-BSA)为人工免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原2(ACE2-OVA)作为人工包被原，以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(ACE1-BSA)作为人工免疫原免疫动物制备得到的双特异性抗体为检测抗体进行检测。
优选地，所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明制备得到人工抗原1和2，应用人工抗原1(ACE1-BSA)制备得到用于同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的双特异性抗体，应用人工抗原2(ACE2-OVA)作为人工包被原，该抗体对对乙酰氨基酚和非那西丁具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度分别为33ng/mL和24ng/mL，最低检测限分别为2.8ng/mL和2.1ng/mL，对结构类似物的交叉反应率均低于0.1％，表明该抗体对对乙酰氨基酚和非那西丁具有极高的特异性，可有效的排除其类似物的干扰，为建立对乙酰氨基酚和非那西丁的酶联免疫检测方法提供了核心试剂。本发明利用同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁双特异性抗体实现了在食品中对乙酰氨基酚和非那西丁的免疫快速检测的应用。
附图说明
图1为BSA、ACE1与ACE1-BSA的紫外光谱图。
图2为BSA、ACE2与ACE2-BSA紫外光谱图。
图3为OVA、ACE1与ACE1-OVA的紫外光谱图。
图4为OVA、ACE2与ACE2-OVA的紫外光谱图。
图5为对乙酰氨基酚和非那西丁ELISA检测标准曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1半抗原ACE1的合成与鉴定
1.半抗原ACE1的合成
取N-(4-羟苯基)乙酰胺(N-(4-hydroxyphenyl)acetamide)(1moL)，碳酸钾(1～4moL)，以丙酮作为溶剂，与溴乙酸乙酯(1～2moL)在室温搅拌下反应3～8h，分离纯化得2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酸乙酯(ethyl2-(4-acetamidophenoxy)acetate)。将2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酸乙酯溶解于甲醇，2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酸乙酯与甲醇的体积比为1:1，加入1mol/L的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应2～5h，反应结束后用1mol/L盐酸调节pH为5～6，即得半抗原ACE1。
2.半抗原ACE1的鉴定
对制备得到的半抗原ACE1进行核磁共振氢谱鉴定和质谱确定。
半抗原ACE1的核磁共振氢谱结果：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.43(d,J＝8.7Hz,1H),6.90(d,J＝9.0Hz,1H),4.40(s,1H),2.11(s,1H).
半抗原ACE1的质谱结果：MS：C10H11NO4：209.07，ESI-[M-H]-:：207.9。
半抗原ACE1的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003022561460000071
半抗原ACE1采用系统命名法命名为2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酸。
实施例2人工抗原的合成和鉴定
1、人工抗原的合成
(1)人工抗原ACE1-BSA/OVA的合成
半抗原ACE1通过活泼酯法分别偶联牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)。
分别称取1moL半抗原ACE1、0.8moL NHS和2.6moL EDC溶解于50～200μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下避光搅拌2～4h，得到ACE1半抗原活化液；将10mg BSA或OVA加入到1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；将ACE1半抗原活化液缓慢逐滴加入BSA或OVA溶液中，4℃反应12h；用PBS缓冲液透析3天，每天3次，透析结束后即得人工抗原ACE1-BSA/OVA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
(1)人工抗原ACE2-BSA/OVA的合成
半抗原ACE2通过羰基二咪唑法分别偶联牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)。
分别称取1moL半抗原ACE2、5moL羰基二咪唑(CDI)溶解于50～200μLDMF中，室温下避光搅拌过夜，得到ACE2半抗原活化液；将10mg BSA或OVA加入到1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；将ACE2半抗原活化液缓慢逐滴加入BSA或OVA溶液中，4℃反应12h；用PBS缓冲液透析3天，每天3次，透析结束后即得人工抗原ACE2-BSA/OVA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
其中，PBS缓冲液的配方：Na2HPO4·12H2O 14.5g，NaCl 32.50g，KCl 1.0g，KH2PO41.0g，加蒸馏水定容至5000mL。
2、人工抗原的鉴定
(1)取上述合成的ACE1-BSA，进行紫外扫描，结果如图1所示。
具体地，BSA、ACE1、ACE1-BSA分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现人工抗原ACE1-BSA的吸收曲线与载体蛋白BSA明显不同，ACE1在272nm处有一个特征峰，BSA在230nm和280nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在250nm处，ACE1-BSA出现了一个明显的吸收峰，且对比ACE1的曲线和BSA的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与ACE1的复合物，偶联成功。
(2)取上述合成的ACE2-BSA，进行紫外扫描，结果如图2所示。
具体地，BSA、ACE2、ACE2-BSA分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现人工抗原ACE2-BSA的吸收曲线与载体蛋白BSA明显不同，ACE2在250nm处有一个特征峰，载体蛋白BSA在230nm和280nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，ACE2-BSA在220nm处有一明显吸收峰，对比BSA的曲线可看出发生显著位移。ACE2-BSA在250nm处对比BSA曲线也有显著吸收，由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此250nm处的特征吸收是由蛋白结合的药物分子贡献的，综上说明反应产物是载体蛋白与ACE2的复合物，偶联成功。
(3)取上述合成的ACE1-OVA，进行紫外扫描，结果如图3所示。
具体地，OVA、ACE1、ACE1-OVA分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现人工包被原ACE1-OVA的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，ACE1在272nm处有一个特征峰，OVA在230nm和280nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在240nm～280nm处，ACE1-OVA存在明显的吸收，且对比ACE1的曲线和OVA的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的特征吸收是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与ACE1的复合物，偶联成功。
(4)取上述合成的ACE2-OVA，进行紫外扫描，结果如图4所示。
具体地，OVA、ACE2、ACE2-OVA分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现人工包被原ACE2-OVA的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，ACE2在250nm处有一个特征峰，载体蛋白BSA在230nm和280nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，ACE2-OVA在250nm处对比OVA曲线也有显著吸收，由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此250nm处的特征吸收是由蛋白结合的药物分子贡献的，综上说明反应产物是载体蛋白与ACE2的复合物，偶联成功。
实施例3同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁双特异性抗体的制备
1、多克隆抗体制备，具体步骤如下所示：
用实施例2制备得到的人工抗原ACE1-BSA与免疫佐剂(首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按体积比1:1乳化均匀，免疫新西兰大白兔。所述新西兰大白兔体重为2.5～3kg，采用颈部和背部皮下多点注射，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，收集到的血获得血清的方式为：在37℃下温浴0.5～1h，然后在4℃下静置过夜，再用吸管吸取析出来的血清，接着在4℃下，3000～5000rpm离心10min，取上清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
2、单克隆抗体制备，具体步骤如下所示：
用实施例2制备得到的人工抗原ACE1-BSA免疫雌性Bal b/c小鼠。取人工抗原ACE1-BSA与等体积的免疫佐剂(首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀后，采用腹部皮下多点注射法免疫小鼠，每次加强免疫1周后，尾部取血测定抗血清效价。待效价稳定不变时，选取免疫效果最好的小鼠加强一次免疫，3天后取脾细胞进行融合，制备单克隆抗体。
实施例4人工免疫原和人工包被原组合优化
分别用实施例2制备的人工抗原ACE1-BSA和ACE2-BSA免疫新西兰大白兔制备抗体，对人工包被原ACE1-OVA，ACE2-OVA进行筛选，经ELISA检测人工抗原免疫新西兰大白兔所获得的抗血清效价和抑制率。4组人工抗原和人工包被原组合的效价和抑制率如表1所示。
具体操作步骤如下：
(1)将人工包被原ACE1-OVA，ACE2-OVA分别用包被液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH9.6)稀释至500ng/mL的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃恒温水浴箱温育过夜，弃包被液，洗涤2次；
(2)每孔加入120μL封闭液(1％的鱼胶蛋白溶液)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；
(3)将抗血清用PBST稀释为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000，同时设置空白对照孔(用PBST代替)；用PBST将1mg/mL稀释1000倍，为1μg/mL；
用PBST将1mg/mL药物(对乙酰氨基酚和非那西丁)稀释1000倍，为1μg/mL；
效价列：先每孔加50μL的PBST，后将倍比稀释的抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；
抑制列：先每孔加50μL的药物，后将倍比稀释的抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；
在37℃下温育40min，洗涤5次，拍板；
(4)加入羊抗兔IgG-HRP(5000倍稀释)，用PBST稀释羊抗兔IgG-HRP，每孔加100μL，在37℃下温育30min，洗涤5次，拍板；
(5)加入显色液，每孔加100μL，在37℃下温浴显色10min；
(6)加入终止液(10％H2SO4)终止反应，每孔加50μL，并在450nm处读取OD值。
效价是OD450为1.0左右所对应的抗血清稀释倍数。
抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/抑制的OD值*100％
表1 4组人工免疫原和人工包被原组合的效价和抑制率
Figure BDA0003022561460000101
表1中可以看出，人工抗原ACE1-BSA和ACE2-BSA作为人工免疫原免疫新西兰大白兔产生的抗血清均有一定效价，同时，所得抗血清对目标分析物对乙酰氨基酚和非那西丁均有不同程度的抑制效果。其中，编号1的人工免疫原和人工包被原组合所示的抗血清效价1:64000，对乙酰氨基酚的抑制率为71％，非那西丁的抑制率为75％为最佳组合，在该组合下，双特异性抗体不仅能特异性识别目标分析物对乙酰氨基酚和非那西丁，而且抗体灵敏度较好。抑制率高于编号2、3、4的人工免疫原和人工包被原组合，虽然编号2的人工免疫原和人工包被原组合所示的抗血清效价比编号1的人工免疫原和人工包被原组合所示的抗血清效价高，但是这两个组合对两种药物的抑制率远低于编号1组合对两种药物的抑制率，故编号1的人工免疫原和人工包被原组合为最佳组合，即将ACE1-BSA作为人工免疫原、ACE2-OVA作为人工包被原。
实施例5对乙酰氨基酚和非那西丁的间接竞争酶联免疫分析方法(ELISA)的建立
1、标准曲线的建立
对乙酰氨基酚和非那西丁双特异性抗体灵敏度的测定，通过建立基于对乙酰氨基酚和非那西丁双特异性抗体的ELISA标准曲线，并求出半数抑制量浓度IC50来表示。
标准曲线建立具体步骤包括：
(1)将实施例3制备的同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁双特异性的多克隆抗体用PBST稀释为1:8000，同时设置空白对照孔(用PBST代替)；
(2)将人工包被原ACE2-OVA用包被液稀释至250ng/mL的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃恒温水浴箱温育12h，弃去包被液，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗涤2次，拍干；
(3)每孔加入120μL封闭液(1％的鱼胶蛋白溶液)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；
(4)用PBST分别将对乙酰氨基酚和非那西丁稀释至100000.00，10000.00，1000.00，100.00，10.00，0.10，0.01，0ng/mL；
(5)每孔加50μL对乙酰氨基酚和非那西丁稀释液，浓度分别为100000.00，10000.00，1000.00，100.00，10.00，0.10，0.01ng/mL(分别做三组平行)，浓度为0ng/mL的孔加入50μL/孔PBST稀释液，再加入步骤(1)所述抗体稀释液，每孔加50μL。在37℃下温育40min后，弃去孔中液体，用洗涤5次，拍干；
(6)加入羊抗兔IgG-HRP(5000倍稀释)，在37℃下温育30min后，弃去孔中液体，洗涤5次，拍干；
(7)每孔加100μL显色液，在37℃下温育显色10min；
(8)加入终止液(10％H2SO4)终止反应，每孔加50μL，并在450nm处读取OD值。
其中PBST的配方为：Na2HPO4·12H2O 14.50g，NaCl 42.50g，KCl 1.00g，KH2PO41.00g，Tween-20 3.0mL，加蒸馏水定容至5000mL。
1％的鱼胶蛋白溶液配制：如将0.01g鱼胶蛋白粉溶解于1mL PBST中，具体的按实际用量计算。
以对乙酰氨基酚和非那西丁为标准品建立ELISA的标准曲线如图5所述，由图可知，以对乙酰氨基酚和非那西丁为标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度好；对乙酰氨基酚和非那西丁的最低检测限分别为2.8ng/mL和2.1ng/mL，半抑制浓度为33ng/mL和24ng/mL。
2、方法特异性测定
方法特异性用交叉反应率(CR)表示。选择对乙酰氨基酚、非那西丁与其类似物进行交叉反应实验，分别建立标准曲线并计算半数抑制浓度IC50，交叉反应越小，特异性越好。
将每种交叉反应药物分别做系列稀释，采用间接竞争ELISA方法测定，步骤参考标准曲线建立的实验方法，得到各类似物的IC50值。用以下公式计算对乙酰氨基酚、非那西丁及各类似物的交叉反应率(CR)：
Figure BDA0003022561460000121
交叉反应实验结果如表2所示，从表2中可知，该双特异性抗体对对乙酰氨基酚和非那西丁的交叉反应率分别为100％和115％，IC50值分别为33ng/mL和24ng/mL，可实现同时检测的目的，而对其类似物无反应或其交叉反应率均小于0.1％；该双特异性抗体具有极高的特异性，可有效的排除其类似物的干扰，建立的间接竞争酶联免疫分析方法切实可靠。
表2 交叉反应实验结果
Figure BDA0003022561460000131
注：NR表示无反应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的人工抗原组，其特征在于，所述人工抗原组由人工抗原1和人工抗原2组成，以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1作为人工免疫原，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原2作为人工包被原；
所述人工抗原1的结构式如式(II)所示，
Figure 170125DEST_PATH_IMAGE001
式(II) ；
所述人工抗原2的结构式如式(III)所示，
Figure 565335DEST_PATH_IMAGE002
式(III) 。
2.权利要求1所述人工抗原组在同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁中的应用，其特征在于，所述检测为非疾病治疗诊断目的的检测。
3.一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的试剂盒，其特征在于，包含以权利要求1中所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原2为人工包被原，以权利要求1中所述载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1为人工免疫原免疫动物制备得到的抗体。
4.一种可同时检测对乙酰氨基酚和非那西丁的非疾病治疗诊断目的的免疫分析方法，其特征在于，以权利要求1中所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原2为人工包被原，以权利要求1中所述载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1为人工免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
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