CN117126123A - 用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用 - Google Patents

用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117126123A
CN117126123A CN202310871596.1A CN202310871596A CN117126123A CN 117126123 A CN117126123 A CN 117126123A CN 202310871596 A CN202310871596 A CN 202310871596A CN 117126123 A CN117126123 A CN 117126123A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phenolphthalein
hapten
artificial antigen
antigen
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310871596.1A
Other languages
English (en)
Inventor
雷红涛
刘志威
关甜
李兆栋
王锦
李向梅
沈兴
韦晓群
徐小艳
徐振林
沈玉栋
黄日明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202310871596.1A priority Critical patent/CN117126123A/zh
Publication of CN117126123A publication Critical patent/CN117126123A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D307/87—Benzo [c] furans; Hydrogenated benzo [c] furans
    • C07D307/88—Benzo [c] furans; Hydrogenated benzo [c] furans with one oxygen atom directly attached in position 1 or 3
    • C07D307/885—3,3-Diphenylphthalides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用。本发明提供了既能最大程度保留酚酞中的三个苯环和内酯环特征结构，又具有一定长度连接臂的酚酞半抗原，还提供了该酚酞半抗原制备的方法。利用酚酞半抗原偶联载体蛋白制得到的酚酞人工抗原，经免疫动物后，可获得亲和力高的酚酞抗体，其半抑制浓度IC50为0.19ng/mL，最低检测限为0.007ng/mL，定量检测范围为0.02～1.64ng/mL，不仅检测灵敏度高，而且特异性强，准确度高，与多种酚酞结构类似物均无交叉反应，检测效果不受样本类型的影响，可推广用于减肥食品中酚酞的大规模快速精准筛查。

Description

用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体地，涉及用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用。
背景技术
酚酞(Phenolphthalein)亦叫酚酜，化学名3，3-二(4-羟苯基)-3H-异苯并呋喃酮，是一种医用刺激性泻药，主要通过刺激肠黏膜或活化肠内平滑肌的神经末梢而增加肠的推进力，用于治疗习惯性、顽固性便秘。酚酞在2017年被世界卫生组织国际癌症研究机构列入2B类致癌物清单，我国国家药品监督管理局也已发布《关于注销酚酞片和酚酞含片药物证书的公告(2021年第6号)》，停止了酚酞片和酚酞含片在的生产、销售和使用，注销药品注册证书。
常规检测酚酞的方法主要有仪器检测法、试纸检测法和免疫学检测法。仪器检测法包括：拉曼光谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、紫外可见分光光度法等，设备昂贵、成本高、过程繁杂、需专业人士操作，不符合大批量样品现场检测要求。试纸检测法是根据酚酞在pH值＜8.2的溶液里为无色的内酯式结构而在pH值8.2～10的溶液里为红色的醌式结构的原理，用强碱制备的试纸检测，根据试纸的颜色判断样品是否加入酚酞，虽然简便但准确度低，误检率较高。免疫学检测分析技术具有高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点。现有技术中已经建立了一些酚酞免疫学检测分析技术，比如通过在酚酞的内酯环结构处引入连接手臂制备半抗原，并与蛋白质偶联制备人工抗原(CN201710096284.2；食品安全质量检测学报,2019,10(24):8479-8483)，但这种策略破坏了酚酞的特征结构，不利于产生高特异、高灵敏的抗体；此外，也采用羰基二咪唑法将酚酞上的羟基(-OH)直接与大分子蛋白上的羧基偶联制备人工抗原，但酚酞小分子无法充分暴露，从而影响动物机体的识别，同样不利于产生高质量的抗体(CN201910653805.9；Journalof Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2022,212:114609；Journal ofMaterials Chemistry B,2021,9(18):3856-3862；减肥茶和咖啡中非法添加成分的免疫快速检测[D].江南大学，2021)。所以，目前仍缺少特异性好且灵敏度高的酚酞快速检测方法。
发明内容
为了解决现有技术中免疫学检测法检测酚酞存在抗体特异性差、灵敏度低的问题，本发明提供了用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用。
本发明的第一个目的是提供两种酚酞半抗原。
本发明的第二个目的是提供上述酚酞半抗原在制备酚酞人工抗原中的应用。
本发明的第三个目的是提供两种酚酞人工抗原。
本发明的第四个目的是提供上述酚酞人工抗原在制备酚酞的抗体中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种酚酞人工抗原组合。
本发明的第六个目的是提供上述酚酞人工抗原组合在制备检测酚酞的试剂中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种检测酚酞的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
在建立免疫学检测方法并应用该检测方法快速鉴别减肥食品中酚酞含量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是合成、制备出合适的酚酞半抗原。
本发明提供的用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原最大程度保留了酚酞中的三个苯环和内酯环特征结构，通过在酚酞的羟基位置引入具有一定长度的间隔臂，再与大分子蛋白偶联，酚酞小分子就能充分暴露，且基本不会被大分子蛋白屏蔽，更有利于动物机体的识别，利于制备出灵敏度更高和特异性更强的酚酞抗体。
一种酚酞半抗原，即酚酞半抗原PT-4C，其结构式如式(Ⅰ)所示，
所述酚酞半抗原PT-4C采用系统命名法命名为：4-(4-(1-(4-hydroxyphenyl)-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)phenoxy)butanoic acid；即4-(4-(1-(4-羟基苯基))-3-氧-1，3-二氢异苯并呋喃-1-基)苯氧基)丁酸。
一种酚酞半抗原，即酚酞半抗原PT-6C，其结构式如式(Ⅱ)所示，
所述酚酞半抗原PT-6C采用系统命名法命名为：6-(4-(1-(4-hydroxyphenyl)-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)phenoxy)hexanoic acid；即6-(4-(1-(4-羟基苯基))-3-氧-1，3-二氢异苯并呋喃-1-基)苯氧基)己酸。
结构式如式(Ⅰ)所示化合物的制备方法，将酚酞、4-溴丁酸乙酯、碳酸铯、碘化钠和N,N-二甲基甲酰胺充分反应；所得反应物在碱性环境下充分水解，调节pH为6～7，即得；
具体的，将1mol酚酞溶于3mL N,N-二甲基甲酰基，后加入2mol 4-溴丁酸乙酯和6mol碳酸钾，室温(25℃)搅拌过夜(11h)，得到反应物；柱层析(固定相为硅胶粉，流动相为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1)分离纯化反应物，将所得纯化产物溶解于5mL甲醇，然后加入5mL 3mol/L氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3h，反应结束后调节pH为6～7，所得沉淀即为半抗原1。
结构式如式(Ⅱ)所示化合物的制备方法，将酚酞、6-溴己酸乙酯、碳酸铯、碘化钠和N,N-二甲基甲酰胺充分反应；所得反应物在碱性环境下充分水解，调节pH为6～7，即得；
具体的，将1mol酚酞溶于3mL N,N-二甲基甲酰基，后加入2mol 6-溴己酸乙酯和6mol碳酸钾，室温(25℃)搅拌过夜(11h)，得到反应物；柱层析(固定相为硅胶粉，流动相为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1)分离纯化反应物，将所得纯化产物溶解于5mL甲醇，然后加入5mL 3mol/L氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3h，反应结束后调节pH为6～7，所得沉淀即为半抗原2。
酚酞半抗原PT-4C或酚酞半抗原PT-6C在制备酚酞人工抗原中的应用也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述酚酞人工抗原用于鉴别减肥食品中的酚酞。
本发明所涉及的减肥食品为具有减肥功能的食品，包括但不限于具有减肥功能的压片糖果、饮料、果蔬粉、代用茶、蜜饯、配制酒、果酒和果冻。
一种酚酞人工抗原，由酚酞半抗原PT-4C偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅲ)所示，
其中，P为载体蛋白，所述载体蛋白为鸡卵清蛋白或牛血清白蛋白，即为酚酞人工抗原PT-4C-OVA或PT-4C-BSA。
优选地，所述载体蛋白为鸡卵清蛋白，即为酚酞人工抗原PT-4C-OVA。
一种酚酞人工抗原，由酚酞半抗原PT-6C偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅳ)所
其中，P为载体蛋白，所述载体蛋白为鸡卵清蛋白或牛血清白蛋白，即为酚酞人工抗原PT-6C-OVA或PT-6C-BSA。
优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，即为酚酞人工抗原PT-6C-BSA。
一种制备上述酚酞人工抗原的方法，将上述酚酞半抗原通过活泼酯法偶联载体蛋白。
优选地，所述活泼酯法包括以下步骤：
S1.将酚酞半抗原C、N，N-二甲基甲酰胺、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐避光充分反应，得到溶液A；载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液得到溶液B；
S2.溶液A与溶液B充分反应后，经过透析，即得到酚酞人工抗原。
更优选地，步骤S1中，所述酚酞半抗原、N，N-二甲基甲酰胺、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量体积比为(8mg～12mg)：(50μL～100μL)：(1mg～3mg)：(2mg～4mg)。
进一步优选地，步骤S1中，所述酚酞半抗原、N，N-二甲基甲酰胺、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量体积比为10mg：100μL：2mg：3mg。
更优选地，步骤S1中，所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为(8mg～12mg)：(0.5mL～1.5mL)。
进一步优选地，步骤S1中，所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为10mg：1mL。
更优选地，步骤S1中，先将酚酞半抗原溶解于N，N-二甲基甲酰胺，再加入N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，25℃～30℃避光搅拌2～4h。
进一步优选地，步骤S1中，10mg酚酞半抗原溶解于100μL N，N-二甲基甲酰胺，再加入2mg N-羟基丁二酰亚胺和3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，25℃避光搅拌4h。
更优选地，步骤S2中，所述溶液A和溶液B的体积比为(1～3)：(5～10)。
进一步优选地，步骤S2中，所述溶液A和溶液B的体积比为1：10。
更优选地，步骤S2中，将溶液A逐滴加到溶液B中，3℃～5℃搅拌10h～14h。
进一步优选地，步骤S2中，将溶液A逐滴加到溶液B中，4℃搅拌12h。
更优选地，步骤S2中，所述透析的方法为用PBS缓冲液透析2天，每天4次。
任一上述方法制备得到的酚酞人工抗原也应在本发明的保护范围之内。
任一上述酚酞人工抗原在制备酚酞的抗体中的应用也应在本发明的保护范围之内。
任一上述酚酞人工抗原在检测酚酞中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。
优选地，所述酚酞人工抗原用于鉴别减肥食品中的酚酞。
本发明所涉及的减肥食品为具有减肥功能的食品，包括但不限于具有减肥功能的压片糖果、饮料、果蔬粉、代用茶、蜜饯、配制酒、果酒和果冻。
一种酚酞人工抗原组合，包括包被原和免疫原，所述包被原由酚酞半抗原PT-4C或酚酞半抗原PT-6C偶联鸡卵清白蛋白得到；所述免疫原由酚酞半抗原PT-4C或酚酞半抗原PT-6C偶联牛血清白蛋白得到。
优选地，所述包被原由酚酞半抗原PT-4C偶联鸡卵清白蛋白得到，即包被原为酚酞人工抗原PT-4C-OVA。
优选地，所述免疫原由酚酞半抗原PT-6C偶联牛血清白蛋白得到，即免疫原为酚酞人工抗原PT-6C-BSA。
更优选地，所述包被原由酚酞半抗原PT-4C偶联鸡卵清白蛋白得到；所述免疫原由酚酞半抗原PT-6C偶联牛血清白蛋白得到；即包被原为酚酞人工抗原PT-4C-OVA，免疫原为PT-6C-BSA。
一种酚酞抗体，由上述免疫原免疫动物制备得到。
优选地，所述酚酞抗体为单克隆抗体，则由上述任一免疫原免疫动物得到杂交瘤细胞，培养所得杂交瘤细胞并收集细胞上清，经过鉴定纯化，即得到酚酞单克隆抗体。
优选地，所述酚酞抗体为多克隆抗体，则由上述任一免疫原免疫动物，收集血清，经硫酸铵沉淀法纯化后得到多克隆抗体。
更优选地，所述免疫原由酚酞半抗原PT-6C偶联牛血清白蛋白得到，即免疫原为PT-6C-BSA。
一种酚酞的免疫分析方法，使用任一上述酚酞人工抗原组合进行检测，以所述酚酞抗体为检测抗体进行检测；所述免疫分析方法以非疾病治疗诊断为目的。
优选地，所述酚酞人工抗原组合中，包被原由酚酞半抗原PT-4C偶联鸡卵清白蛋白得到；所述酚酞抗体由酚酞半抗原PT-6C偶联牛血清白蛋白得到的免疫原免疫动物制备得到。
上述酚酞人工抗原组合在制备检测酚酞的试剂中的应用也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述试剂用于鉴别减肥食品中的酚酞。
本发明所涉及的减肥食品为具有减肥功能的食品，包括但不限于具有减肥功能的压片糖果、饮料、果蔬粉、代用茶、蜜饯、配制酒、果酒和果冻。
一种检测酚酞的试剂盒，包含任一上述酚酞人工抗原组合。
优选地，所述包被原由酚酞半抗原PT-4C偶联鸡卵清白蛋白得到；所述免疫原由酚酞半抗原PT-6C偶联牛血清白蛋白得到。
更优选地，所述试剂盒包含抗体，所述抗体由酚酞半抗原PT-6C偶联牛血清白蛋白得到的免疫原免疫动物得到。
优选地，所述试剂盒还包含酶标板、酚酞标准品和底物显色液。所述酚酞标准品的CAS号：77-09-8。
更优选地，所述酶标板上包被有由酚酞半抗原PT-4C偶联鸡卵清白蛋白得到的包被原。
更优选地，所述底物显色液包含过氧化脲和四甲基联苯胺。
更优选地，所述试剂盒还包含终止液、洗涤液和封闭液、酶结合物浓缩液和酶结合物稀释液。
进一步优选地，所述终止液为1mol/L～3mol/L H2SO4.
最优选地，所述终止液为2mol/L H2SO4。
进一步优选地，所述洗涤液为含有0.5％w/v～1.0％w/v吐温-20和0.01％w/v～0.03％w/v叠氮化钠的0.1mol/L～0.3mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.2～7.6。
最优选地，所述洗涤液为含有0.8％w/v吐温-20和0.02％w/v叠氮化钠的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
进一步优选地，所述封闭液为含有1％w/v～3％w/v酪蛋白的0.1mol/L～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，pH 7.1～7.5。
最优选地，所述封闭液为含有2％w/v酪蛋白的0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH 7.3。
进一步优选地，所述酶结合物浓缩液为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体或羊抗鼠抗体。
进一步优选地，所述酶结合物稀释液为0.1mol/L～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。
最优选地，所述酶结合物稀释液为0.2mol/L磷酸盐缓冲液。
优选地，所述试剂盒还包含免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次搭接的样品垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜为设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；所述的检测区包被有上述酚酞人工抗原组合中的包被原，质控区包被有IgG。
优选地，所述酚酞人工抗原由酚酞半抗原PT-4C偶联鸡卵清白蛋白得到。
优选地，所述IgG为羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
所述酚酞胶体金快速检测试纸条的使用方法如下：
待测样品与胶体金标记的抗体混合均匀，25℃孵育5min，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；将酚酞胶体金快速检测试纸条的样品垫2于混合液中静置3min后取出去除样品垫2，进行结果判定；
具体判定方法为：
控制线不显色，则检测效果无效，需重新检测；控制线显示红色，则检测效果有效，进一步判读检测线：检测线不显色或者显色很弱，即表示待测样品中含有酚酞，判读结果为阳性或者弱阳性；检测线显示红色，即表示待测样品中不含酚酞，判读结果为阴性。
优选地，所述试剂盒用于鉴别减肥食品中的酚酞。
本发明所涉及的减肥食品为具有减肥功能的食品，包括但不限于具有减肥功能的压片糖果、饮料、果蔬粉、代用茶、蜜饯、配制酒、果酒和果冻。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了既能最大程度保留酚酞中的三个苯环和内酯环特征结构，又具有一定长度连接臂的酚酞半抗原，还提供了该酚酞半抗原制备的方法。利用酚酞半抗原偶联载体蛋白制得到的酚酞人工抗原，经免疫动物后，可获得亲和力高的酚酞抗体，其半抑制浓度IC50为0.19ng/mL，最低检测限为0.007ng/mL，定量检测范围为0.02～1.64ng/mL，不仅检测灵敏度高，而且特异性强，准确度高，与多种酚酞结构类似物均无交叉反应，检测效果不受样本类型的影响，可推广用于减肥食品中酚酞的大规模快速精准筛查。
附图说明
图1为实施例2中酚酞包被原的鉴定结果；a为OVA、PT-4C和PT-4C-OVA的紫外扫描图；b为OVA、PT-6C和PT-6C-OVA的紫外扫描图。
图2为实施例2中酚酞免疫原的鉴定结果；a为BSA、PT-4C和PT-4C-BSA的紫外扫描图；b为BSA、PT-6C和PT-6C-BSA的紫外扫描图。
图3为用于检测酚酞的抗体间接竞争ELISA标准曲线。
图4为酚酞胶体金快速检测试纸条的结构示意图；1-PVC塑料底板；2-样品垫；3-基膜；4-吸水垫；5-测试线；6-控制线。
图5为实施例8的酚酞胶体金快速检测试纸条的结果判定图；A为阴性的检测结果，B为阳性的检测结果，C和D为无效的检测结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1酚酞半抗原的制备与鉴定
一、酚酞半抗原PT-4C的合成与鉴定
1、酚酞半抗原PT-4C的合成
将1mol酚酞溶于3mL N,N-二甲基甲酰基，后加入2mol 4-溴丁酸乙酯和6mol碳酸钾，室温(25℃)搅拌过夜(11h)，得到反应物；柱层析(固定相为硅胶粉，流动相为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1)分离纯化反应物，将所得纯化产物溶解于5mL甲醇，然后加入5mL 3mol/L氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3h，反应结束后调节pH为6～7，所得沉淀即为半抗原PT-4C。
2、酚酞半抗原PT-4C的鉴定
酚酞半抗原PT-4C的核磁共振氢谱结果为：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.88(dt,J＝7.7,1.0Hz,1H),7.73(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),7.61–7.54(m,2H),7.21–7.15(m,2H),7.11–7.06(m,2H),6.88–6.81(m,2H),6.78–6.72(m,2H),3.97(t,J＝6.2Hz,2H),2.46(t,J＝7.3Hz,2H),2.06–1.98(m,2H)。
酚酞半抗原PT-4C的质谱鉴定结果为：MS：C24H20O6：404.42，ESI+[M-H]+：405.44。
根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，质谱结果可对应上半抗原PT-4C分子量且核磁的氢谱数可对应半抗原PT-4C结构上的氢谱数，说明本发明成功制备了目标产物酚酞半抗原PT-4C，其结构式如式(Ⅰ)所示：
酚酞半抗原PT-4C采用系统命名法命名为：4-(4-(1-(4-hydroxyphenyl)-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)phenoxy)butanoic acid；即4-(4-(1-(4-羟基苯基))-3-氧-1，3-二氢异苯并呋喃-1-基)苯氧基)丁酸。
二、酚酞半抗原PT-6C的合成与鉴定
1、酚酞半抗原PT-6C的合成
将1mol酚酞溶于3mL N,N-二甲基甲酰基，后加入2mol 6-溴己酸乙酯和6mol碳酸钾，室温(25℃)搅拌过夜(11h)，得到反应物；柱层析(固定相为硅胶粉，流动相为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1)分离纯化反应物，将所得纯化产物溶解于5mL甲醇，然后加入5mL 3mol/L氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3h，反应结束后调节pH为6～7，所得沉淀即为半抗原PT-6C。
2、酚酞半抗原PT-6C的鉴定
酚酞半抗原PT-6C的核磁共振氢谱结果为：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.87(dt,J＝7.7,1.0Hz,1H),7.72(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),7.61–7.53(m,2H),7.20–7.15(m,2H),7.11–7.06(m,2H),6.86–6.81(m,2H),6.77–6.72(m,2H),3.91(t,J＝6.4Hz,2H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),1.77–1.69(m,2H),1.64(p,J＝7.4Hz,2H),1.50–1.42(m,2H)。
酚酞半抗原PT-6C的质谱鉴定结果为：MS：C26H24O6：432.47，ESI+[M-H]+：433.49。
根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，质谱结果可对应上半抗原PT-6C分子量且核磁的氢谱数可对应半抗原PT-6C结构上的氢谱数，说明本发明成功制备了目标产物酚酞半抗原PT-6C，其结构式如式(Ⅱ)所示：
酚酞半抗原PT-6C采用系统命名法命名为：6-(4-(1-(4-hydroxyphenyl)-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)phenoxy)hexanoic acid；即6-(4-(1-(4-羟基苯基))-3-氧-1，3-二氢异苯并呋喃-1-基)苯氧基)己酸。
实施例2酚酞人工抗原的合成与鉴定
将实施例1制备的酚酞半抗原PT-4C和酚酞半抗原PT-6C，通过活泼酯法分别偶联鸡卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)。
一、酚酞包被原的合成与鉴定
1、酚酞包被原的合成
将10mg实施例1的酚酞半抗原PT-4C溶解于100μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入2mg的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，25℃下避光搅拌4h得到A液。
将10mg OVA溶于1mL的PBS缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.4)中，得到B液。所用PBS缓冲液的配方为：Na2HPO4·12H2O 2.90g，NaCl 8.50g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.20g，加蒸馏水定容至1000mL。
将100μL A液逐滴加到1mL B液中，4℃搅拌12h；用PBS缓冲液透析两天，每天4次，即得到酚酞包被原PT-4C-OVA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
按照上述方法，区别仅在于用酚酞半抗原PT-6C代替酚酞半抗原PT-4C，制备得到酚酞包被原PT-6C-OVA。
2、酚酞包被原的鉴定
分别对OVA、PT-4C和PT-4C-OVA进行紫外扫描测定(200～400nm)，测定结果如图1中的a所示，酚酞包被原PT-4C-OVA的紫外吸收峰与半抗原PT-4C的紫外吸收峰相比发生显著位移，且酚酞包被原PT-4C-OVA同时具备半抗原PT-4C和OVA的特征吸收峰，说明酚酞包被原PT-4C-OVA偶联成功，其结构式如式(Ⅲ)所示，
其中，P为载体蛋白OVA。
分别对OVA、PT-6C和PT-6C-OVA进行紫外扫描测定(200～400nm)，测定结果如图1中的b所示，酚酞包被原PT-6C-OVA的紫外吸收峰与半抗原PT-6C的紫外吸收峰相比发生显著位移，且酚酞包被原PT-6C-OVA同时具备半抗原PT-6C和OVA的特征吸收峰，说明酚酞包被原PT-6C-OVA偶联成功，其结构式如式(Ⅳ)所示，
其中，P为载体蛋白OVA。
二、酚酞免疫原的合成与鉴定
1、酚酞免疫原的合成
制备方法与上述酚酞包被原的合成方法类似，区别在于，用BSA代替OVA，用实施例1制备的酚酞半抗原PT-4C和酚酞半抗原PT-6C合成酚酞免疫原PT-4C-BSA和PT-6C-BSA。
2、酚酞免疫原的鉴定
分别对BSA、PT-4C和PT-4C-BSA进行紫外扫描测定(200～400nm)，测定结果如图2中的a所示，酚酞免疫原PT-4C-BSA的紫外吸收峰与半抗原PT-4C的紫外吸收峰相比发生显著位移，且酚酞免疫原PT-4C-BSA同时具备半抗原PT-4C和BSA的特征吸收峰，说明酚酞免疫原PT-4C-BSA偶联成功，其结构式如式(Ⅲ)所示，
/>
其中，P为载体蛋白BSA。
分别对BSA、PT-6C和PT-6C-BSA进行紫外扫描测定(200～400nm)，测定结果如图2中的b所示，酚酞免疫原PT-6C-BSA的紫外吸收峰与半抗原PT-6C的紫外吸收峰相比发生显著位移，且酚酞免疫原PT-6C-BSA同时具备半抗原PT-6C和BSA的特征吸收峰，说明酚酞免疫原PT-6C-BSA偶联成功，其结构式如式(Ⅳ)所示，
其中，P为载体蛋白BSA。
实施例3抗体的制备
1、多克隆抗体的制备
将实施例2制备的酚酞免疫原PT-4C-BSA和PT-6C-BSA分别与免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按照体积比为1：1乳化均匀，用于免疫动物。
将2.5～3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式进行免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。加强免疫一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000rpm/min离心15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化后得到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
2、单克隆抗体的制备
将实施例2制备的酚酞免疫原PT-4C-BSA和PT-6C-BSA分别与免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按照体积比为1：1乳化均匀，用于免疫动物。
采用腹部皮下多点注射法免疫巴比西小鼠，每次加强免疫1周后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价，待抗体效价不再升高后，再进行一次加强免疫，7天后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，得到融合细胞。
采用HAT培养基从融合细胞中筛选出杂交瘤细胞后，用完全培养基培养杂交瘤细胞。用ic-ELISA方法对杂交瘤细胞的细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，一周后再次检测、挑孔、再克隆。经3次克隆培养检测后，获得单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。腹水用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后得到单克隆抗体，-20℃冻存备用。
实施例4酚酞免疫原和包被原的组合确定
以实施例2制备得到的人工抗原PT-4C-OVA和PT-6C-OVA作为包被原，使用实施例3中以PT-4C-BSA和PT-6C-BSA作为免疫原制得的抗血清，通过检测抗血清的效价和抑制率来选择最佳的免疫原和包被原的组合。具体方法步骤如下：
1、用包被液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6)分别将包被原PT-4C-OVA和PT-6C-OVA稀释至1μg/mL，按照100μL/孔包被96孔酶标板，37℃温育12h；
2、弃去包被液，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗涤2次；
3、每孔加入120μL封闭液(1wt％鱼皮胶原蛋白，PBST稀释)，37℃封闭3h；
4、弃去封闭液，37℃烘干30min后取出；
5、用PBST缓冲液将免疫雌性Balb/c小鼠所获得的抗血清倍比稀释成7个梯度，即1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000，同时设置空白对照孔(即PBST缓冲液)；并用PBST缓冲液将酚酞标准品(CAS号：77-09-8)稀释至1μg/mL，即得到酚酞标准品稀释液；
6、效价列加样的方法为：每孔加50μL的PBST，再将稀释得到的7个梯度的抗血清按50μL/孔依次加入孔内，最后一个孔加入50μL PBST缓冲液；
抑制列加样的方法为：每孔加50μL的1μg/mL酚酞标准品稀释液，再将稀释得到的7个梯度的抗血清按50μL/孔依次加入孔内，最后一个孔加入50μL PBST缓冲液；
7、37℃温育40min，洗涤5次；
8、向效价列和抑制列加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤五次；
9、加入孔显色液100μL/，显色10min，显色液由过氧化脲和四甲基联苯胺按照体积比1：1混合均匀得到；
10、加入2mol/L的H2SO4溶液50μL/孔终止反应，并在450nm处读取OD值，统计效价和抑制率，效价是OD450为1.0左右所对应的抗血清稀释倍数，抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/抑制的OD值×100％。
不同免疫原与包被原组合的抗血清效价和抑制率结果如表1所示。
表1不同免疫原与包被原组合的血清效价和抑制率
从表1中可以看出，酚酞人工抗原PT-3-BSA和PT-5-BSA作为免疫原，产生的抗血清均有一定的效价，且都在1：128000以上；同时，所得抗血清对目标分析物酚酞均有不同程度的抑制效果，且都在80％以上。以上结果表明，本发明制得的免疫原和包被原不仅能特异性识别目标分析物酚酞，而且灵敏度高。
其中，编号3的免疫原和包被原组合所示的效价1：256000和抑制率98.87％，高于其余的免疫原和包被原组合的效价和抑制率，所以PT-6C-BSA作为最佳的免疫原，PT-4C-OVA作为最佳的包被原。
实施例5快速鉴别酚酞的间接竞争ELISA检测方法的建立
一、一种快速鉴别酚酞的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：
1、将实施例2制备的人工抗原PT-4C-OVA或PT-6C-OVA作为包被原，用包被液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6))稀释至50μg/L，按照100μL/孔包被96孔酶标板，37℃温育12h；
2、弃去包被液，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗涤2次；
3、每孔加入120μL封闭液(即1wt％鱼皮胶原蛋白，PBST稀释)，37℃封闭3h；
4、弃去封闭液，37℃烘干30min后取出；
5、用PBST缓冲液将实施例3制备的单克隆抗体稀释16000倍，并用PBST缓冲液将并将酚酞标准品(CAS号：77-09-8)分别稀释至1000μg/L、200μg/L、40μg/L、8μg/L、1.6μg/L、0.32μg/L、0.064μg/L和0.0128μg/L；
6、将上一步所得不同浓度的酚酞标准品按照50μL/孔加至酶标板；再将上一步所得稀释16000倍的实施例3制备的单克隆抗体，按照加入50μL/孔加至酶标板；设置3个平行重复；
7、在37℃温育40min，洗涤5次；
8、加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
9、加入显色液100μL/孔，显色10min，显色液由过氧化脲和四甲基联苯胺按照体积比1：1混合均匀得到；
10、加入2mol/L的H2SO4溶液50μL/孔终止反应，并在450nm处读取OD值。
11、以B/B0作为纵坐标(B为添加标准品时的吸光值OD450，B0为不添加标准品时的吸光值OD450)，标准品浓度的对数为横坐标，采用Logistic函数进行曲线拟合，得到标准曲线的公式，并制得标准曲线。
二、实验结果
共得到4组用于检测酚酞的抗体间接竞争ELISA标准曲线。其中以PT-6C-BSA作为免疫原得到的单克隆抗体并以PT-4C-OVA作为包被原制得的标准曲线如图3所示，从中可以看出实施例3制备的单克隆抗体对酚酞的半抑制浓度IC50为0.19ng/mL，定量检测线性范围IC20～IC80为0.02～1.64ng/mL，检测限为0.007ng/mL。说明本发明制备得到的用于检测酚酞的抗体可以满足检测要求，成功建立减肥食品中酚酞的间接竞争ELISA检测方法，该方法的灵敏度高。
实施例6本发明酚酞抗体的特异性评价
一、实验方法
酚丁、双醋酚丁、双丙酚丁、双酚沙丁、双酚沙丁醋酸酯、邻甲酚酞、α-萘酚酞、百里酚酞和二苯酞内酯均为酚酞的结构类似物，且酚酞、酚丁、双醋酚丁、双丙酚丁、双酚沙丁、双酚沙丁醋酸常被添加于减肥产品中。
本实施例通过交叉反应实验来确定本发明制备的抗体对检测酚酞的特异性。
按照实施例5的检测方法，区别仅在于：将酚酞标准品替换为酚丁(CAS号：125-13-3)、双醋酚丁(CAS号：115-33-3)、双丙酚丁(厂家：麦克林；货号：D916002)、双酚沙丁(CAS号：17692-24-9)、双酚沙丁醋酸酯(CAS号：14008-48-1)、邻甲酚酞(CAS号：596-27-0)、α-萘酚酞(CAS号：596-01-0)、百里酚酞(CAS号：125-20-2)和二苯酞内酯(CAS号：596-29-2)，以同样的稀释倍数进行检测，得到各结构类似物的IC50值。
按照以下公式计算酚酞交叉反应率(CR)：CR(％)＝IC50(酚酞)/IC50(结构类似物)×100％，交叉反应率越小，则表示特异性越强。
二、实验结果
酚酞与其结构类似物的交叉反应结果如表2所示。
表2酚酞与其结构类似物的交叉反应结果
注：NR表示无反应。
从表2可知，用于检测酚酞的抗体对多种结构类似物(酚丁、双醋酚丁、双丙酚丁、双酚沙丁、双酚沙丁醋酸酯、邻甲酚酞、α-萘酚酞、百里酚酞和二苯酞内酯)均无交叉反应，说明用于检测酚酞的实施例3制备的抗体对酚酞的特异性强，可有效地排除其结构类似物对酚酞的干扰，能够专门用于对酚酞的检测。
实施例7一种检测酚酞的ELISA试剂盒
一、组成
1、包被有包被原的酶标板：
所述酶标板由如下方法制备得到：
将实施例2制备的人工抗原PT-4C-OVA或PT-6C-OVA作为包被原，用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6)将包被原稀释至50μg/L，100μL/孔加入酶标板，37℃避光孵育过夜，除去孔中液体，用本试剂盒中的洗涤液洗涤2次，每次30s，然后加入本试剂盒的封闭液200μL/孔，25℃避光孵育2h，除去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；
2、标准品：
8个不同浓度的酚酞标准品溶液，浓度分别为1000ng/mL、200ng/mL、40ng/mL、8ng/mL、1.6ng/mL、0.32ng/mL、0.064ng/mL和0.0128ng/mL；
3、抗体：
实施例3中的以酚酞免疫原PT-6C-BSA作为免疫原制备得到的多克隆抗体或单克隆抗体；
4、酶结合物：
辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗或辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗；
5、底物显色液：
由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
6、终止液：
2mol/L的H2SO4；
7、其他试剂
洗涤液：pH值为7.4，含有体积分数为0.8％吐温-20、质量分数为0.02％叠氮化钠防腐剂、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；使用前用水将洗涤液稀释20倍(即1份洗涤液加入19份水，现配现用)，即得到洗涤液工作液；
封闭液：pH值为7.3，含有质量分数为2％酪蛋白的0.2mol/L磷酸盐缓冲液；
酶结合物稀释液：0.2mol/L磷酸盐缓冲液；使用前用水将稀释液稀释20倍(即1份稀释液加入19份水，现配现用)，即得到酶结合物稀释液。
二、使用方法
1、样品检测
将样品和本试剂盒的标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将抗体用稀释液工作液按1：40体积比进行稀释(即1份抗体加入40份稀释液工作液，现配现用)，得到抗体工作液。根据需要量将酶结合物浓缩液用稀释液工作液按1:10体积比进行稀释(即一份酶结合物浓缩液加入10份稀释液工作液，现配现用)，得到酶结合物工作液。
加入标准品或样品50μL到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50μL到相应的微孔中，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。
将孔内液体甩干，加入洗涤液工作液250μL/孔。充分洗涤4～5次，每次间隔10s，弃掉板孔内洗涤液工作液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可使用未使用过的枪头戳破)。
加入酶结合物工作液100μL/孔到对应的微孔中,轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。
将孔内液体甩干，加入洗涤液工作液250μL/孔。充分洗涤4～5次，每次间隔10s，弃掉板孔内洗涤液工作液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可使用未使用过的枪头戳破)。
加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。
加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
2、标准曲线的绘制
根据上述最优条件绘制ELISA标准曲线，以B/B0作为纵坐标(B为添加标准品时的吸光值OD450，B0为不添加标准品时的吸光值OD450)，标准品浓度的对数为横坐标，采用Logistic函数进行曲线拟合，得到标准曲线的公式，并制得标准曲线。
3、样品浓度的计算
将样品的测定的吸光值OD450值代入上述计算公式，计算得到样品的百分吸光率；将样品的百分吸光率代入上述标准曲线的公式，得到样品的浓度，再乘以其对应的稀释倍数即得到检测样本中酚酞的实际浓度。
实施例8用于快速鉴别减肥食品中酚酞的胶体金快速检测试纸条的制备及检测方法的建立
一、用于快速鉴别减肥食品中酚酞的胶体金快速检测试纸条的制备
如图4所示，胶体金快速检测试纸条是由NC膜(硝酸纤维素膜)、样品垫、吸水垫和PVC塑料底板叠加而成。
用XYZ三维喷点划膜仪将包被原(PT-4C-OVA或PT-6C-OVA)以0.8μL/cm的喷量喷涂在NC膜上，作为测试线5；以相同的方法和剂量将羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG喷涂在NC膜上，作为控制线6；测试线5和控制线6位于NC膜的中间并且彼此间隔6mm；37℃下干燥12h后，把纤维素膜粘贴在衬板中间部位上，样品垫与NC膜的测试线端重叠1mm，吸水垫粘贴在纤维素上侧和纤维素膜3重叠1mm，组装好的试纸板用斩切机切成3.5mm宽的试纸条。
二、金标抗体的制备
采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备平均直径在30nm的胶体金悬浮液，具体方法如下：
取1mL胶体金溶液，加入0.2mol/L的K2CO3溶液调节pH到8.0左右，加入10μg多克隆抗体或单克隆抗体孵育30min；再加入10％wt BSA溶液孵育30min；在4℃10000rpm离心20min，弃去上清；用200μL 0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(包含0.5％v/v吐温-20、0.5％wtBSA、5％wt蔗糖、0.3％wt PVP、0.03％v/v procline-300，pH7.4)重悬沉淀，即得到金标抗体，于4℃保存。
三、样品前处理
1、压片糖果、饮料、果蔬粉、代用茶、蜜饯、配制酒和果酒
准确称取1.0g样品于10mL离心管中，加入5mL 50％v/v甲醇溶液(含0.1％甲酸)，超声提取5min，冷却至室温，经4000rpm离心5min，吸取1.0mL上清，用0.02M PB四倍稀释，涡旋均匀后用微孔滤膜过滤，即得到供试液，待测。
2、果冻
准确称取1.0g样品于10mL离心管中，加入5mL水，80℃水浴至样品溶解，冷却至室温，加入5mL甲醇，超声提取5min经4000rpm离心5min，吸取1.0mL上清，用0.02M PB四倍稀释，涡旋均匀后用微孔滤膜过滤，即得到供试液，待测。
四、检测方法
取150μL供试液与5μL金标抗体混合均匀，25℃孵育5min；将酚酞胶体金快速检测试纸条的样品垫2插入混合液中反应3min后取出，去除样品垫2，进行结果判定。
五、结果判定
如图5中的A所示，当测试线5和质控线6均显示一条清晰的红色线，表明金标抗体分别与测试线5的包被原和质控线6的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG结合，即检测样品中不含有待测物酚酞，则判定检测结果为阴性；如图5中的B所示，测试线5不显色，仅有质控线6显示一条清晰的红色线，表明金标抗体分别与质控线6的羊抗兔IgG或羊抗鼠和检测样品中的酚酞结合，未与测试线5的包被原结合，即检测样品中含有待测物酚酞，则判定检测结果为阳性；如图5中的C和D所示，质控线6未显示红色线时，无论测试线5是否显色，检测结果均判定为无效，需重新进行检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酚酞半抗原，其特征在于，所述酚酞半抗原的结构式如式(Ⅰ)所示，
2.一种酚酞半抗原，其特征在于，所述酚酞半抗原的结构式如式(Ⅱ)所示，
3.权利要求1或2所述酚酞半抗原在制备酚酞人工抗原中的应用。
4.一种酚酞人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述的酚酞半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅲ)所示，
其中，P为载体蛋白，所述载体蛋白为鸡卵清蛋白或牛血清白蛋白。
5.一种酚酞人工抗原，其特征在于，由权利要求2所述的酚酞半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅳ)所示，
其中，P为载体蛋白，所述载体蛋白为鸡卵清蛋白或牛血清白蛋白。
6.权利要求4和/或权利要求5所述酚酞人工抗原在制备酚酞的抗体中的应用。
7.一种酚酞人工抗原组合，其特征在于，包括包被原和免疫原，所述包被原由权利要求1或权利要求2所述的酚酞半抗原偶联鸡卵清白蛋白得到；所述免疫原由权利要求1或权利要求2所述的酚酞半抗原偶联牛血清白蛋白得到。
8.权利要求7所述酚酞人工抗原组合在制备检测酚酞的试剂中的应用。
9.一种检测酚酞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述酚酞人工抗原组合。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包含免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次搭接的样品垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜为设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；所述的检测区包被有权利要求7中所述的包被原，质控区包被有IgG。
CN202310871596.1A 2023-07-14 2023-07-14 用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用 Pending CN117126123A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310871596.1A CN117126123A (zh) 2023-07-14 2023-07-14 用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310871596.1A CN117126123A (zh) 2023-07-14 2023-07-14 用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117126123A true CN117126123A (zh) 2023-11-28

Family

ID=88860658

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310871596.1A Pending CN117126123A (zh) 2023-07-14 2023-07-14 用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117126123A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116554339A (zh) * 2022-08-22 2023-08-08 华南农业大学 一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116554339A (zh) * 2022-08-22 2023-08-08 华南农业大学 一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体及其应用
CN116554339B (zh) * 2022-08-22 2024-05-10 华南农业大学 一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9176124B2 (en) Method for measurement of equol in biological sample by immunoassay, kit for the measurement, and method for determination of equol production ability of subject
CN112250617B (zh) 一种匹可硫酸钠半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN117126123A (zh) 用于快速鉴别减肥食品中酚酞的半抗原、人工抗原及其应用
Chu Immunoassays for mycotoxins
CN107014993B (zh) 一种检测动物源性食品中头孢类抗生素的间接竞争elisa试剂盒及其应用
CN104109112B (zh) 赛庚啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN112142833B (zh) 一种呋塞米人工抗原、抗体及其在检测呋塞米中的应用
CN113968853B (zh) 阿托品类生物碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN112250641A (zh) 双氢克尿噻半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN114539205B (zh) 一种黄樟素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN115521240A (zh) 一种二甲基色胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
US5811401A (en) Advanced glycosylation endproducts and methods of use therefor
EP4109099A1 (en) Bioconjugates and antibodies for immunodetection assisted by derivatization of the mycotoxin patulin
CN114605322B (zh) 一种右美沙芬半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN117447380A (zh) 用于同时检测减肥食品中酚丁类物质的半抗原、人工抗原及其应用
CN117447418A (zh) 用于同时检测减肥食品中双酚沙丁和双酚沙丁醋酸酯的半抗原、人工抗原及其应用
CN112624975A (zh) 一种妥拉唑林半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用
CN114591243B (zh) 一种安替比林半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN115124443B (zh) 一种尼卡巴嗪代谢物半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN117551074A (zh) 一种同时检测氯雷他定和地氯雷他定的半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
CN117362172B (zh) 一种壬基酚半抗原及其制备方法和应用
US20230393159A1 (en) Dimethyltryptamine hapten, artificial antigen and preparation methods and application thereof
CN116425759A (zh) 一种用于食品中多种那非类药物同时检测的半抗原、人工抗原及其应用
CN104788383B (zh) 可乐定半抗原、抗原及其制备方法和应用
CN110818599B (zh) 一种磺胺类药物半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination