CN116554339B - 一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性识别甲萘威和/或1‑萘酚的双特异性纳米抗体及其应用，所述双特异性纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该双特异性纳米抗体具有较高的热稳定性和有机耐受性等特性；以短肽连接子G4S连接之后可成功保留结合活性，实现一种抗体的多功能化，且操作简单、所耗时间较短；其检测效果不亚于各单体进行相同ELISA检测的灵敏度，甚至通过连接子的最佳选择结合低温控制可实现进一步提高灵敏度和降低检测限，其中LODCBR低至0.85ng/mL，LOD1‑NAP低至0.38ng/mL，具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地，涉及一种抗甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体及其应用。
背景技术
甲萘威(carbaryl)是氨基甲酸酯类杀虫剂中第一个大量生产的品种，对害虫有强烈的触杀作用，主要用于防治棉花、水稻及果树害虫。1-萘酚(1-naphthol)是甲萘威的主要代谢产物之一，是农药、染料、医药等方面的重要中间体，广泛应用于染料、香料和油脂的合成。
对农作物中残留的甲萘威及1-萘酚进行准确检测是避免甲萘威及1-萘酚对人畜健康造成损伤的重要手段。目前国家标准中，对于1-萘酚，尚未有明确具体国标最低限量，对于甲萘威的检测方法主要为仪器分析方法，如色谱与质谱联用的检测方法等。此类检测方法灵敏度和准确度高，但是需要昂贵的设备和试剂以及专业的操作人员，此外还需要经过复杂的制样过程，其耗费的时间和成本远远无法满足目前市场对大量农产品进行筛查的需要。
免疫分析方法近年来发展起来的一种基于抗体特异性识别抗原分子并通过信号分子释放出的信号强度反映待测物含量的分析方法。免疫分析方法的特点是能够特异性的识别一种或一类目标分析物，灵敏度高，相较仪器分析方法而言所需设备简单，对操作人员专业要求低，检测时间短，有的免疫分析方法甚至能够在几分钟内对待测样品进行半定量或定量分析。常用的免疫分析方法有酶联免疫分析法、侧流免疫分析法、荧光免疫分析法、电化学免疫分析法等。免疫分析方法成功的关键在于制备灵敏度高特异性强的抗体。由于抗体的本质是蛋白质，因此免疫分析法必须在温和的条件下(合适的浓度的盐离子溶液、接近37℃的环境、偏中性的pH值、低浓度的有机溶剂等)进行，且需要避免免疫制剂在保存和运输过程中失活，影响其检测活性。
纳米抗体是一种新型的抗体制剂。1993年比利时科学家在羊驼科动物身上发现了天然缺失轻链的重链抗体。后来人们通过基因工程技术表达出这种重链抗体的抗原结合区，这种单个结构域的重链抗体片段是目前人们通过基因工程手段制备出的具有抗原识别与结合能力的最小抗体片段，其分子量大小只有15kDa左右，仅为传统抗体的十分之一左右，其尺寸处于纳米级别，故又称为“纳米抗体”。
在纳米抗体应用的过程中，人们发现了纳米抗体具有一些有别于传统抗体的性质，其中最典型的是纳米抗体能够在高温处理后以及在一定浓度的有机溶剂中仍保留着较高的抗原结合能力，这些性质可以使样品前处理过程得到一定简化。同时纳米抗体还可通过基因工程改造成双特异性或多特异性，实现一种抗体多功能化，且总分子量大小仅为30kDa左右，在基因工程及免疫检测方面具有较大的发展潜力，使得免疫分析法更加能满足市场对快检的需求。双特异性纳米抗体因其分子量小，特异性强，构建体的表达水平、纯化的容易程度和溶解度与组成单体的相当甚至可能更优，且能同时保留两种不同纳米抗体的功能活性和优势等特点而备受人们关注，逐渐成为纳米抗体分子改造研究领域的热点之一。
现甲萘威纳米抗体已成功制备(中国农业大学)，1-萘酚纳米抗体也已成功制备(华南农业大学)，并通过检测比对多株同源抗体的活性得到含以上两种纳米抗体的最优单体序列质粒，对于1-萘酚的ELISA方法，检测灵敏度目前最低为7.6ng/mL，基于1-萘酚未有国标最低检测限量，因此，其检测方法依然有进步空间。为了更好地监测甲萘威的残留及代谢情况，发明一种能准确地同时检测甲萘威及其主要代谢产物1-NAP的检测技术至关重要。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体及其应用，本发明提供的双特异性纳米抗体可通过基因工程重组表达的方式进行大量制备，基因工程重组表达的方式是将编码该双特异性纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该双特异性纳米抗体的大量制备，其优势之一也在于仅需表达一种抗体蛋白，减少耗材，简化整个表达、纯化流程。该双特异性纳米抗体为将双特异性纳米抗体经过原核生物表达后，以蛋白的形式进行免疫学检测分析。
本发明的第一个目的是提供一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体。
本发明的第二个目的是提供一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体的编码基因。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
本发明的第四个目的是提供一种细胞。
本发明的第五个目的是提供所述的双特异性纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、所述的细胞在检测甲萘威和/或1-萘酚中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述的双特异性纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、所述的细胞在制备检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种检测甲萘威和/或1-萘酚的方法。
本发明的第八个目的是提供一种检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明要求保护一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS-GRIFSSDG-PGWFRQAPGKEREFVAA-ISRLGGST-YYADSVKGRFTISRDLAKKTAYLQMNSLKPEDTAVYYC-ASRRPGGSYDYTGDYAY-WGQGTQVTVSS-EPKTPKPQG-GGGGS-EVQLVQSGGGSVQAGGSLRLSCAAS-GDTYSRYTNTYC-MGWFRQAPGTEREGVAG-IDRFGIAT-YADSVKGRFTISQDKSENTLYLQMNGLKPEDTAMYYC-AAVRYCSGHIRDAKGPRLGGF-SWGQGTLVTVSS；
其中，框架区C-FR1的氨基酸如SEQ ID NO.2所示：
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS；
框架区C-FR2的氨基酸如SEQ ID NO.3所示：
PGWFRQAPGKEREFVAA；
框架区C-FR3的氨基酸如SEQ ID NO.4所示：
YYADSVKGRFTISRDLAKKTAYLQMNSLKPEDTAVYYC；
框架区C-FR4及铰链区的氨基酸如SEQ ID NO.5所示：
WGQGTQVTVSS-EPKTPKPQG；
互补决定区C-CDR1的氨基酸如SEQ ID NO.6所示：
GRIFSSDG；
互补决定区C-CDR2的氨基酸如SEQ ID NO.7所示：
ISRLGGST；
互补决定区C-CDR3的氨基酸如SEQ ID NO.8所示：
ASRRPGGSYDYTGDYAY；
短肽连接子G4S的氨基酸为：GGGGS；
框架区N-FR1的氨基酸如SEQ ID NO.9所示：
EVQLVQSGGGSVQAGGSLRLSCAAS；
框架区N-FR2的氨基酸如SEQ ID NO.10所示：
MGWFRQAPGTEREGVAG；
框架区N-FR3的氨基酸如SEQ ID NO.11所示：
YADSVKGRFTISQDKSENTLYLQMNGLKPEDTAMYYC；
框架区N-FR4的氨基酸如SEQ ID NO.12所示：
SWGQGTLVTVSS；
互补决定区N-CDR1的氨基酸如SEQ ID NO.13所示：
GDTYSRYTNTYC；
互补决定区N-CDR2的氨基酸如SEQ ID NO.14所示：
IDRFGIAT；
互补决定区N-CDR3的氨基酸如SEQ ID NO.15所示：
AAVRYCSGHIRDAKGPRLGGF。
本发明同时要求保护一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体的编码基因，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示：
CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCATCTTCAGTAGCGATGGCCCGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCCATTAGCAGGCTTGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACCTCGCCAAGAAAACGGCGTATTTGCAGATGAACAGCCTGAAACCTGAAGACACGGCCGTTTACTACTGTGCATCCCGGAGGCCGGGTGGTAGTTATGACTACACCGGGGACTATGCCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCGGTGGCGGCGGCTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAGACACCTATAGTAGATACACCAATACCTATTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGACGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGGTATCGATAGATTTGGTATTGCAACATACGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCCAAGACAAATCCGAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACGGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCGGTCCGTTATTGTAGTGGTCACATCCGCGACGCGAAAGGGCCCAGACTTGGGGGCTTCTCGTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA。
本发明还要求保护一种重组载体，含有所述的编码基因或表达所述双特异性纳米抗体。
优选地，所述载体为表达载体。
优选地，所述表达载体为pComb3xSS。
本发明还要求保护一种细胞，其特征在于，含有所述的重组载体。
优选地，所述细胞为大肠杆菌细胞。
所述的双特异性纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、所述的细胞在检测甲萘威和/或1-萘酚中的应用；
所述的双特异性纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、所述的细胞在制备检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒中的应用，
也都属于本发明的保护范围。
进一步，本发明要求保护一种检测甲萘威和/或1-萘酚的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的双特异性纳米抗体。
优选地，所述方法为基于间接ELISA的方法，以式(III)所述甲萘威完全抗原和式(IV)所述1-萘酚完全抗原中的一种或两种作为检测抗原，以权利要求1所述双特异性纳米抗体作为检测抗体。
以及，一种检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒，含有所述的双特异性纳米抗体。
优选地，还含有式(III)所述甲萘威完全抗原和式(IV)所述1-萘酚完全抗原中的一种或两种作为包被抗原，
更优选地，所述试剂盒还含有甲萘威标准品、1-萘酚标准品、酶标抗体、显色剂和终止剂中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明双特异性纳米抗体可以应用于甲萘威及其主要代谢产物1-萘酚残留的实际样品检测。该双特异性纳米抗体具有较高的热稳定性和有机耐受性等特性，一方面，连接之后可成功保留结合活性，实现一种抗体的多功能化，且操作简单、所耗时间较短；另一方面，双特异性纳米抗体的效果不亚于各单体进行相同ELISA检测的灵敏度，甚至通过连接子的最佳选择结合低温控制可实现进一步提高灵敏度和降低检测限，其中LODCBR低至0.85ng/mL，LOD1-NAP低至0.38ng/mL。本发明制备双特异性纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质纳米抗体的改造和制备，具有很高的应用价值。
附图说明
图1为甲萘威和1-萘酚半抗原与包被原的紫外吸收光谱图：(A)甲萘威半抗原与包被原；(B)1-萘酚半抗原与包被原。
图2为双特异性纳米抗体BsNb-C-N的SDS-PAGE示意图。
图3为基于双特异性纳米抗体(BsNb-C-N)建立的甲萘威和1-萘酚间接竞争ELISA标准曲线。
图4为不同长度连接子所构建出的双特异性纳米抗体的竞争曲线示意图：(A)连接子G4S和(G4S)3对甲萘威的竞争曲线比对；(B)连接子G4S和(G4S)3对1-萘酚的竞争曲线比对。
图5为双特异性纳米抗体BsNb-C-N在不同包被原浓度下的活性示意图：(A)BsNb-C-N在不同浓度甲萘威包被原下的竞争活性；(B)BsNb-C-N在不同浓度甲萘威包被原下的Amax/IC50比对；(C)BsNb-C-N在不同浓度1-萘酚包被原下的竞争活性；(D)BsNb-C-N在不同浓度1-萘酚包被原下的Amax/IC50比对。
图6为双特异性纳米抗体BsNb-C-N在不同甲醇/乙腈/丙酮浓度下的活性示意图：(A)和(B)BsNb-C-N在不同甲醇浓度下对甲萘威和1-萘酚的竞争活性；(C)和(D)BsNb-C-N在不同乙腈浓度下对甲萘威和1-萘酚的竞争活性；(E)和(F)BsNb-C-N在不同丙酮浓度下对甲萘威和1-萘酚的竞争活性。
图7为双特异性纳米抗体BsNb-C-N在不同温度下的活性示意图：(A)BsNb-C-N在不同温度下对甲萘威的竞争活性；(B)BsNb-C-N在不同温度下对甲萘威的竞争活性。
图8为双特异性纳米抗体BsNb-C-N在不同pH的PBS中的活性示意图：(A)BsNb-C-N在不同pH的PBS中对甲萘威的竞争活性；(B)BsNb-C-N在不同pH的PBS中对1-萘酚的竞争活性。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1纳米抗体的编码基因BsNb-C-N的制备
1-萘酚半抗原的设计与合成、1-萘酚纳米抗体序列筛选由实验室前期工作完成，甲萘威半抗原的设计与合成、甲萘威纳米抗体序列筛选由中国农业大学实验室工作完成。
一、甲萘威人工抗原(CBR-BSA)和1-萘酚人工抗原(1-NAP-BSA)的制备
1、实验方法
称取26.9mg甲萘威半抗原(结构式如式I所示)，加入0.5mL 1,4二氧六环溶解。称取200mg牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)加入20mL碳酸盐缓冲液(pH 9.4)配制成10mg/mL蛋白溶液。边搅拌边逐滴滴加活化后的半抗原，并用pH试纸确定溶液在碱性范围内，室温搅拌过夜。用PBS透析3次，分装后在-20℃冻存。扫描半抗原与BSA偶联前后的紫外吸收光谱图。
称取26.9mg 1-萘酚半抗原(结构式如式II所示)，加入0.5mL 1,4二氧六环溶解。称取200mg牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)加入20mL碳酸盐缓冲液(pH 9.4)配制成10mg/mL蛋白溶液。边搅拌边逐滴滴加活化后的半抗原，并用pH试纸确定溶液在碱性范围内，室温搅拌过夜。用PBS透析3次，分装后在-20℃冻存。扫描半抗原与BSA偶联前后的紫外吸收光谱图。
2、实验结果
扫描半抗原与BSA偶联前后紫外吸收光谱得到的结果如图1所示，(A)甲萘威半抗原与包被原；(B)1-萘酚半抗原与包被原。偶联后得到的甲萘威人工抗原CBR-BSA(结构式如式III所示)和1-萘酚人工抗原1-NAP-BSA(结构式如式Ⅳ所示)作为检测抗原，即包被原。
二、双特异性纳米抗体的编码基因C-N-VHH克隆
根据实验室前期工作的优化结果，选择分别对甲萘威或1-萘酚具有最佳结合活性的纳米抗体的编码基因序列CBR-VHH和1-NAP–VHH，采用PCR对1-萘酚纳米抗体和甲萘威纳米抗体序列进行两轮扩增，目的基因及所用到的引物序列如下表1所示。其中C-N-R1为3’端包含连接子G4S基因片段(TGGTTTTGGTGTCTT)的引物，C-N-F2为5’端包含与C-N-R1互补配对的连接子基因片段(GGTGGCGGCGGCTCT)的引物。
表1双特异性纳米抗体单体序列及目的基因扩增引物序列
第一轮PCR扩增需将含有甲萘威纳米抗体编码基因(CBR-VHH)的质粒Pcomb3xSS-CBR-VHH和含有1-萘酚纳米抗体编码基因(1-NAP-VHH)的质粒Pcomb3xSS-1-NAP-VHH中的目的基因片段分别扩增出来，同时利用含有连接子G4S的引物C-N-F2、C-N-R1分别引入连接子基因片段，以便进行二轮重叠延伸扩增。反应条件如表2表3所示：
表2CBR-VHH扩增体系
表3 1-NAP-VHH扩增体系
对扩增出的片段进行凝胶电泳验证，条带大小约400bp，利用试剂盒清洁回收得到纯化产物，其中根据表2所得产物为产物Ⅰ，根据表3所得产物为产物Ⅱ；第二轮PCR扩增则将上述产物Ⅰ、产物Ⅱ与引物C-N-F1、C-N-R2进行PCR反应，利用重叠延伸法，使两种含有可互补配对的连接子G4S的目的基因片段之间互为彼此的上下游引物进行互补配对，反应条件如表4所示，其中重叠延伸时间需延长至75s。
表4第二轮扩增体系
对扩增出的片段进行凝胶电泳验证，出现两个不同大小的条带，一条为最终目的条带，约800bp，另一条为中间产物，约400bp，切胶回收800bp的条带，再用DNA回收试剂盒进行纯化回收，得到产物Ⅲ即为纳米抗体的目标基因C-N-VHH。
三、重组质粒的构建
(1)实验方法
①C-N-VHH目标基因及载体的酶切
采用Sfi I酶对C-N-VHH目标基因及pComb3xSS载体进行酶切反应。酶切条件：50℃恒温反应16h。
pComb3xSS载体酶切产物通过琼脂糖凝胶回收分子量为3500bp的条带；C-N-VHH基因酶切产物通过DNA回收试剂盒直接清洁回收。
②酶切产物的连接
将载体pComb3xSS和C-N-VHH片段混匀(摩尔比1：3)，16℃反应16h后用DNA回收试剂盒清洁回收。
③测序
将上述所得酶连产物转化到感受态E.coil DH5a中并涂布于LB-Agar-Amp平板过夜培养得到单菌落。挑约10个单菌落接种于10管2mL LB-Amp中，37℃，250rpm培养约8h。每管取1mL菌液送至测序公司测序，选取序列结果完全正确的菌液扩培，部分存菌，部分用于提取质粒并浓度。同时根据DNA测序结果及密码子表可获得纳米抗体的氨基酸序列。
(2)实验结果
双特异性纳米抗体的编码基因C-N-VHH的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，其编码的双特异性纳米抗体的BsNb-C-N的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS-GRIFSSDG-PGWFRQAPGKEREFVAA-ISRLGGST-YYADSVKGRFTISRDLAKKTAYLQMNSLKPEDTAVYYC-ASRRPGGSYDYTGDYAY-WGQGTQVTVSS-EPKTPKPQG-GGGGS-EVQLVQSGGGSVQAGGSLRLSCAAS-GDTYSRYTNTYC-MGWFRQAPGTEREGVAG-IDRFGIAT-YADSVKGRFTISQDKSENTLYLQMNGLKPEDTAMYYC-AAVRYCSGHIRDAKGPRLGGF-SWGQGTLVTVSS；
其中，框架区C-FR1的氨基酸如SEQ ID NO.2所示：
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS；
框架区C-FR2的氨基酸如SEQ ID NO.3所示：
PGWFRQAPGKEREFVAA；
框架区C-FR3的氨基酸如SEQ ID NO.4所示：
YYADSVKGRFTISRDLAKKTAYLQMNSLKPEDTAVYYC；
框架区C-FR4及铰链区的氨基酸如SEQ ID NO.5所示：
WGQGTQVTVSS-EPKTPKPQG；
互补决定区C-CDR1的氨基酸如SEQ ID NO.6所示：
GRIFSSDG；
互补决定区C-CDR2的氨基酸如SEQ ID NO.7所示：
ISRLGGST；
互补决定区C-CDR3的氨基酸如SEQ ID NO.8所示：
ASRRPGGSYDYTGDYAY；
短肽连接子G4S的氨基酸为：GGGGS；
框架区N-FR1的氨基酸如SEQ ID NO.9所示：
EVQLVQSGGGSVQAGGSLRLSCAAS；
框架区N-FR2的氨基酸如SEQ ID NO.10所示：
MGWFRQAPGTEREGVAG；
框架区N-FR3的氨基酸如SEQ ID NO.11所示：
YADSVKGRFTISQDKSENTLYLQMNGLKPEDTAMYYC；
框架区N-FR4的氨基酸如SEQ ID NO.12所示：
SWGQGTLVTVSS；
互补决定区N-CDR1的氨基酸如SEQ ID NO.13所示：
GDTYSRYTNTYC；
互补决定区N-CDR2的氨基酸如SEQ ID NO.14所示：
IDRFGIAT；
互补决定区N-CDR3的氨基酸如SEQ ID NO.15所示：
AAVRYCSGHIRDAKGPRLGGF。
实施例2双特异性纳米抗体的BsNb-C-N的制备
一、实验方法
将实施例1得到的测序正确的质粒转化到感受态E.coil BL21(DE3)中并涂布于LB-Agar-Amp平板培养得到单菌落。挑一单菌落接种于10mL LB-Amp中，37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于100mL LB-Amp中，37℃，250rpm培养至对数期，加入IPTG至工作浓度，37℃，250rpm培养过夜。菌液离心并弃去上清，沉淀重新分散于10mL PBS，于-80℃冻结30min，37℃水浴融化，并将此过程重复3遍，超声处理30min，250rpm震荡2h充分提取蛋白，离心留上清，将上清通过镍-琼脂糖凝胶亲和层析纯化，即得表达的双特异性纳米抗体BsNb-C-N(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)。对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE验证。
二.实验结果
蛋白电泳结果如图2所示。目的蛋白BsNb-C-N的理论条带大小约为33kDa，从图中可见到35kDa处有一条明显清晰的条带，即为目的蛋白BsNb-C-N的条带。
实施例3基于间接ELISA法的纳米抗体工作浓度确定及甲萘威及1-萘酚的检测
一、实验方法
1、抗原固定化
将实施例1制备的甲萘威人工抗原(CBR-BSA)和1-萘酚人工抗原(1-NAP-BSA)分别用PBS稀释至0.25μg/mL，在酶标板上的不同的孔中分别进行检测抗原固定化。每孔各100μL，37℃静置过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗板两次后，每孔加入150μL质量分数为1％的BSA-PBS(w/v)溶液37℃静置1h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干备用。
2、确定抗体工作浓度
实施例2制备得到的纯化后的双特异性纳米抗体的BsNb-C-N(氨基酸序列如SEQID NO.1所示)先用0.01M PBS稀释至1μg/mL，再用PBS进行两倍梯度稀释，得到500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL等一系列不同质量浓度的纳米抗体，以及浓度为0的空白对照组PBS溶液。
酶标板中预先加入每孔50μL PBS，再加入50μL梯度稀释后的双特异性纳米抗体的BsNb-C-N，每个浓度共进行3孔重复试验，同时用3个孔进行空白对照(100μL PBS)。37℃孵育30min，PBST洗板5次，在吸水纸上拍干后每孔加入100μL用PBST稀释5000倍的HRP标记rabbit anti-camelid二抗。37℃孵育30min，PBST洗板5次，在吸水纸上拍干后每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光孵育10min，每孔加入50μL终止液，在酶标仪上读450nm OD值。
OD450nm为1.0处对应的抗体浓度即为纳米抗体工作浓度，为250ng/mL。
3、标准曲线绘制
将甲萘威与1-萘酚标准药物用PBS稀释成不同浓度的标准稀释液，依次加入酶标板中，每孔加入量50μL，每个浓度进行3孔重复试验，并准备3孔药物空白组(50μL PBS)。用PBS将纳米抗体稀释至工作浓度，每孔加入50μL抗体稀释液。按照(2)的操作方法进行ELISA试验后，用酶标仪读取450nm处的OD值。
将药物空白组OD450值平均值记为B0，将不同药物浓度下的OD450平均值记为Bx，用Excel计算不同药物浓度下的Bx/B0比值以及每组平行数据的标准差。以药物浓度为横坐标，Bx/B0比值为纵坐标，在Origin软件中绘制散点图并进行logistic函数拟合。
二、实验结果
测定结果如图3所示，根据IC50定义，用origin软件在标准曲线上计算抑制率50％时对应的横坐标值，实施例2制备得到的双特异性纳米抗体BsNb-C-N对甲萘威的检测灵敏度为0.063μg/mL，对1-萘酚的检测灵敏度为6.50ng/mL。根据IC10定义，用origin软件在标准曲线上计算抑制率10％时对应的横坐标值，实施例2制备得到的双特异性纳米抗体BsNb-C-N对甲萘威的检出限为0.85ng/mL，对1-萘酚的检出限为0.38ng/mL。
实施例4一种检测甲萘威与1-萘酚的试剂盒
一、试剂盒的组成
1、预包被板：用PBS将实施例1制备的甲萘威人工抗原(CBR-BSA)和1-萘酚人工抗原(1-NAP-BSA)分别稀释至500ng/mL，分别加入酶标板微孔中，每孔各100μL，37℃静置过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗板两次后，每孔加入150μL质量分数为1％的BSA-PBS(w/v)溶液于37℃静置1h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干备用。
2、酶标记抗体：用PBST稀释5000倍的HRP标记anti-VHH二抗
3、标准品：甲萘威与1-萘酚标准药物用PBS稀释成不同浓度的标准稀释液
4、缓冲液：含质量分数1％BSA的PBS
5、标记抗体稀释液：含质量分数1％BSA的PBS
6、显色剂：TMB底物液
7、终止液：体积比为10％的H2SO4
8、浓缩洗涤液:PBST(0.01M PBS，体积比0.05％Tween-20)
二、试剂盒的使用
甲萘威与1-萘酚检测试剂盒的使用方法与实施例3相同，具体步骤如下：
将不同浓度(1μg/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、0ng/mL)的甲萘威和1-萘酚标准药物稀释液以及经研磨、甲醇或乙腈超声提取、过滤、氮吹、PBS复溶等前处理提取的土壤、大米等实际样品稀释液分开依次加入酶标板中，每孔加入量50μL，每个浓度进行3孔重复试验，并准备3孔药物空白组(50μL PBS)。用PBS将纳米抗体稀释至工作浓度，每孔加入50μL抗体稀释液。37℃孵育30min，PBST洗板5次，在吸水纸上拍干后每孔加入100μL用PBST稀释5000倍的HRP标记rabbit anti-camelid二抗。37℃孵育30min，PBST洗板5次，在吸水纸上拍干后每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光孵育10min，每孔加入50μL终止液，在酶标仪上读取450nm处的OD值。
将标准药物空白组OD450值平均值记为B0，将不同药物浓度下的OD450平均值记为Bx，用Excel计算不同药物浓度下的Bx/B0比值以及每组平行数据的标准差。以药物浓度为横坐标，Bx/B0比值为纵坐标，在Origin软件中绘制散点图并进行logistic函数拟合。根据标准曲线和实际样品测得值，即可计算样品稀释液中含有的药物浓度。
实施例5不同连接子对所构建的双特异性纳米抗体的活性影响对比
一、实验方法
分别选取本发明所用连接子G4S以及常用短肽连接子(G4S)3，采用实施例1质粒重组的方法构建双特异性纳米抗体，并采用实施例2的表达方式制备双特异性纳米抗体，然后按照实施例3的方法进行检测比对，评价不同长度的连接子对双特异性纳米抗体结合活性及标曲的影响。
二、实验结果
测定结果如图4所示，(A)连接子G4S和(G4S)3对甲萘威的竞争曲线比对；(B)连接子G4S和(G4S)3对1-萘酚的竞争曲线比对。
本发明中采用G4S作为连接子构建的BsNb-C-N灵敏度显著优于常用连接(G4S)3构建出的双特异性纳米抗体，且针对1-萘酚小分子，G4S作为连接子构建的双特异性纳米抗体测出的IC50值低至6.50ng/mL，效果优于其单体进行ic-ELISA时所得到的灵敏度。以上结果说明，本发明以短肽G4S作为连接子构建得到的双特异性纳米抗体BsNb-C-N的效果最好。
实施例6不同质量分数的包被原对所构建的双特异性纳米抗体的活性影响对比
一、实验方法
用不同质量分数(1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL)的包被原(1-萘酚人工抗原1-NAP-BSA(结构式如式Ⅳ所示))包被在96孔酶标板上，采用实施例1质粒重组的方法构建双特异性纳米抗体，并采用实施例2的表达方式制备双特异性纳米抗体，然后按照实施例3的方法进行检测比对，得到OD450最大值Amax、IC50，并计算Amax/IC50。根据Amax/IC50评价不同包被浓度对双特异性纳米抗体结合活性及标曲的影响，一般来说，Amax越高，说明抗体亲和力高，IC50越低，说明灵敏度越高，因此，所得的Amax/IC50应当越高越好，即最高Amax/IC50所对应的包被原浓度即为最佳包被浓度。
二、实验结果
实验结果如图5所示，(A)BsNb-C-N在不同浓度甲萘威包被原下的竞争活性；(B)BsNb-C-N在不同浓度甲萘威包被原下的Amax/IC50比对；(C)BsNb-C-N在不同浓度1-萘酚包被原下的竞争活性；(D)BsNb-C-N在不同浓度1-萘酚包被原下的Amax/IC50比对。
本发明所得双特异性纳米抗体BsNb-C-N无论是针对甲萘威还是1-萘酚，当包被原浓度为250ng/mL时，所得到的Amax/IC50均显著高于其他包被浓度所得到的Amax/IC50。说明最佳包被浓度为250ng/mL。
实施例7双特异性纳米抗体BsNb-C-N在不同体积分数有机溶剂下中的活性测定
一、实验方法
用不同体积分数(0％、10％、20％、30％、40％、50％)的甲醇、不同体积分数(0％、10％、20％、30％、40％、50％)的乙腈和不同体积分数(0％、10％、20％、30％、40％、50％)的丙酮分别与PBS的混合液作为实施例2制备得到的双特异性纳米抗体BsNb-C-N(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)和甲萘威、1-萘酚标准品稀释液，将实施例2制备得到的纳米抗体BsNb-C-N(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)稀释至工作浓度250ng/mL，使用实施例5中的检测试剂盒，分别测定抗体与检测抗原(实施例1制备得到的CBR-BSA和1-NAP-BSA)以及不同浓度标准药物的结合能力，评价纳米抗体对不同有机溶剂、同一有机溶剂不同浓度时的耐受能力。
二、实验结果
测定结果如图6所示，(A)和(B)BsNb-C-N在不同甲醇浓度下对甲萘威和1-萘酚的竞争活性；(C)和(D)BsNb-C-N在不同乙腈浓度下对甲萘威和1-萘酚的竞争活性；(E)和(F)BsNb-C-N在不同丙酮浓度下对甲萘威和1-萘酚的竞争活性。
实施例2制备得到的BsNb-C-N(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)在低浓度有机溶剂中(10％以下甲醇，20％以下乙腈，20％以下丙酮)与检测抗原(实施例1制备得到的CBR-BSA和1-NAP-BSA)结合活性受影响较小，但是与小分子待测物的结合活性随着有机溶剂浓度的提升急剧下降，即IC50值显著升高。当有机溶剂混合液中甲醇、乙腈或丙酮比例达到30％以上时，均出现药物无法抑制抗体与检测抗原结合的现象，同时抗体也与检测抗原呈现结合不规律的现象，检测结果近乎全部无显色。说明所制备的BsNb-C-N可耐受体积分数为10％以下的甲醇溶液，20％以下的乙腈溶液和20％以下的丙酮溶液。因此，在实际样品前处理时，推荐使用体积分数不超过10％的甲醇、不超过20％的乙腈或丙酮溶液进行提取，并结合氮气吹干方法以得到有机溶液体积分数更低的样品稀释液，以保证BsNb-C-N的检测活性。
实施例8双特异性纳米抗体BsNb-C-N在不同温度下的活性测定
一、实验方法
用PBS稀释实施例2制备得到的双特异性纳米抗体BsNb-C-N(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)和甲萘威、1-萘酚标准品，将双特异性纳米抗体BsNb-C-N稀释至工作浓度250ng/mL，分别测定抗体与检测抗原(实施例1制备得到的CBR-BSA和1-NAP-BSA)以及不同浓度甲萘威、1-萘酚标准药物，通过ic-ELISA检测其在不同温度下(4℃，25℃，37℃，50℃)孵育40min与检测抗原以及甲萘威、1-萘酚标准药物的结合活性。
二、实验结果
测定结果如图7所示，(A)BsNb-C-N在不同温度下对甲萘威的竞争活性；(B)BsNb-C-N在不同温度下对甲萘威的竞争活性。
双特异性纳米抗体BsNb-C-N在4～50℃下孵育一定时间，可见明显趋势，即随着温度的降低，与检测抗原结合活性有所下降，但是与小分子待测物的结合活性有所升高，即IC50值明显降低。说明双特异性纳米抗体BsNb-C-N在检测小分子待测物时更适合较低的工作环境，不需要孵育设备。由于4℃需要冷藏设备，故优先考虑常温25℃孵育。
实施例9双特异性纳米抗体BsNb-C-N在不同pH条件下的活性测定
一、实验方法
用不同pH值(2.4，3.4，4.4，5.4，6.4，7.4，8.4，9.4，10.4)的0.01M PBS作为双特异性纳米抗体BsNb-C-N和甲萘威、1-萘酚药物标准品稀释液，将双特异性纳米抗体BsNb-C-N稀释至工作浓度250ng/mL，分别测定双特异性纳米抗体BsNb-C-N与检测抗原CBR-BSA、1-NAP-BSA以及不同浓度甲萘威、1-萘酚标准药物的结合能力，评价双特异性纳米抗体BsNb-C-N在同一离子浓度，不同pH的PBS溶液中与检测抗原CBR-BSA、1-NAP-BSA以及甲萘威、1-萘酚标准药物的结合活性。
二、实验结果
测定结果如图8所示，(A)BsNb-C-N在不同pH的PBS中对甲萘威的竞争活性；(B)BsNb-C-N在不同pH的PBS中对1-萘酚的竞争活性。
pH2.4～10.4范围内，双特异性纳米抗体BsNb-C-N与小分子待测物的结合活性只在小范围波动，灵敏度变化不大。但可看出在碱性条件下，IC50值有所降低。总体趋势而言，BsNb-C-N更适合在中性或碱性环境下工作。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种特异性识别甲萘威和/或1-萘酚的双特异性纳米抗体的编码基因，其特征在于，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述的编码基因或表达权利要求1所述双特异性纳米抗体。
4.一种细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求1所述的双特异性纳米抗体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的细胞在非诊断目的检测甲萘威和/或1-萘酚中的应用。
6.权利要求1所述的双特异性纳米抗体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的细胞在制备检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒中的应用。
7.一种非诊断目的检测甲萘威和/或1-萘酚的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的双特异性纳米抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为基于间接ELISA的方法，以式(III)所述甲萘威完全抗原和式(IV)所述1-萘酚完全抗原中的一种或两种作为检测抗原，以权利要求1所述双特异性纳米抗体作为检测抗体，
9.一种检测甲萘威和/或1-萘酚的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的双特异性纳米抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还含有式(III)所述甲萘威完全抗原和式(IV)所述1-萘酚完全抗原中的一种或两种作为包被抗原，
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