CN114644572B - 一种溴己新半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种溴己新半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种溴己新半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。所述溴己新半抗原的结构式如式(I)所示，应用该半抗原制备得到用于检测溴己新的人工抗原和抗体，该抗体对溴己新具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为4.57ng/mL，最低检测限为0.41ng/mL，定量检测范围为0.85～35.11ng/mL，为建立特异性检测溴己新的免疫分析方法提供了核心原材料。同时本发明还建立了特异性和灵敏度更高的溴己新的免疫分析方法，此外，利用该人工抗原、抗体开发了一种检测溴己新残留的试剂盒，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

Description

一种溴己新半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，更具体地，涉及一种溴己新半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
溴己新是一种祛痰药，可直接作用于支气管腺体，促使粘液分泌细胞的溶酶体释出，使痰中的粘多糖纤维分化裂解，主要用于急性及慢性支气管炎、哮喘、支气管扩张、肺气肿等症状。长期过量服用对胃肠道粘膜可能造成较大刺激，从而导致恶心、胃部不适等症状。因其较强的祛痰功效，常被多数不法商家添加到自制凉茶中以鼓吹功效，对消费者的身体健康与市场秩序造成了极大地危害。
目前我国并没有针对溴己新的标准检测方法，针对凉茶中非法添加溴己新的检测方法更是一片空白，但市场实际抽查中已经发现有市售凉茶中添加溴己新的情况存在。现有国内目前对于溴己新的检测方法较少，主要有高效液相色法(刘淑华,赵志刚.HPLC法测定盐酸溴己新及其片剂的含量[J].中国药事,2008,022(001):68-69,79.)、近红外光谱法(谢洪平,徐乃玉,李一林,等.近红外光谱法快速测定复方氯丙那林溴己新胶囊的3种有效成分[J].中国医院药学杂志,2006,26(10):3.)、化学发光法(刘梅,崔香.流动注射化学发光法测定盐酸溴己新[J].光谱实验室,2011,28(005):2373-2375.)等。这些方法虽然具有检测效率高，检测量大，准确度高等优点，但是检测的设备较为昂贵，样品前处理的过程较为繁琐且需要专业人员操作，不适合大批量样品的现场检测要求，且检测对象大多为祛痰类药物。因此，急需开发一种快速、准确、高效、稳定的检测食品中溴己新的方法。免疫检测方法作为一种高效快速简便的快检方法，具有灵敏度高，特异性强，检测方便等优点。因此，建立一种针对凉茶中非法添加溴己新的免疫检测方法就显得尤为迫切。而免疫检测方法的建立，关键在于设计出合适的溴己新人工抗原并获得灵敏度高、特异性强的抗体，但是目前还未见有关于溴己新的半抗原、人工抗原、抗体等的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中缺少溴己新半抗原、人工抗原、抗体的缺陷和不足，提供一种溴己新半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的在于提供一种溴己新半抗原。
本发明的第二个目的在于提供所述溴己新半抗原的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种基于所述溴己新半抗原的溴己新人工抗原。
本发明的第四个目的在于提供所述溴己新人工抗原的制备方法。
本发明的第五个目在于提供一种基于所述溴己新人工抗原的溴己新抗体。
本发明的第六个目在于提供一种溴己新检测试剂盒。
本发明的第七个目在于提供一种检测溴己新的免疫分析方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种溴己新半抗原BOX-SA，所述半抗原的结构式如式(I)所示：
Figure GDA0004073788020000021
所述半抗原BOX-SA采用系统命名法为：4-((2,4-二溴-6-((环己基(甲基)氨基)甲基)苯基)氨基)-4-氧代丁酸。
本发明还提供所述溴己新半抗原的制备方法，是将溴己新与丁二酸酐和吡啶在溶剂中进行反应，分离纯化得到的反应产物经旋干后，加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，酯层用无水硫酸钠干燥，浓缩后即得式(I)所示溴己新半抗原BOX-SA。
优选地，所述溶剂为二甲基亚砜。
进一步优选地，所述溴己新和二甲基亚砜的质量体积比为15～20mg:1mL。
更优选地，所述溴己新和二甲基亚砜的质量体积比为20mg:1mL。
优选地，所述丁二酸酐和溴己新的质量比为2～4:1。
更优选地，所述丁二酸酐和溴己新的质量比为2:1。
本发明还提供所述溴己新半抗原在制备溴己新人工抗原中的应用。
一种溴己新人工抗原，所述溴己新人工抗原的结构式如式(Ⅱ)所示：
Figure GDA0004073788020000031
其中，P为载体蛋白。
优选地，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)、乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)或鸡卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)。
本发明还提供所述溴己新人工抗原的制备方法，是通过活泼酯法在式(I)所示溴己新半抗原的羧基上偶联载体蛋白。
作为一种优选地可实施方式，所述溴己新人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将BOX-SA与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下避光搅拌2～4h，得到BOX-SA活化液；
(2)将载体蛋白加入到PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；
(3)将步骤(1)的BOX-SA活化液缓慢逐滴加入步骤(2)的载体蛋白缓冲溶液中，4℃反应12h；
(4)用PBS缓冲液透析步骤(3)所得反应液，即得溴己新人工抗原。
优选地，步骤(1)中所述BOX-SA、NHS与EDC的质量比为1～2:1～2:2～3。
更优选地，步骤(1)中所述BOX-SA、NHS与EDC的质量比为1.5:2:2。
优选地，步骤(2)中所述载体蛋白与PBS缓冲液的质量体积比为5mg:1mL。
优选地，步骤(1)中所述BOX-SA与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为1～5:3～8。
更优选地，步骤(1)中所述BOX-SA与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为1:6。
本发明还提供上述任一所述溴己新人工抗原在制备溴己新抗体中的应用。
本发明还提供一种溴己新抗体，是以上述式(II)所示溴己新人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。
优选地，所述免疫原为载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的溴己新人工抗原(BOX-SA-OVA)或载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)的溴己新人工抗原(BOX-SA-KLH)。
优选地，所述溴己新抗体为溴己新多克隆抗体。
作为一种优选地可实施方式，溴所述溴己新多克隆抗体的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将制备好的BOX-SA偶联钥孔血蓝蛋白的人工抗原(BOX-SA-KLH)和偶联乳铁蛋白的人工抗原(BOX-SA-LF)作为免疫原与等量的免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫动物。将2.5～3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。
(2)加强免疫一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000rpm/min离心15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体。
本发明还提供所述溴己新人工抗原和/或溴己新抗体在溴己新免疫检测分析中的应用或在制备溴己新检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种溴己新检测试剂盒，所述试剂盒包含上述任一所述溴己新人工抗原作为包被原和上述任一所述溴己新抗体。
优选地，所述抗体为以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的溴己新人工抗原(BOX-SA-LF)或以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)的溴己新人工抗原(BOX-SA-KLH)免疫动物制备得到的抗体。
进一步优选地，所述抗体为以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)的溴己新人工抗原(BOX-SA-KLH)免疫动物得到的多克隆抗体。
进一步优选地，所述包被原为以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的溴己新人工抗原(BOX-SA-OVA)。
优选地，所述试剂盒还包括酶标板、溴己新标准品、酶结合物、显色液、终止液或洗涤液中的一种或多种。
进一步的优选地，所述试剂盒还包括所述溴己新人工抗原包被的酶标板、溴己新标准品溶液、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液。
进一步优选地，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的溴己新抗体。
进一步优选地，所述试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被包被抗原，样本中残留的溴己新和酶标板微孔条上预包被的包被抗原竞争抗溴己新的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物溴己新的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中溴己新的残留量。
优选地，所述溴己新标准品溶液为9个浓度梯度，分别是1000μg/L，250μg/L，62.5μg/L，15.63μg/L，3.91μg/L，0.98μg/L，0.25μg/L，0.06μg/L，0.01μg/L。
优选地，所述显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
优选地，所述终止液为1～2mol/L的硫酸溶液。
优选地，所述洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；所述百分比为重量体积百分比。
优选地，上述酶标板的制备方法为：用包被缓冲液将包被原稀释成31.25μg/L，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μL封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
优选地，上述酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；所述百分比为重量体积百分比。
一种检测溴己新的免疫分析方法，是以上述任一所述溴己新人工抗原为包被原，以上述任一所述溴己新抗体为检测抗体进行检测。所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。
优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的溴己新人工抗原(BOX-SA-OVA)为抗原，以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)的溴己新人工抗原(BOX-SA-KLH)为免疫原免疫动物制备得到的多克隆抗体为检测抗体进行检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了式(I)所示的溴己新半抗原BOX-SA，应用该半抗原制备得到了用于检测溴己新的溴己新人工抗原和抗体，该抗体对溴己新具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为4.57ng/mL，最低检测限为0.41ng/mL，定量检测范围为0.85～35.11ng/mL，为建立特异性检测溴己新的免疫分析方法提供了核心原材料。同时本发明还建立了特异性和灵敏度更高的溴己新的免疫分析方法，此外，利用该人工抗原、抗体开发了一种检测溴己新残留的试剂盒，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。
附图说明
图1为本发明实施例1的溴己新半抗原(BOX-SA)的合成路线图。
图2为本发明实施例2的BOX-SA、KLH、BOX-SA-KLH紫外扫描图。
图3为本发明实施例2的BOX-SA、LF、BOX-SA-LF紫外扫描图。
图4为本发明实施例2的BOX-SA、OVA、BOX-SA-OVA紫外扫描图。
图5为本发明实施例5的溴己新的抗体间接竞争ELISA标准曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1溴己新半抗原的制备与鉴定
1、溴己新半抗原(BOX-SA)的制备
在圆底烧瓶中加入80mg溴己新，加入3mL二甲基亚砜溶解，然后加入60mg丁二酸酐和8mg吡啶，室温反应6h。以TLC监控至反应完毕，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(3:1，v/v)。再通过硅胶柱层析纯化将得到反应产物，收集产物经旋转蒸发仪纯化旋干后，以乙酸乙酯和饱和氯化钠分别进行萃取两次，向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠干燥，浓缩后即得溴己新半抗原(BOX-SA)。BOX-SA的合成路线图如图1所示。
2、溴己新半抗原(BOX-SA)的鉴定
BOX-SA的核磁共振氢谱结果：1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：12.18(s,1H),10.94(brs,1H),8.05(br d,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,1H),2.94～3.01(m,2H),2.84(dd,J＝7.5,5.5Hz,2H),2.70(dd,J＝7.5,5.6Hz,2H).2.49(dd,J1＝8.8Hz,J2＝14.4Hz,1H),2.33(s,3H),2.11(dd,J1＝8.8Hz,J2＝17.4Hz,4H),1.42～1.71(m,6H)；
BOX-SA的质谱结果为：MS：C18H24Br2N2O3：476.21，ESI+[M-H]+:477.1。
根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，衍生位点正确且成功，说明本发明成功合成了目标产物溴己新半抗原BOX-SA，其结构式如式(I)所示：
Figure GDA0004073788020000071
BOX-SA采用系统命名法命名为：4-((2,4-dibromo-6-((cyclohexyl(methyl)amino)methyl)phenyl)amino)-4-oxobutanoic acid，即4-((2,4-二溴-6-((环己基(甲基)氨基)甲基)苯基)氨基)-4-氧代丁酸。
实施例2溴己新人工抗原的合成和鉴定
1、溴己新人工抗原的合成
将实施例1制备的溴己新半抗原(BOX-SA)，通过活泼酯法偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)、鸡卵清白蛋白(OVA)和乳铁蛋白(LF)。
(1)分别称取10mg实施例1制备的BOX-SA，5.15mg的NHS和7.67mg的EDC溶解于200uL DMF中，室温下避光搅拌4～6h得到溴己新半抗原活化液；
(2)分别称取10mg钥孔血蓝蛋白(KLH)、乳铁蛋白(LF)和鸡卵清白蛋白(OVA)加入到2mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；
(3)将步骤(1)所得溴己新半抗原活化液逐滴缓慢加入到步骤(2)所得载体蛋白缓冲溶液中，4℃搅拌12h；
(4)用PBS缓冲液透析三天，每天3次，透析结束后得到溴己新人工抗原(BOX-SA-KLH、BOX-SA-OVA、BOX-SA-LF)，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
其中，磷酸盐缓冲溶液的配方：Na2HPO4·12H2O 2.90g，NaCl 8.50g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.20g，加蒸馏水定容至1000mL。
2、溴己新人工抗原的鉴定
取上述合成的溴己新人工抗原(BOX-SA-KLH、BOX-SA-OVA、BOX-SA-LF)，进行紫外全波长扫描，结果如图2、图3和图4所示。
具体地，KLH、BOX-SA、BOX-SA-KLH分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，结果如图2所示，发现溴己新免疫原BOX-SA-KLH的吸收曲线与载体蛋白KLH明显不同，BOX-SA在295nm和320处各有一个特征峰，而偶联反应后，在225nm和280nm处，BOX-SA-KLH的吸收峰明显比KLH高，且对比BOX-SA的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白KLH与BOX-SA的复合物，BOX-SA-KLH偶联成功。
具体地，OVA、BOX-SA、BOX-SA-OVA分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，结果如图4所示，发现溴己新人工抗原BOX-SA-OVA的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，BOX-SA在295nm和320nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在225nm和280nm处，BOX-SA-OVA的吸收峰明显比OVA高，且对比BOX-SA的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白OVA与BOX-SA的复合物，BOX-SA-OVA偶联成功。
具体地，LF、BOX-SA、BOX-SA-LF分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，结果如图3所示，发现溴己新人工抗原BOX-SA-LF的吸收曲线与载体蛋白LF明显不同，BOX-SA在295nm和320nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在225nm和280nm处，BOX-SA-LF的吸收峰明显比LF高，且对比BOX-SA的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白LF与BOX-SA的复合物，BOX-SA-LF偶联成功。
实施例3抗体的制备
1、多克隆抗体的制备
将实施例2制备的BOX-SA偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)和乳铁蛋白(LF)的溴己新人工抗原BOX-SA-KLH、BOX-SA-LF作为免疫原，与等量的免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫动物。将2.5～3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。加强免疫一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000rpm/min离心15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化后得到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
2、单克隆抗体的制备
将实施例2制备的BOX-SA偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)和乳铁蛋白(LF)的溴己新人工抗原BOX-SA-KLH、BOX-SA-LF作为免疫原，与等量的免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫巴比西小鼠，采用腹部皮下多点注射法免疫小鼠，每次加强免疫1周后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价，待抗体效价不再升高后，再进行一次加强免疫，7天后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合。采用HAT培养基中筛选出杂交瘤细胞后用完全培养基进行细胞培养。用ic-ELISA方法对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，一周后再次检测、挑孔、再克隆。经3次克隆培养检测后，获得单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。腹水用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后得到单克隆抗体，-20℃冻存备用。
实施例4溴己新免疫原和包被原的筛选
分别利用实施例3的BOX-SA-KLH和BOX-SA-LF作为免疫原免疫动物后得到的抗体，通过间接竞争ELISA方法进行包被原的筛选，以实施例2制备得到的人工抗原BOX-SA-KLH、BOX-SA-LF和BOX-SA-OVA作为包被原；通过间接竞争ELISA方法获得的血清效价和抑制率来选择最佳的免疫原和包被原。
一种筛选溴己新免疫原和包被原的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：
(1)分别将实施例2制备的人工抗原BOX-SA-KLH、BOX-SA-OVA和BOX-SA-LF作为包被原，用包被液稀释至1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育过夜(12h)；
(2)弃去包被液，洗涤2次，拍干；
(3)每孔加入120μL封闭液(即1wt％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出；
(5)用PBST将实施例3制备的溴己新多克隆抗体倍比稀释成八个梯度，即1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000，同时设置空白对照孔(用PBST代替)；并将溴己新药物稀释至1μg/mL；
(6)效价列：每孔加50μL的PBST，再将倍比稀释得到抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；
抑制列：每孔加50μL的药物，再将倍比稀释得到抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；在37℃温育40min，洗涤5次，拍干；
(7)加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
(8)加入显色液，每孔100μL，显色10min；
(9)加入50μL 2mol/L的H2SO4溶液终止反应，并在450nm处读取OD值。
效价是OD450为1.0左右所对应的抗体稀释倍数。
抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/抑制的OD值*100％。
不同免疫原与包被原组合的血清效价和抑制率结果如表1所示。
表1不同免疫原与包被原组合的血清效价和抑制率
Figure GDA0004073788020000111
从表1中可以看出，不同的溴己新人工抗原作为免疫原免疫的新西兰大白兔产生的抗体均有一定的效价；同时，所得抗体对目标分析物溴己新均有不同程度的抑制效果。其中，编号1的免疫原和包被原组合所示的效价1:256000和抑制率90.00％，高于编号2、3、4的免疫原和包被原组合的效价和抑制率，由此可以说明编号1的免疫原和包被原不仅能特异性识别目标分析物溴己新，而且抗体灵敏度好，故将BOX-SA-KLH作为最佳的免疫原、BOX-SA-OVA作为最佳的包被原。
实施例5溴己新的间接竞争ELISA检测方法的建立
1、实验方法
一种检测溴己新的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：
(1)将实施例2制备的人工抗原BOX-SA-OVA作为包被原，用包被液稀释至62.5μg/L，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育过夜(12h)；
(2)弃去包被液，洗涤2次，拍干；
(3)每孔加入120μL封闭液(即1wt％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出；
(5)用PBST将BOX-SA-KLH制备的溴己新多克隆抗体稀释16000倍，并将溴己新药物稀释至1000μg/L，250μg/L，62.5μg/L，15.63μg/L，3.91μg/L，0.98μg/L，0.25μg/L，0.06μg/L；
(6)每行加50μL溴己新药物稀释液(三组平行)，再加入50μL/孔16000倍稀释的的溴己新多克隆抗体稀释液，在37℃温育40min，洗涤5次，拍干；
(7)加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
(8)加入显色液，每孔100μL，显色10min；
(9)加入50μL 2mol/L的H2SO4溶液终止反应，并在450nm处读取OD值。
2、实验结果
用于检测溴己新的抗体间接竞争ELISA标准曲线如图5所示，从图5可知BOX-SA-KLH的溴己新多克隆抗体对溴己新的半抑制浓度(IC50)为半抑制浓度为4.57μg/Kg，定量检测线性范围(IC20～IC80)为0.85～35.11μg/Kg，最低检测限为0.41μg/Kg；说明本发明制备得到的用于检测溴己新的抗体可以满足检测要求，且对溴己新的识别能力高。
实施例6用于检测溴己新的抗体的特异性评价
1、实验方法
将实施例5中的药物溴己新换成氨溴索、溴布特罗，并以同样的稀释倍数进行上述试验，测定实施例3制备的多克隆抗体对其他结构类似物的交叉反应率。
通过溴己新与其类似物进行交叉反应实验来确定用于检测溴己新的特异性，其抗体的特异性用交叉反应率(CR)表示，交叉反应率越小，特异性越强。将溴己新及其类似物(氨溴索、溴布特罗)分别作倍比稀释，采用间接竞争ELISA法进行测定，步骤同实施例5的灵敏度验证方法，得到各类似物的IC50值，按照以下公式计算溴己新交叉反应率(CR)：
CR(％)＝IC50(溴己新)/IC50(类似物)×100％
2、实验结果
溴己新与其类似物的交叉反应结果如表2所示。
表2溴己新与其类似物的交叉反应结果
Figure GDA0004073788020000121
注：NR表示无反应。
从表2可知，用于检测溴己新的抗体对氨溴索、溴布特罗均无交叉反应；说明用于检测溴己新的BOX-SA-KLH制备的多克隆抗体对溴己新的特异性强，可有效地排除其类似物(氨溴索、溴布特罗)对溴己新的干扰，能够专门用于对溴己新的检测。
实施例7检测溴己新的试剂盒的开发
1、组建检测溴己新的试剂盒，所述试剂盒包含下述各部分：
(1)包被有包被原的酶标板的制备：将实施例2制备的人工抗原BOX-SA-OVA作为包被原，用包被缓冲液将包被原稀释成31.25μg/L，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1wt％～3wt％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；
(2)溴己新标准品溶液：8个浓度梯度，分别为1000μg/L，250μg/L，62.5μg/L，15.63μg/L，3.91μg/L，0.98μg/L，0.25μg/L，0.06μg/L；
(3)16000倍稀释的溴己新多克隆抗体稀释液；
(4)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的实施例3制备的溴己新多克隆抗体；
(5)底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(6)终止液为2mol/L的H2SO4；
(7)洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
2、实际样品检测
将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按1:10体积比进行稀释(即一份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配现用)。加入标准品/样品50μL到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μL，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔。充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可食用未使用过的枪头戳破)。加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min.加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪与450nm处，测定每孔OD值。
3、检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准品(0μg/L)的吸光度值的平均值，再乘以100％。以标准品百分吸光率为纵坐标，以溴己新标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中溴己新的实际浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种溴己新半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0004073788010000011
2.权利要求1所述溴己新半抗原的制备方法，其特征在于，将溴己新与丁二酸酐和吡啶在溶剂中进行反应，分离纯化反应产物，萃取、干燥、浓缩后即得式(I)所示溴己新半抗原。
3.权利要求1所述溴己新半抗原在制备溴己新人工抗原中的应用。
4.一种溴己新人工抗原，其特征在于，所述溴己新人工抗原的结构式如式(II)所示：
Figure FDA0004073788010000012
其中，P为载体蛋白；所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白。
5.权利要求4所述溴己新人工抗原的制备方法，其特征在于，通过活泼酯法在权利要求1中式(I)所示溴己新半抗原的羧基上偶联载体蛋白即得式(II)所示溴己新人工抗原。
6.权利要求4所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白或乳铁蛋白的溴己新人工抗原在制备溴己新抗体中的应用。
7.一种溴己新检测试剂盒，其特征在于，以权利要求4所述溴己新人工抗原为包被原，以权利要求4中载体蛋白为钥孔血蓝蛋白或乳铁蛋白的溴己新人工抗原为免疫原免疫动物制备得到的溴己新抗体进行检测。
8.一种检测溴己新的免疫分析方法，其特征在于，以权利要求4所述溴己新人工抗原为包被原，以权利要求4中载体蛋白为钥孔血蓝蛋白或乳铁蛋白的溴己新人工抗原为免疫原免疫动物制备得到的溴己新抗体进行检测。
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