CN114315835B - 一种6-苯甲基腺嘌呤半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种6‑苯甲基腺嘌呤半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用，本发明制备得到了一种6‑苯甲基腺嘌半抗原6‑BA‑2C，应用半抗原6‑BA‑2C偶联载体蛋白BSA得到人工抗原6‑BA‑2C‑BSA，并进一步制备得到用于检测6‑苯甲基腺嘌呤的特异性抗体，应用人工抗原6‑BA‑2C‑OVA作为包被原，该抗体对6‑苯甲基腺嘌呤具有良好的灵敏度和特异性，半抑制浓度为1.18μg/Kg，最低检测限为0.056μg/Kg，定量检测范围为0.17～61.04μg/Kg，对玉米素、反玉米素、N6‑苯甲酰基腺嘌呤均无交叉反应，利用本发明的抗体建立了特异性和灵敏度更高的6‑苯甲基腺嘌呤的免疫分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种6-苯甲基腺嘌呤半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
6-苯甲基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)，别名6-苄基腺嘌呤或6-苄基氨基嘌呤，是第一个人工合成的腺嘌呤细胞分裂素，它常被广泛添加于植物生长培养基里作为促长剂和保鲜剂使用。6-BA的主要成份是嘌呤类生物碱和一些无机物，具有促进种子萌发和胚芽细胞分裂，还具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老等多种效能，广泛用于调节植物生长发育以及蔬菜、水果的保鲜和储存。由于6-BA的药效良好、价格低廉，目前已被广泛当成一种生长调节剂用于无根豆芽的种植中，成为食品安全领域的一个重大问题。
然而，人体摄入过多的6-BA会刺激皮肤黏膜，造成食道、胃黏膜损伤，出现恶心、呕吐等现象。为确保豆芽及其制品食用安全，根据《中华人民共和国食品安全法》《中华人民共和国农产品质量安全法》等相关法律的规定，原国家食品药品监督管理总局、农业部、国家卫生和计划生育委员会在2015年发布公告，严禁在豆芽生产过程中使用6-苄基腺嘌呤等植物生长调节剂类物质。因此，加强芽菜中的6-BA残留量的检测对于保证食品质量安全十分重要。
有关6-BA在芽菜类的残留分析方法国内外已有一些报道。目前，对于6-BA残留的检测方法主要有高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、气相色谱(Gas Chromatography，GC)、气相色谱-质谱联用(Gas Chromatography-MassSpectrometer，GC-MS)以及高效液相-质谱联用(High Performance LiquidChromatography-Mass Spectrometer，HPLC-MS)等方法。这些方法虽然结果可靠，灵敏度高，但需要昂贵的仪器、专业人员操作，检测步骤繁琐，因此这些方法一方面不能实现现场快速检测的目的；另一方面也很难在我国基层单位得以推广。
与仪器分析方法相比，免疫检测方法因其具有特异性强、操作简便、可实现大量样品的快速检测等特点，在农药残留检测领域中受到越来越多的关注。因此，建立高效的免疫检测方法很有必要，然而该方法是由抗原和抗体的性能决定的，要得到针对的抗原和抗体，关键在于相应半抗原的结构设计。因此，迫切需要提供一种能够产生针对6-苯甲基腺嘌呤特异性更高的抗体的半抗原和人工抗原。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中6-苯甲基腺嘌呤免疫检测特异性的缺陷和不足，提供一种6-苯甲基腺嘌呤半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
本发明的目的在于提供一种6-苯甲基腺嘌呤半抗原。
本发明的目的还在于提供6-苯甲基腺嘌呤半抗原在制备6-苯甲基腺嘌呤人工抗原中的应用。
本发明的目的还在于提供6-苯甲基腺嘌呤人工抗原。
本发明的目的还在于提供所述6-苯甲基腺嘌呤半抗原和/或人工抗原在制备6-苯甲基腺嘌呤人工抗体中的应用。
本发明的目的还在于提供一种6-苯甲基腺嘌呤抗体。
本发明的目的还在于提供一种检测6-苯甲基腺嘌呤的试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种检测6-苯甲基腺嘌呤的免疫分析方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种6-苯甲基腺嘌呤半抗原，所述6-苯甲基腺嘌呤半抗原的结构式如式(I)所示，
所述6-苯甲基腺嘌呤半抗原采用系统命名法命名为：2-(6-(benzylamino)-9H-purin-9-yl)acetic acid，即2-(6-(苄基氨基)-9H-嘌呤-9-基)乙酸；
本发明所述6-苯甲基腺嘌呤半抗原(6-BA-2C)的制备方法，包括如下步骤：
将6-苯甲基腺嘌呤溶解于N,N-二甲基甲酰胺后，碱性环境加入无水碳酸钾，再加入溴乙酸乙酯加热充分反应，分离纯化反应产物，旋干、萃取，蒸发浓缩，即得6-苯甲基腺嘌呤半抗原(6-BA-2C)。
将6-苯甲基腺嘌呤溶解于N,N-二甲基甲酰胺后，加入无水碳酸钾为整个反应体系维持提供一个碱性环境，再加入溴乙酸乙酯加热至50℃冷凝回流反应4h，分离纯化后得到的反应产物经旋干后，以超纯水与乙酸乙酯1：1进行萃取，酯层以旋蒸蒸发仪浓缩后，即得到6-苯甲基腺嘌呤半抗原(6-BA-2C)。
优选地，所述6-苯甲基腺嘌呤和N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为20～30mg:1mL。
更优选地，所述6-苯甲基腺嘌呤和N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为25mg:1mL。
优选地，所述溴乙酸乙酯和6-苯甲基腺嘌呤的质量比为2～5:1。
更优选地，所述溴乙酸乙酯和6-苯甲基腺嘌呤的质量比为4:1。
所述6-苯甲基腺嘌呤的结构式为：
所述溴乙酸乙酯的结构式为：
所述6-苯甲基腺嘌呤半抗原在制备6-苯甲基腺嘌呤人工抗原中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种6-苯甲基腺嘌呤人工抗原，由所述6-苯甲基腺嘌呤半抗原偶联载体蛋白得到，6-苯甲基腺嘌呤人工抗原的结构式如式(II)所示，其中，P为载体蛋白，
优选地，所述载体蛋白(P)为牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)、乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)或者鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)任意一种或几种。
本发明所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原的制备方法，利用所述6-苯甲基腺嘌呤半抗原(6-BA-2C)，通过活泼酯法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个具体实施方式，所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将6-BA-2C与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下避光搅拌2～4h，得到6-BA-2C活化液；
(2)将载体蛋白加入到PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；
(3)将步骤(1)的6-BA-2C活化液缓慢逐滴加入步骤(2)的载体蛋白缓冲溶液中，4℃反应12h；
(4)用PBS缓冲液透析步骤(3)所得反应液，即得6-苯甲基腺嘌呤人工抗原。
优选地，步骤(1)中所述6-BA-2C、NHS与EDC的质量比为1～2:1～2:2～3。
更优选地，步骤(1)中所述6-BA-2C、NHS与EDC的质量比为1.3:1.6:2.5。
优选地，步骤(2)中所述载体蛋白与PBS缓冲液的质量体积比为5mg:2mL。
优选地，步骤(1)中所述6-BA-2C与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为1～5:3～8。
更优选地，步骤(1)中所述6-BA-2C与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为1:4。
所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原在制备6-苯甲基腺嘌呤抗体中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种6-苯甲基腺嘌呤抗体，利用所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原免疫动物制备得到。
优选地，所述6-苯甲基腺嘌呤抗体是利用以载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原(6-BA-2C-BSA)免疫动物制备得到。
优选地，所述6-苯甲基腺嘌呤抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
一种6-苯甲基腺嘌呤多克隆抗体的制备方法，利用所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原免疫实验动物制备得到。
作为一种优选地实施方式，6-苯甲基腺嘌呤多克隆抗体的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将制备好的6-BA-2C偶联牛血清白蛋白的人工抗原(6-BA-2C-BSA)作为免疫原与等量的免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫动物。将2.5～3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。
(2)加强免疫一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000rpm/min离心15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体。
由上述方法制备得到的6-苯甲基腺嘌呤多克隆抗体也在本发明的保护范围之内。
所述6-苯甲基腺嘌呤抗体在检测6-苯甲基腺嘌呤和/或制备检测6-苯甲基腺嘌呤试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种检测6-苯甲基腺嘌呤的试剂盒，包括所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原和所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原免疫动物制备得到的抗体。
优选地，所述试剂盒包括以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原(6-BA-2C-OVA)和以载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原(6-BA-2C-BSA)免疫动物制备得到的抗体。
优选地，所述试剂盒还包括酶标板、6-苯甲基腺嘌呤标准品、酶结合物、显色液、终止液或洗涤液中的一种或多种。
进一步的优选地，所述试剂盒还包括所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原包被的酶标板、6-苯甲基腺嘌呤标准品溶液、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液。
进一步优选地，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的6-苯甲基腺嘌呤抗体。
更进一步优选地，所述抗体为以载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原(6-BA-2C-BSA)免疫动物得到的多克隆抗体。
进一步优选地，所述试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被包被抗原，样本中残留的6-苯甲基腺嘌呤和酶标板微孔条上预包被的包被抗原竞争抗6-苯甲基腺嘌呤的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物6-苯甲基腺嘌呤的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中6-苯甲基腺嘌呤的残留量。
优选地，所述6-苯甲基腺嘌呤标准品溶液为8个浓度梯度，分别是1000μg/L，200μg/L，40μg/L，8μg/L，1.6μg/L，0.32μg/L，0.064μg/L，0.0128μg/L。
优选地，所述显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
优选地，所述终止液为1～2mol/L的硫酸溶液。
优选地，所述洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；所述百分比为重量体积百分比。
优选地，上述酶标板的制备方法为：用包被缓冲液将包被原稀释成31.25μg/L，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μL封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
优选地，上述酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；所述百分比为重量体积百分比。
一种检测6-苯甲基腺嘌呤的免疫分析方法，以所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原为抗原，以所述6-苯甲基腺嘌呤抗体为检测抗体进行检测；所述免疫分析方法为非诊断治疗目的方法。
优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原(6-BA-2C-OVA)为抗原，以载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原(6-BA-2C-BSA)为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明制备得到的6-苯甲基腺嘌呤半抗原6-BA-2C，应用该半抗原制备得到了6-苯甲基腺嘌呤人工抗原6-BA-2C-BSA、人工抗原6-BA-2C-OVA和多克隆抗体，以人工抗原6-BA-2C-OVA作为包被原；该抗体对6-苯甲基腺嘌呤具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为1.18μg/Kg，定量检测范围为0.17～61.04μg/Kg，检测限为0.056μg/Kg，对玉米素、反玉米素、N6-苯甲酰基腺嘌呤均无交叉反应，为建立特异性6-苯甲基腺嘌呤的免疫检测方法提供了核心原材料；建立了特异性和灵敏度更高的6-苯甲基腺嘌呤的免疫分析方法；此外，利用该多克隆抗体开发了一种检测6-苯甲基腺嘌呤残留的试剂盒，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。
附图说明
图1为本发明实施例1的6-苯甲基腺嘌呤半抗原(6-BA-2C)的合成路线图。
图2为本申请实施例2的6-BA-2C、BSA、6-BA-2C-BSA紫外扫描图。
图3为本申请实施例2的6-BA-2C、OVA、6-BA-2C-OVA紫外扫描图。
图4为本申请实施例2的6-BA-2C、LF、6-BA-2C-LF紫外扫描图。
图5为本申请实施例5的6-苯甲基腺嘌呤的抗体间接竞争ELISA标准曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 6-苯甲基腺嘌呤半抗原的制备与鉴定
1.6-苯甲基腺嘌呤半抗原(6-BA-2C)的制备
向反应的25mL圆底瓶中加入100mg 6-苯甲基腺嘌呤，加入2.2mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入4mg无水碳酸钾为整个反应体系维持提供一个碱性环境，再加入100mg溴乙酸乙酯加热至50℃冷凝回流反应4h。以TLC监控至反应完毕，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(6:1，v/v)。再通过硅胶柱层析纯化将得到反应产物经纯化后，以超纯水与乙酸乙酯1:1进行萃取，酯层以旋蒸蒸发仪浓缩后，即得6-苯甲基腺嘌呤半抗原(6-BA-2C)。6-BA-2C的合成路线图如图1所示。
2.6-苯甲基腺嘌呤半抗原(6-BA-2C)的鉴定
6-BA-2C的核磁共振氢谱结果：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ8.31(d,J＝24.1Hz,2H),7.75–6.95(m,5H),5.39(s,2H),5.12(d,J＝35.6Hz,3H),3.22(p,J＝1.7Hz,1H).
6-BA-2C的质谱结果为：MS：C12H11N5：283.29，ESI+[M-H]+:284.3。
根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，衍生位点正确且成功，说明本发明成功合成了目标产物6-苯甲基腺嘌呤半抗原6-BA-2C，其结构式如式(I)所示：
6-BA-2C采用系统命名法命名为：2-(6-(benzylamino)-9H-purin-9-yl)aceticacid，即2-(6-(苄基氨基)-9H-嘌呤-9-基)乙酸。
实施例2 6-苯甲基腺嘌呤人工抗原的合成和鉴定
1.6-苯甲基腺嘌呤人工抗原的合成
将实施例1制备的6-苯甲基腺嘌呤半抗原(6-BA-2C)，通过活泼酯法偶联牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)和乳铁蛋白(LF)。
(1)分别称取10mg实施例1制备的6-BA-2C，2mg的NHS和3mg的EDC溶解于50～100uLDMF中，室温下避光搅拌2～4h得到6-苯甲基腺嘌呤半抗原活化液；
(2)分别称取15mg牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)和乳铁蛋白(LF)加入到1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；
(3)将步骤(1)所得6-苯甲基腺嘌呤半抗原活化液逐滴缓慢加入到步骤(2)所得载体蛋白缓冲溶液中，4℃搅拌12h；
(4)用PBS缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后得到6-苯甲基腺嘌呤人工抗原(6-BA-2C-BSA、6-BA-2C-OVA、6-BA-2C-LF)，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
其中，磷酸盐缓冲溶液的配方：Na2HPO4·12H2O 2.90g，NaCl8.50g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.20g，加蒸馏水定容至1000mL。
2.6-苯甲基腺嘌呤人工抗原的鉴定
取上述合成的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原(6-BA-2C-BSA、6-BA-2C-OVA、6-BA-2C-LF)，进行紫外全波长扫描，结果如图2、图3、图4所示。
具体地，BSA、6-BA-2C、6-BA-2C-BSA分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现6-苯甲基腺嘌呤免疫原6-BA-2C-BSA的吸收曲线与载体蛋白BSA明显不同，6-BA-2C在240nm和300nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在220nm和300nm处，6-BA-2C-BSA的吸收峰明显比BSA高，且对比6-BA-2C的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白BSA与6-BA-2C的复合物，6-BA-2C-BSA偶联成功。
具体地，OVA、6-BA-2C、6-BA-2C-OVA分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现6-苯甲基腺嘌呤人工抗原6-BA-2C-OVA的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，6-BA-2C在240nm和300nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在220nm和300nm处，6-BA-2C-OVA的吸收峰明显比OVA高，且对比6-BA-2C的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白OVA与6-BA-2C的复合物，6-BA-2C-OVA偶联成功。
具体地，LF、6-BA-2C、6-BA-2C-LF分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现6-苯甲基腺嘌呤人工抗原6-BA-2C-LF的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，6-BA-2C在240nm和300nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在220nm和300nm处，6-BA-2C-LF的吸收峰明显比LF高，且对比6-BA-2C的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白LF与6-BA-2C的复合物，6-BA-2C-LF偶联成功。
实施例3抗体的制备
1.多克隆抗体的制备
将实施例2制备的6-BA-2C偶联牛血清白蛋白(BSA)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原6-BA-2C-BSA和6-BA-2C偶联乳铁蛋白(LF)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原6-BA-2C-LF分别作为免疫原，与等量的免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫动物。将2.5～3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。加强免疫一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000rpm/min离心15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化后得到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
2.单克隆抗体的制备
将实施例2制备的6-BA-2C偶联牛血清白蛋白(BSA)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原6-BA-2C-BSA和6-BA-2C偶联乳铁蛋白(LF)的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原6-BA-2C-LF分别作为免疫原，与等量的免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫巴比西小鼠，采用腹部皮下多点注射法免疫小鼠，每次加强免疫1周后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价，待抗体效价不再升高后，再进行一次加强免疫，7天后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合。采用HAT培养基中筛选出杂交瘤细胞后用完全培养基进行细胞培养。用ic-ELISA方法对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，一周后再次检测、挑孔、再克隆。经3次克隆培养检测后，获得单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。腹水用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后得到单克隆抗体，-20℃冻存备用。
实施例4 6-苯甲基腺嘌呤免疫原和包被原的筛选
分别利用实施例3的6-BA-2C-BSA和6-BA-2C-LF作为免疫原免疫动物后得到的抗体，通过间接竞争ELISA方法进行包被原的筛选，以实施例2制备得到的人工抗原6-BA-2C-BSA、6-BA-2C-LF和6-BA-2C-OVA作为包被原；通过间接竞争ELISA方法获得的血清效价和抑制率来选择最佳的免疫原和包被原。
一种筛选6-苯甲基腺嘌呤免疫原和包被原的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：
(1)分别将实施例2制备的人工抗原6-BA-2C-BSA 、6-BA-2C-OVA和6-BA-2C-LF作为包被原，用包被液稀释至1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育过夜(12h)；
(2)弃去包被液，洗涤2次，拍干；
(3)每孔加入120μL封闭液(即1wt％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出；
(5)用PBST将实施例3制备的6-苯甲基腺嘌呤多克隆抗体倍比稀释成七个梯度，即1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000，同时设置空白对照孔(用PBST代替)；并将6-苯甲基腺嘌呤药物稀释至1μg/mL；
(6)效价列：每孔加50μL的PBST，再将倍比稀释得到抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；
抑制列：每孔加50μL的药物，再将倍比稀释得到抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；在37℃温育40min，洗涤5次，拍干；
(7)加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
(8)加入显色液，每孔100μL，显色10min；
(9)加入50μL 2mol/L的H2SO4溶液终止反应，并在450nm处读取OD值。
效价是OD450为1.0左右所对应的抗体稀释倍数。
抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/抑制的OD值*100％。
不同免疫原与包被原组合的血清效价和抑制率结果如表1所示。
表1不同免疫原与包被原组合的血清效价和抑制率
从表1中可以看出，不同的6-苯甲基腺嘌呤人工抗原作为免疫原免疫的新西兰大白兔产生的抗体均有一定的效价；同时，所得抗体对目标分析物6-苯甲基腺嘌呤均有不同程度的抑制效果。其中，编号1的免疫原和包被原组合所示的效价1:512000和抑制率90.00％，高于编号2、3、4的免疫原和包被原组合的效价和抑制率，由此可以说明编号1的免疫原和包被原不仅能特异性识别目标分析物6-BA，而且抗体灵敏度好，故将6-BA-2C-BSA作为最佳的免疫原、6-BA-2C-OVA作为最佳的包被原。
实施例5 6-苯甲基腺嘌呤的间接竞争ELISA检测方法的建立
1、实验方法
一种检测6-苯甲基腺嘌呤的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：
(1)将实施例2制备的人工抗原6-BA-2C-OVA作为包被原，用包被液稀释至31.25μg/L，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育过夜(12h)；
(2)弃去包被液，洗涤2次，拍干；
(3)每孔加入120μL封闭液(即1wt％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出；
(5)用PBST将实施例3制备的6-苯甲基腺嘌呤多克隆抗体稀释16000倍，并将6-苯甲基腺嘌呤药物稀释至1000μg/L，200μg/L，40μg/L，8μg/L，1.6μg/L，0.32μg/L，0.064μg/L，0.0128μg/L；
(6)每行加50μL 6-苯甲基腺嘌呤药物稀释液(三组平行)，再加入50μL/孔实施例3制备的6-苯甲基腺嘌呤多克隆抗体稀释液，在37℃温育40min，洗涤5次，拍干；
(7)加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
(8)加入显色液，每孔100μL，显色10min；
(9)加入50μL2mol/L的H2SO4溶液终止反应，并在450nm处读取OD值。
2、实验结果
用于检测6-苯甲基腺嘌呤的抗体间接竞争ELISA标准曲线如图5所示，从图5可知实施例3制备的6-苯甲基腺嘌呤多克隆抗体对6-苯甲基腺嘌呤的半抑制浓度(IC50)为1.18μg/Kg，定量检测线性范围(IC20～IC80)为0.17～61.04μg/Kg，最低检测限为0.056μg/Kg；说明本发明制备得到的用于检测6-苯甲基腺嘌呤的抗体可以满足检测要求，且对6-苯甲基腺嘌呤的识别能力高。
实施例6用于检测6-苯甲基腺嘌呤的抗体的特异性评价
1.实验方法
将实施例5中的药物6-苯甲基腺嘌呤换成玉米素、反玉米素和N6-苯甲酰基腺嘌呤，并以同样的稀释倍数进行上述试验，测定实施例3制备的多克隆抗体对其他结构类似物的交叉反应率。
通过6-苯甲基腺嘌呤与其类似物进行交叉反应实验来确定用于检测6-苯甲基腺嘌呤的特异性，其抗体的特异性用交叉反应率(CR)表示，交叉反应率越小，特异性越强。将6-苯甲基腺嘌呤及其类似物(玉米素、反玉米素、N6-苯甲酰基腺嘌呤)分别作倍比稀释，采用间接竞争ELISA法进行测定，步骤同实施例5的灵敏度验证方法，得到各类似物的IC50值，按照以下公式计算6-苯甲基腺嘌呤交叉反应率(CR)：
CR(％)＝IC50(6-苯甲基腺嘌呤)/IC50(类似物)×100％
2.实验结果
6-苯甲基腺嘌呤与其类似物的交叉反应结果如表2所示。
表2 6-苯甲基腺嘌呤与其类似物的交叉反应结果
注：NR表示无反应。
从表2可知，用于检测6-苯甲基腺嘌呤的抗体对玉米素、反玉米素、N6-苯甲酰基腺嘌呤均无交叉反应；说明用于检测6-苯甲基腺嘌呤的实施例3制备的多克隆抗体对6-苯甲基腺嘌呤的特异性强，可有效地排除其类似物(玉米素、反玉米素、N6-苯甲酰基腺嘌呤)对6-苯甲基腺嘌呤的干扰，能够专门用于对6-苯甲基腺嘌呤的检测。
实施例7检测6-苯甲基腺嘌呤的试剂盒的开发
1、组建检测6-苯甲基腺嘌呤的试剂盒，所述试剂盒包含下述各部分：
(1)包被有包被原的酶标板的制备：将实施例2制备的人工抗原6-BA-2C-OVA作为包被原，用包被缓冲液将包被原稀释成31.25μg/L，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1wt％～3wt％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；
(2)6-苯甲基腺嘌呤标准品溶液：8个浓度梯度，分别为1000μg/L，200μg/L，40μg/L，8μg/L，1.6μg/L，0.32μg/L，0.064μg/L，0.0128μg/L；
(3)实施例3制备的6-苯甲基腺嘌呤多克隆抗体；
(4)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的实施例3制备的6-苯甲基腺嘌呤多克隆抗体；
(5)底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(6)终止液为2mol/L的H2SO4；
(7)洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
2、实际样品检测
将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按1:10体积比进行稀释(即一份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配现用)。加入标准品/样品50μL到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μL，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔。充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可食用未使用过的枪头戳破)。加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min.加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪与450nm处，测定每孔OD值。
3、检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准品(0μg/L)的吸光度值的平均值，再乘以100％。以标准品百分吸光率为纵坐标，以6-苯甲基腺嘌呤标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中6-苯甲基腺嘌呤的实际浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种6-苯甲基腺嘌呤半抗原在制备6-苯甲基腺嘌呤人工抗原中的应用，所述6-苯甲基腺嘌呤半抗原的结构式如式(I)所示，
2.一种6-苯甲基腺嘌呤人工抗原，其特征在于，所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原为权利要求1中所述的6-苯甲基腺嘌呤半抗原偶联载体蛋白得到；所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原的结构式如式(II)所示，其中，P为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白，
3.权利要求2所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原在制备6-苯甲基腺嘌呤抗体中的应用。
4.一种6-苯甲基腺嘌呤抗体，其特征在于，利用以载体蛋白为牛血清白蛋白的权利要求2所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原免疫动物制备得到。
5.权利要求4所述6-苯甲基腺嘌呤抗体在以非疾病治疗诊断为目的检测6-苯甲基腺嘌呤中的应用。
6.权利要求4所述6-苯甲基腺嘌呤抗体在制备检测6-苯甲基腺嘌呤试剂盒中的应用。
7.一种检测6-苯甲基腺嘌呤的试剂盒，其特征在于，包含载体蛋白为鸡卵清白蛋白的权利要求2所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原和权利要求4所述6-苯甲基腺嘌呤抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶标板、6-苯甲基腺嘌呤标准品、酶结合物、显色液、终止液或洗涤液中的一种或多种。
9.一种检测6-苯甲基腺嘌呤的免疫分析方法，其特征在于，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白的权利要求2所述6-苯甲基腺嘌呤人工抗原作为抗原，以权利要求4所述6-苯甲基腺嘌呤抗体为检测抗体进行检测；所述免疫分析方法以非疾病治疗诊断为目的检测6-苯甲基腺嘌呤。
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