CN110615846B

CN110615846B - 一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其ELISA试剂盒

Info

Publication number: CN110615846B
Application number: CN201910798719.7A
Authority: CN
Inventors: 朱传刚; 纪荣毅; 袁娜娜; 张霁月; 沈元曦; 林矫矫; 洪炀; 马以桐
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110615846A

Abstract

本发明属于基因工程领域。具体而言，本发明提供一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其ELISA试剂盒，尤其涉及密码子优化的一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G‑SA，包括链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白。本发明提供的ELISA试剂盒的特异性、敏感性和稳定性较好，具有良好的应用前景。

Description

一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其 ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种兼有IgG 结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA及其ELISA试剂盒。

背景技术

目前，感染人类的吸虫有三种：即分布于亚洲的日本血吸虫，非洲中部及拉丁美洲的曼式血吸虫和非洲北部的埃及血吸虫，在中国仅日本血吸虫流行，分布于我国长江流域及南方12省，市，自治区，多为我国很重要的农业生产基地，日本血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病，对人民的健康及国家发展危害严重。

血吸虫病诊断技术主要包括病原学诊断和免疫学诊断两种，病原学诊断技术以粪便等样本中检查虫卵或孵化毛蚴为手段，但该法检出率较低，对轻度感染或早期感染的检测漏检率极高，不利于疾病的早期诊断。免疫学诊断技术检测主要包括抗原和血清抗体，相比病原学诊断技术具有简便，高效，依从性高等优势，日益受到重视并在业界研发下发展迅速。

链球菌蛋白G是一种能够和多种哺乳动物的IgG以及人血清白蛋白(HSA)相结合的蛋白质，SPG同IgG的亲和力强，结合谱广。研究表明，SPG的三个同源的氨基酸序列C1、C2和C3区域与抗体IgGFc端的结合相关，并且C3区与抗体IgG的结合能力相当于C1区的7倍（Kobatake，1990）。而SPG的A、B区则具有与抗体Fab段结合以及与血清白蛋白结合的活性，被认为会起到干扰抗体与抗原的作用以及带来非特异性反应的问题。

链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌Streptomycesavidinii分泌的一种四聚体蛋白，与亲和素(avidin，AV)有相似生物学特性。SA可高度特异性地与生物素结合，一分子链霉亲和素可以与四分子生物素结合，形成生物素-链霉亲和素系统。该系统被认为是最稳定的非共价相互作用之一，并在生物技术领域具有广泛的应用，如分子标记、分子定位和靶向药物递送。

酶联免疫吸附试验是免疫学诊断技术的一种，该方法具有高度特异性，敏感性，检测结果与粪检阳性符合率达95%-99%。ELISA技术飞速发展，出现了诸多衍生试验，如快速ELISA，微波ELISA，Dot-ELISA等均具有良好的特异性和敏感性。

BSA系统作为ELISA法的一种，可显著提高标记免疫检测的灵敏度，在免疫学领域应用广泛。但是常规的BSA法同样不可避免的用到酶标的二抗，根据不同物种来源的一抗，二抗也需要做相应的调整，增加了实验成本也给实验结果准确性带来影响。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的免疫检测。

为了实现上述技术方案，本发明提供一种融合蛋白，基于SPG C3区和SA的特点，将这两段基因连接起来，重构一种兼有IgG 结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种兼有IgG 结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，包括链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为含有SPG的C3区段的序列；

其中，链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白之间的连接序列为如SEQ ID NO.8所示

所述链球菌蛋白G（SPG）片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

SA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述双功能蛋白G-SA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

本发明同时提供一种密码子优化的序列，对SPG和SA序列进行密码子优化，拼接后蛋白表达量提高，可溶性增加。

本发明同时提供一种双功能蛋白G-SA的构建方法，所述方法为：根据G蛋白的C3片段的基因序列，从含有C3片段的菌液中PCR扩增出C3序列；

（1）通过PCR从含有SA序列的菌液中扩增出SA序列；

（2）先将扩增出的SA序列双酶切后，连接到表达载体上，经鉴定后再将C3片段双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒；

（3）将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白；

（4）经破碎、纯化后制得融合蛋白G-SA

其中，步骤（1）中使用的引物对如SEQ ID NO.1、2所示；

步骤（2）中使用的引物对如SEQ ID NO.3、4所示；

上述方法中，融合蛋白基因的表达、纯化可采用本领域常规用于蛋白表达纯化的方法，例如将融合蛋白基因克隆入表达载体，将表达载体和/或共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白，经破碎、纯化后得到融合蛋白。其中，本发明对表达载体、表达宿主的种类和类别不作限定，可选用本领域常规用于遗传修饰的载体和宿主，具体的，表达载体可为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11的等，；表达宿主可选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。

本发明中，克隆可通过例如链式酶聚合反应(PCR)完成。

进一步的，本发明提供一种ELISA试剂盒，其中所述ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒中包括：双功能蛋白G-SA、封闭液（5%脱脂奶粉），酶标二抗（HRP标记的生物素和亲和素），PBST，显色液（TMB底物液）、终止液（2 mol/L硫酸）。

同时，本发明提供一种ELISA试剂盒的非诊断目的的应用，所述应用为抗体检测、抗体筛选、抗原检测、病原检测、蛋白检测、蛋白相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、蛋白-核酸相互作用分析、药物筛选等。

附图说明

图1 SPG的结构示意图。

图2 对重组蛋白的原核表达质粒，进行PCR鉴定，其中，M：核酸标志物；1：G-SA序列；2：C3序列；3.SA序列。

图3重组质粒的双酶切鉴定，其中，M：核酸标志物1：PET-28a空载体；2：G-SA基因。

图4 SDS-PAGE分析pET-28a（+）-C3-SA表达情况，其中，M：蛋白标志物；0：无IPTG诱导；1、2、4、6、8：IPTG诱导1h，2h，4h，6h， 8h。

图5 SDS-PAGE分析pET-28a（+）-C3-SA上清蛋白纯化情况

M：蛋白标志物；1：超声破碎上清液；2：上样后；3：超声破碎沉淀；4：BindingBuffer纯化后；5：Washing Buffer纯化后；6：Strip Buffer纯化后。

图6 Western blotting检测G-SA蛋白与不同物种IgG、生物素以及His抗体的结合活性

图A：1：蛋白maker；2：鼠抗兔；图B：1：蛋白maker；2：驴抗羊；

图C：1：蛋白maker；2：羊抗鼠；图D：1：蛋白maker；2：兔抗山羊；

图E：1：蛋白maker；2：HRP-bio；图F：1：蛋白maker；2：His抗体。

图7 G-SA与不同物种抗体、生物素的亲和常数曲线

图8 新型ELISA系统模式图

图9 重组蛋白最适孵育浓度摸索

图10 新型ELISA检测法的多物种检测，灵敏度检测

图11新型ELISA检测法的多物种检测，特异性检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1重组蛋白的构建

1.1 生物材料

大肠埃希氏杆菌BL21购自南京诺唯赞生物科技有限公司；含SA、SPG质粒、质粒pET-28a(+)为实验室保存。

SA对应文献：[1]訾静,张月娟,万一.核心链霉亲和素在毕赤酵母中的表达及纯化[J].中国生物制品学杂志,2018,31(05):485-488.

SPG对应文献：[1]许瑞,赵登云,洪炀,陆珂,李浩,林矫矫,冯金涛,徐玉梅,朱传刚.链球菌蛋白G的结构域重构、表达及鉴定[J].中国动物传染病学报,2015,23(05):46-52.

1.2 重组蛋白的构建和合成

根据spG的C片段以及链霉亲和素基因序列，利用Primer5软件设计引物，分别在上游和下游引物中加入酶切位点，引物序列如表1所示。

表1 扩增引物

转入BL21中。

1.3 重组质粒鉴定

对重构的重组蛋白序列进行进行PCR反应，反应体系如下：

将各组分混匀后，短暂离心置于PCR仪中进行反应，反应参数如下：

退火温度如下表：

对PCR产物进行电泳鉴定（图2）和双酶切鉴定（图3），测序鉴定结果显示与设计的序列一致。目的基因全片段大小约为680bp。C3片段大小约为170bp，SA片段大小约为480bp。

（C3片段PCR对应上下游引物：SEQ ID NO.1、2；SA PCR对应上下游引物：SEQ IDNO.3、4；全片段PCR对应上下游引物：SEQ ID NO.1、4）。

实施例2重组蛋白的表达和纯化

2.1 重组质粒的表达

时相：

（1）挑取适量含有目的片段的BL21穿刺菌，接种于5ml含Kan+的LB液体培养基中，置于37℃震荡培养箱中，250rpm震荡培养。

（2）当生长至对数期（OD600约为0.6时），加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达。在诱导表达前、诱导表达后1h、2h、4h、6h、8h分别取0.5ml菌液，应用SDS-PAGE电泳分析最佳诱导时间。

SDS-PAGE分析显示（图4），重组质粒pET-28a（+）-C3-SA在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达，且1mmol/L IPTG诱导后1-8h表达量随着时间的增长变化不明显，诱导2h后表达量达到最高并趋于稳定。当诱导时间超过4h时，杂蛋白的表达量不断增加，使得目的蛋白

的表达量减少，所以选择诱导时间为2h时最佳。

大量表达：

（1）挑取适量含有目的片段的BL21穿刺菌，接种于150ml含Kan+的LB液体培养基中，置于37℃震荡培养箱中，250rpm震荡培养。

（2）当生长至对数期（OD600约为0.6时），加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达，将诱导后的菌液 5000rpm离心15min弃上清，沉淀用10ml Binding buffer重悬，反复冻融三次后，冰浴超声破碎25min（超2s隔9s）后5000rpm离心15min，收集沉淀和上清。

（3）将离心后的沉淀用5ml 8mol 尿素重悬，冰上溶解2h，重复上述离心步骤，收集上清。

（4）将超声后上清、沉淀重悬后上清，分别加入等体积蛋白电泳缓冲液，用SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性。

2.2重组蛋白的纯化

使用Ni-NTA Hisbind Resin对重组蛋白进行纯化（Ni-NTA Hisbind Resin序列号：70666-3），按照试剂盒说明书进行操作，简易操作步骤如下：

（1）取5ml树脂加入新空柱中静置平衡，当液面降到树脂表面时，依次进行以下步骤；

（2）用2CV ddH₂O*2，charge buffer *3，binding buffer*2;

（3）上样前留50ul；

（4） 3CV Binding Buffer*3(刚加上需要留50ul下清)；

（5） 3CV Wash Buffer*2，同留50ul;

（6） 2CV Elution Buffer*2，同留50ul;

（7）少量Strip Buffer(3ml)，反复上样，全留，同取50ul。

（8）将上述收集的溶液进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白纯化情况。

SDS-PAGE分析显示（图5），重组质粒pET-28a（+）-G-SA表达的蛋白在超声上清和沉淀中均存在，沉淀中的蛋白含量高于上清中的蛋白含量，表明该蛋白具有一定的水溶性。重组蛋白超声上清经过Ni-NTAHisbindResin纯化后，在经过Strip Buffer洗脱后，得到纯化。

实施例3重组蛋白活性鉴定

3.1 Western blotting检测重组蛋白与IgG的结合活性

（1）将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后将蛋白转移至NC膜上，130mA，75min。

（2）将NC膜浸泡于PBST稀释的5%脱脂奶粉中，室温封闭2h。

（3）将封闭后的NC膜用PBST洗涤三次，每次5min。

（4）将NC膜用HRP标记的山羊抗小鼠IgG，兔抗山羊IgG，小鼠抗兔IgG，驴抗山羊IgG，生物素（用PBST 1:2000稀释）作为抗体，室温孵育1h。

（5）将孵育后的NC膜用PBST洗涤三次，每次10min。

（6）将NC膜用DAB双组份显色液试剂盒进行显色，显色后用流水冲洗，终止反应。

结果显示重组蛋白具有与兔IgG，驴IgG，鼠IgG，羊IgG，生物素等的结合能力。（图6）

3.3 ELISA法测定重组蛋白与不同物种IgG亲和常数

（1）用BCA法测定重组蛋白的浓度，并用商品化的标准蛋白G（SPG）作为对照。

（2）用包被液将蛋白从10μg/ml开始进行倍比稀释，共进行8个稀释度，以100μl每孔包被于96孔板上，每个浓度设置3个重复，4℃包被过夜。

（3）将96孔板用PBST洗涤三次，200μl每孔，每次5min。

（4）加入用PBST稀释的5%脱脂奶粉的溶液，150μl每孔，37℃封闭2h。

（5）将96孔板用PBST洗涤三次，200μl每孔，每次5min。

（6）将HRP标记的山羊抗小鼠IgG，兔抗山羊IgG，小鼠抗兔IgG，驴抗山羊IgG，生物素，用PBST按1:500、1:1000、1:2000、1:4000进行倍比稀释，100μl每孔，37℃孵育2h。

（7）将96孔板用PBST洗涤三次，200μl每孔，每次5min。

（8）加入TMB进行显色，100μl每孔，室温反应15min。

（9）加入2mol/L H₂SO₄终止反应，30μl每孔，读取OD450值。

以OD450值作为纵坐标，以抗原浓度的对数值作为横坐标，进行曲线拟合，亲和曲线如图7所示根据拟合的曲线，代入相应的公式中，分别计算亲和常数Ka，将得到的Ka值取其平均数，获得了重组蛋白的亲和常数值，结果见表2。

表2 G-SA与不同物种抗体、生物素的亲和常数

抗体	亲和常数
		山羊	4.12*10^4
驴	1.26*10^5
		兔	5.12*10^4
鼠	1.03*10^5
		HRP-bio	7.73*10^4

结果显示该重组蛋白同时具有SPG与不同物种IgG结合的能力以及SA的与生物素结合的功能，是一种新型的双功能重组蛋白。经western和ELISA测亲和常数均显示重组蛋白具有与IgG的结合能力和与生物素的结合能力。

实施例4 日本血吸虫病新型ELISA诊断试剂盒的优化

制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原。用碳酸盐缓冲液稀释虫卵可溶性抗原稀释至终浓度10ug/ml。每孔100ul包被于酶标板中，4℃包被过夜，PBST洗涤3-次，每次5min；以PBST配制5%脱脂奶粉，每孔200ul，37℃2h，PBST洗涤3-5次，每次5min；牛日本血吸虫阴阳性血清1:100稀释，每孔80ul，37℃2h，PBST洗涤3-5次，每次5min；将重组蛋白以5%脱脂奶粉稀释至0.125ug/ml，0.25ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml，8ug/ml，16ug/ml，加入bio-HRP，AV-HRP至稀释度为1:1000，1:2000,37℃孵育2h。得rSPG-SA-biotin-HRP-AV-HRP混合液；将混合液每孔60ul加入酶标板中，37℃孵育2h，PBST洗涤3-5次，每次5min。TMB显色液每孔100ul，显色15min，2M H₂SO₄每孔50ul终止反应，读取OD450nm值。模式图如图8所示，结果见图9，结果如下，最适重组蛋白浓度确定为16ug/ml，此时P/N值最大，为9.649。

优化后BSA系统检测血吸虫病效果分析

实验确定的最佳条件如下，抗原包被浓度为10ug/ml；封闭液为5%脱脂奶粉；重组蛋白用5%脱脂奶粉稀释至16ug/ml，加入bio-HRP，AV-HRP至稀释度为1:1000，1:2000，37℃孵育2h，得16ug/ml rSPG-SA-biotin-HRP-AV-HRP混合液。以上述实验确定的最佳条件，同时检测兔，牛，羊日本血吸虫阴阳性血清，血清进行梯度稀释，检测此实验方法同时进行多物种检测的可行性及其灵敏度，结果见图10，兔日本血吸虫阳性血清最高可稀释至1:800仍检出阳性，而牛、羊日本血吸虫阳性血清在1:3200稀释度是仍检出阳性，说明此法灵敏度极高，具有较高的实用价值。

以上述实验确定最佳条件，诊断抗原为日本血吸虫虫卵可溶性抗原（SEA）,其余操作同前，检测牛日本血吸虫阳性血清，牛大片吸虫阳性血清，羊东毕吸虫阳性血清，羊捻转血矛阳性血清，设牛，羊标准阴性血清对照，检测此实验方法与捻转血矛线虫，东毕吸虫，大片吸虫的交叉性，结果见图11，在1:50血清稀释度时，牛大片吸虫阳性血清检出为阳性，P/N值≥2.1，但是随着血清稀释度的提高，牛大片吸虫、羊捻转血矛线虫，羊东毕吸虫阳性血清均检测为阴性，说明血清稀释度在1:100及以上时，日本血吸虫为诊断抗原的新型ELISA检测法与捻转血矛线虫、东毕吸虫。大片吸虫没有交叉性；牛日本血吸虫阳性血清检测稀释至1:1600仍检出阳性，提示，此法特异性较好。

<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120>一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其ELISA试剂盒

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> C区上游引物

<400> CCG GGA TCC ACT TAC AAA C

<210>2

<211> 19

<212> DNA

<213> C区下游引物

<400> GCT ACCACC ACC ACC ACT G

<210>3

<211> 25

<212> DNA

<213> SA区上游引物

<400> GAT CCG AGC AAA GAT AGC AAA GCC C

<210>4

<211> 23

<212> DNA

<213> SA区下游引物

<400> GGC CTC GAG TTA TTG CTG AAC AG

<210>5

<211>675

<212> DNA

<213> 重组蛋白G-SA的核苷酸序列

<400>ACTTACAAACTTGTTATTAATGGTAAAACGCTGAAGGGTGAAACCACCACCAAAGCGGTGGATGCCGAAACCGCGCAGAAGGCCTTTAAGCAGTACGCCAACGACAATGGCGTGGATGGTGTTTGGACCTACGACGACGCGACCAAAACCTTTCGTGTTACCGAAGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGTGGTGGTAGCGATCCGAGCAAAGATAGCAAAGCCCAAGTGAGTGCCGCGGAAGCCGGCATTACGGGTACGTGGTACAACCAGCTGGGCAGCACCTTCATTGTTACGGCGGGTGCCGATGGTGCCCTCACCGGTACGTACGAAAGCGCGGTTGGCAATGCCGAAAGCCGTTACGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGTGCGCCAGCGACCGATGGTAGTGGTACCGCGCTGGGTTGGACCGTTGCGTGGAAGAACAACTACCGCAATGCCCATAGCGCCACGACGTGGAGCGGTCAGTACGTTGGCGGTGCCGAAGCCCGTATCAATACGCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACGACCGAAGCGAATGCGTGGAAAAGTACGCTGGTGGGCCACGATACGTTCACCAAGGTGAAGCCAAGCGCCGCGAGCATCGATGCGGCCAAAAAAGCCGGCGTGAATAATGGCAACCCTCTAGACGCTGTTCAGCAATAA

<210>6

<211>165

<212>DNA

<213> 重组蛋白SPG片段的核苷酸序列

<400>ACTTACAAACTTGTTATTAATGGTAAAACGCTGAAGGGTGAAACCACCACCAAAGCGGTGGATGCCGAAACCGCGCAGAAGGCCTTTAAGCAGTACGCCAACGACAATGGCGTGGATGGTGTTTGGACCTACGACGACGCGACCAAAACCTTTCGTGTTACCGAA

<210>7

<211>480

<212> DNA

<213> 重组蛋白SA片段的核苷酸序列

<400>GATCCGAGCAAAGATAGCAAAGCCCAAGTGAGTGCCGCGGAAGCCGGCATTACGGGTACGTGGTACAACCAGCTGGGCAGCACCTTCATTGTTACGGCGGGTGCCGATGGTGCCCTCACCGGTACGTACGAAAGCGCGGTTGGCAATGCCGAAAGCCGTTACGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGTGCGCCAGCGACCGATGGTAGTGGTACCGCGCTGGGTTGGACCGTTGCGTGGAAGAACAACTACCGCAATGCCCATAGCGCCACGACGTGGAGCGGTCAGTACGTTGGCGGTGCCGAAGCCCGTATCAATACGCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACGACCGAAGCGAATGCGTGGAAAAGTACGCTGGTGGGCCACGATACGTTCACCAAGGTGAAGCCAAGCGCCGCGAGCATCGATGCGGCCAAAAAAGCCGGCGTGAATAATGGCAACCCTCTAGACGCTGTTCAGCAATAA

<210>8

<211>30

<212> DNA

<213>连接序列的核苷酸序列

<400>GGCGGTGGTGGCAGTGGTGGTGGTGGTAGC

Claims

1.一种兼有IgG 结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，其特征在于所述双功能蛋白G-SA包括链球菌蛋白G片段和SA蛋白，所述双功能蛋白G-SA由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列编码。

2.一种如权利要求1所述的双功能蛋白G-SA的表达方法，所述方法为：(1)根据链球菌蛋白G蛋白的C3片段的基因序列，从含有C3片段的菌液中PCR扩增出C3序列；

(2)通过PCR从含有SA序列的菌液中扩增出SA序列；

(3)先将扩增出的SA序列双酶切后，连接到表达载体上，经鉴定后再将C3片段双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒；

(4)将所述表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导剂表达蛋白；

经破碎、纯化后制得双功能蛋白G-SA。

3.如权利要求2所述的表达方法，其中，步骤（1）中使用的引物对如SEQ ID NO.1、2所示；

步骤（2）中使用的引物对如SEQ ID NO.3、4所示。

4.一种用于免疫分析的产品，所述产品包括权利要求1所述的双功能蛋白G-SA。