KR20070040329A - 센서 구조물 및 검출방법 - Google Patents
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Abstract
샘플 중의 분석물(60)의 존재를 검출하기 위한 센서 구조물(10)은 분자골격(20), 푀르스터 공명 에너지 전달을 통하여 상호작용하는 한 쌍의 라벨(40, 50), 및 1 이상의 분자인식 도메인(30)을 포함한다. 상기 분석물(60)이 분자 인식 도메인(30)에 의해 결합되면, 라벨(40,50) 쌍 사이의 푀르스터 공명 에너지 상호작용이 파괴되어 광학 신호의 변화를 초래한다.
분자인식 도메인, RET 공여체, RET 수용체, 분석물, 분자골격, 광학 신호, 센서 구조물
Description
본 발명은 센서 구조물 및 검출방법에 관한 것이다.
면역분석법 및 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction: PCR)을 기본으로 분석법은 분석물을 검출하기 위해 가장 널리 이용되는 수법이다. PCR계 수법은 일반적으로 양호한 검출 감도를 나타내지만, 이들은 다수의 실험실에서 통상적인 스크리닝에는 널리 이용되지 않았다. 그 이유의 하나는 생물학적 물질 중의 분석물을 검출하기 위해 PCR을 사용하면, 그 정확도가 PCR 분석법 자체의 성능에 의해서 뿐만아니라 시험되는 생물학적 물질로부터 추출된 핵산의 품질에 의해서도 강하게 영향을 받기 때문이다. 또한 PCR-계 방법의 검출 감도는 증폭 방법을 방해할 수 있는 추출물 중의 억제제에 의해 감소될 수 있다. 숙련된 실험실 연구원은 이들의 정확도를 확보하기 위해 PCR 분석법을 실시할 수 있는 것이 요구된다.
면역분석법은 일반적으로 덜 비싸고 실시함에 있어 숙련도를 덜 필요로 한다. 이들은 다양한 포맷으로 적용되어 왔으며, 그 중에서 가장 일반적인 것은 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 측면 유동 면역분석법, 및 웨스턴-블럿 분석법이다. 그러나 현재의 ELISA 및 웨스턴-블럿 수법은 다수의 배양 단계를 필요로 하고 또 작업자가 실수하기 쉽다. 측면 유동 면역분석법은 일반적으로 신속하게 실시할 수 있지만 통상의 ELISA법에 비하여 덜 정확하다.
대안의 분석 포맷은 분석물을 검출하기 위해 씨엔(Tsien) 등에 의해 제안되었다. 미국특허 5,998,204호에 개시된 이 수법은 분석물-결합 영역 및 2개의 형광 라벨을 갖는 단백질을 이용한다. 분석물-결합 영역이 분석물과 결합하면, 형태적 변화가 생겨서 2개의 형광 라벨이 서로에 대한 위치를 변경하게 한다. 이는 라벨 사이에 형광 공명 에너지 상호작용을 변경시키며, 이는 분석물 결합을 측정하기 위해 검출된다.
프로머(Frommer) 등은 PCT 국제 출원번호 03/025220호에서 유사한 분석 포맷을 제안하였다. 이 분석법은 원형질막 주위공간 결합 단백질 부분 및 2개의 형광 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질을 이용한다. 이 융합 단백질은 분석물과 결합시에 형태적 변화를 겪어, 2개 형광 단백질 부분의 상대적 위치가 변하게 된다. 따라서 형광 단백질 잔기 사이에는 변경된 형광 공명 에너지 상호작용이 유도된다.
씨엔 및 프로머에 의해 개시된 분석 계는 관심을 갖고 있는 분석물과 결합시 형태 변화를 겪는 센서 구조물의 사용을 필요로 한다. 또한 양쪽 계는 간단한 당류 및 아미노산과 같은 소형 분석물만을 검출한다. 따라서 공명 에너지 전달 상호작용을 이용하지만 분석물을 검출하기 위해 형태가 변해야 하거나 또는 소형 분석물만을 검출하는 구조물에만 한정되지 않는 더욱 일반적인 분석물 검출법이 요청되고 있다.
요약
샘플 중의 분석물을 검출하는 본 발명의 방법은 (i) 분석물과 특이적으로 반응하는 분자 인식 도메인; (ii) RET(resonance energy transfer) 공여체를 포함하는 제1 라벨; 및 (iii) 상기 RET 공여체에 대한 RET 수용체를 포함하는 제2 라벨을 포함하는 센서 구조물의 사용을 포함한다. RET 수용체는 공여체로부터 수용체로 푀르스터(Foerster) 공명 에너지 전달이 생기게하는 거리에 의해, 바람직하게는 약 1 내지 약 25 nm의 거리에 의해 RET 공여체로부터 분리된다. 센서 구조물의 분자량 인식 도메인이 분석물과 결합하면, RET 공여체 및/또는 RET 수용체에 대한 분석물의 근접성은 RET 공여체 및 RET 수용체 사이의 FRET 상호작용을 방해하여서 검출가능한 광학 신호를 생성한다. 샘플 중의 분석물의 존재는 이러한 광학 신호의 검출에 의해 표시된다.
본 발명의 방법은 또한 센서 구조물이 샘플과 접촉하기 전에 센서 구조물의 RET 공여체 및/또는 RET 수용체 사이의 푀르스터 공명 에너지 전달 상호작용에 의해 생긴 대조용 광학 신호를 측정한 다음, 센서 구조물이 샘플과 접촉한 후 검출된 광학 신호와 상기 대조용 광학 신호 사이의 차이를 측정하는 더 자세한 단계를 포함할 수 있다. 상기 신호 및 대조용 광학 신호 사이의 차이는 샘플 중의 분석물의 양을 지시하므로, 분석물의 정량측정이 가능하다. 바람직하게는, 센서 구조물의 형광 또는 발광의 세기 또는 감쇠 동력학의 변화는 광학 신호로서 측정한다.
본 발명의 방법에서, RET 공여체는 형광 단백질, 발광 단백질, 비-단백질 형광단, 비-단백질 화학발광 화합물 또는 형광 나노결정과 같은 다수의 형광 또는 발광 잔기일 수 있다. RET 수용체는 RET 공여체로부터 신호를 해소하는 분자일 수 있으며, 일부 구체예에서는 증가되고, 감작된 수용체 신호를 나타낸다. 광학 신호의 세기를 증가시키기 위하여, 각 센서 구조물에는 다수의 RET 공여체 및 수용체가 포함될 수 있다. 센서 구조물 자체는 폴리펩티드일 수 있고, 또 항체 또는 항체의 Fv 부분과 같은 항체 단편을 포함할 수 있다. 일부 구체예로서, 분자 인식 도메인은 센서 구조물의 Fv 부분의 CDR 영역이다. 분자 인식 도메인은 킬레이트화된 금속과 같은 금속, 또는 올리고뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다.
센서 구조물의 일부 구체예로서, 분자 골격, 분자 인식 도메인, 및/또는 라벨은 별개 분자로서 제공되어 조합되어 센서 구조물을 형성한다. 예컨대, 분자 골격은 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드 쌍을 포함할 수 있고 또 분자 인식 도메인은 항체의 Fv 단편의 결합 도메인을 포함할 수 있다(VH 및 VL 단편을 포함). 상기 구체예에서 분자 인식 도메인은 킬레이트화된 금속, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 비오틴 분자, 또는 비-펩티드 효소 기질/억제제 분자일 수 있다. 이러한 구체예에서 센서 구조물의 상이한 성분은 서로 접촉하게되면 자가 조립(self-assembling)되어서 RET 공여체로부터 RET 수용체로 푀르스터 공명 에너지 전달이 생기게 한다.
본 발명의 이들 특징 및 다른 특징, 요지 및 이점은 이하의 상세한 설명, 특허청구범위 및 첨부한 도면을 참조하면 잘 이해할 수 있을 것이다.
본 명세서에 기재된 모든 치수는 예시적으로 나타낸 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 또한 도면에 도시된 비율은 축적에 따라 나타낸 것은 아니다. 본 발명의 상세한 설명을 보면 본 명세서에 기재된 어떠한 장치 및 장치의 일부의 실제 크기는 사용 목적에 따라 결정할 수 있음을 당업자들이라면 잘 알고 있을 것이다.
상세한 설명
본 발명의 센서 구조물은 2개의 라벨 사이의 푀르스터 공명 에너지 전달(Foerst resonance energy transfer: FRET) 상호작용을 방해하는 분석물의 검출을 가능하게 한다. 본 발명의 센서 구조물이 분석물과 결합되면, 이러한 방해는 변경된 세기의 광학 신호로 나타나며, 이것은 감작성 레이셔메트릭(ratiometric) 또는 형광 수명 측정에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 센서 구조물은 분석물과 결합시 검출성 신호를 생성하기 때문에, 이들은 자가 신호생성성이며, 분석물을 검출하기 위해서는 추가의 신호 생성 요소를 포함해야 하는 다수의 현존하는 검출 분석법에 비하여 유리하다. 또한 본 발명의 방법이 비경쟁 분석법으로서 용액에서 실시되고 증가된 분석 처리량을 제공하도록 본 발명의 센서 구조물을 고체 지지체에 부착시킬 필요가 없다.
정의
본 명세서에 사용된 바와 같이 이하의 용어는 그 용어가 사용되는 부분에서 상이한 의미를 분명히 나타내지 않는 한 이하에 주어진 의미를 갖는다.
"분석물"은 샘플 중의 분자, 화합물, 또는 다른 성분을 지칭한다. 분석물은 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 유기 분자, 당 또는 기타 탄수화물 또는 탄수화물 중합체, 지질, 또는 기타 유형의 분자, 예컨대 비타민, 호르몬 및 질병 마커일 수 있다. 분석물은 다른 분자 및/또는 다른 분자의 일부와 조합되어 존재할 수 있다.
"항체"는 분석물과 특징적으로 결합되는 면역글로불린 단백질을 지칭한다. 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgM과 같은 다양한 면역글로불린 클래스 및 동종형을 포함한다. "항체 단편"은 완전한 항체의 부분을 포함하는 Fab, scFv, F(ab')2 및 Fab' 분자와 같은 분자를 포함한다. "항체 유도체"는 키메라 항체와 같은 부가 또는 치환을 갖는 항체 또는 그의 단편을 의미한다. 항체, 항체 단편 및 항체 유도체는 인간 또는 동물 공급원, 재조합 방법을 통한 하이브리도마로부터 또는 당업자에게 공지된 다른 방법으로 유도될 수 있다.
"항원결정기"는 분자 인식 도메인이 특이적으로 결합되는 분석물 표면 상의 국소 영역 또는 영역들을 의미한다.
"형광"은 레이저와 같은 외부 공급원으로부터 전자기 방사선(일반적으로 가시범위)에 노출되는 것에 의해 유발된 물질로부터 광 방출을 의미한다. 이 정의를 위하여, 형광은 방사선 노출이 정지된 후 물질에 의한 광의 연속적 방출로서 정의된 인광을 포함한다.
"푀르스터 반경"은 RET 공여체와 RET 수용체 사이의 공명 에너지 전달이 50% 유효한 거리를 지칭한다(즉, 여기된 공여체의 50%의 스펙트럼 방출은 FRET 상호작용에 의해 약화된다.
"FRET", "FRET 상호작용" 및 유사한 용어는 RET 공여체 및 RET 수용체 사이의 푀르스터 공명 에너지 전달 뿐만아니라 비중첩 수용체가 이용될 경우의 비중첩 에너지 전달과 같은 푀르스터의 이론을 엄격하게 따르지 않는 유사한 에너지 전달 형태를 지칭한다 (예컨대 Anal. Chem. 2005, 77: 1483-1487 참조).
"FRET 비"(도 7A- 7I에서 기호 "R"로 표시)는 센서 구조물이 최적 RET 공여체 여기 파장(λmax)에서 여기될 때 각 방출 피이크에서 형광 RET 공여체 및 형광 RET 수용체의 안정 상태 형광 세기의 비를 지칭한다. "라벨"은 검출가능한 신호를 제공하는 분자 또는 잔기를 지칭한다. 본 발명의 센서 구조물 및 방법에서, 라벨은 RET 공여체 및 RET 수용체이며 신호는 전자기 (예컨대 광학) 신호이다.
"발광"은 뜨거운 백열광체 이외의 비-열원으로부터의 광 생성 및 방출을 지칭한다. 몇 가지 발광 유형 중 화학적 및 생화학적 반응에 의해 생성된 화학발광 및 생발광이 있다. 발광은 형광을 포함하지 않는다.
"잔기"는 목적하는 특성을 갖는 분자의 일부를 지칭한다.
"분자 인식 도메인" 또는 "MRD"는 분석물에 특이적으로 결합될 수 있는 분자 또는 잔기를 지칭한다. MRD의 예는 항체 결합 도메인(즉, CDR 영역), 항원 결정기(예컨대 항체 검출할 때), 킬레이트화된 금속, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 및 호르몬 수용체를 포함한다.
구형 단백질 또는 펩티드에 관한 "분자 크기"는 분자의 유체역학적 반경을 지칭한다.
"올리고뉴클레오티드"는 5 내지 200개 뉴클레오티드, 일반적으로 약 20 내지 100개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 30개 뉴클레오티드의 사슬을 지칭한다.
"펩티드"는 50개 이하의 연결 아미노산을 포함하는 분자를 지칭한다.
"폴리뉴클레오티드"는 2개 이상의 연결 핵산을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 핵산 뿐만 아니라 치환 및 부가를 갖는 핵산 분자를 포함한다.
"폴리펩티드"는 2개 이상의 연결 아미노산을 포함하는 분자를 지칭한다.
"단백질"은 50개 이하의 연결 아미노산을 포함하는 분자를 지칭한다.
"레이셔메트릭 방법"은 샘플 중 분석물의 양을 측정하기 위하여 RET 공여체 및 RET 수용체로부터 생긴 형광비를 측정하는 방법을 지칭한다. 레이셔메트릭 측정은 형광계에 의해 실시할 수 있다.
"RET 공여체"는 푀르스터 공명 에너지 전달을 통하여 RET 수용체와 상호작용할 수 있는 형광 또는 발광 잔기 또는 분자를 지칭한다.
"RET 수용체"는 RET 수용체의 증가된 형광 및/또는 RET 공여체로부터의 신호의 켄칭(quenching)을 통한 푀르스터 공명 에너지 전달을 통하여 RET 공여체와 상호작용할 수 있는 잔기 또는 분자를 지칭한다.
"센서 구조물"은 센서 구조물에 분석물을 결합시키는 결과로서 샘플 중 분석물의 존재를 나타내는 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 서브유닛을 포함하는 분자, 또는 분자의 집합을 의미한다.
분석물과 분자 인식 도메인 사이의 상호작용에 대하여 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합"하는 것은 특정 분석 조건하에서 분석물에 분자인식 도메인이 부착되고 샘플의 다른 성분에는 부착되지 않는 것을 지칭한다. MRD에 의한 비교적 소량의 비 특이적 결합은 일부 분석법에서는 허용될 수 있지만 이것은 잘못된 양성 결과 또는 부정확한 정량 데이터를 피하기 위하여 분석 결과를 해석함에 있어서 설명이 필요할 것이다. 분자 인식 도메인은 일부 경우 특정 기 또는 분자 류와 반응할 수 있고 MRD가 분자 군에 공통되는 항원결정기와 결합할 때와 같이 분자에 특이적으로 결합되는 것으로 간주된다. 분자 인식 도메인에 의한 분석물의 결합은 가역적일 수 있고, 즉 분석물은 분석물 또는 특이적 결합 파트너를 구조적으로 변경함없이 특이적 결합 파트너로부터 분리될 수 있거나, 또는 비오틴과 애비딘 사이의 결합과 같이 비가역적일 수 있다.
"특이적 항원결정기 결합", "특이적으로 결합하는 항원결정기" 및 유사 용어는 분자 인식 도메인이 분석물의 특정 항원결정기에 부착되는 것을 지칭한다. 이러한 결합은 분자 인식 도메인 및 특정 항원결정기 사이에서만 생기지만, 소량의 비-특이적 결합은 일부 분석법에서 허용될 수 있고, 예컨대 올리고뉴클레오티드가 일부 몇개의 매칭되지 않은 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드에 결합되는 것 또는 항체 결합 도메인이 분석물의 동형태에 결합되는 것이다. 특정 항원결정기 결합은 분석물과 다수의 상이한 분자 사이에서 생길 수 있는 결합성 상호작용, 킬레이터와 다수의 상이한 금속 사이의 이온 결합을 배제한다. 그러나 분자 인식 도메인은 특정 기 또는 분자 클래스 상의 동일 항원결정기와 결합하면 특정 항원결정기 결합을 나타내는 것으로 기재될 수 있다. 예컨대 MRD는 항체 클래스의 Fc 영역에 대하여 유도될 수 있으므로 특정 클래스의 다수의 상이한 항체와 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다" 및 이 용어의 변형체, 예컨대 "포함하는" 등은 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하기 위한 것이 아니다. 영어의 정관사 및 부정관사 및 그와 유사한 것은 특별히 다르게 정의하지 않는 한 단수 및 복수를 모두 의미하는 것으로 이해해야 한다.
FRET
푀르스터 공명 에너지 전달(FRET)은 분석물을 검출하기 위해 본 발명의 방법에 이용되는 물리적 원리이다. FRET는 여기된 상태에서 형광 또는 발광성 잔기인 RET 공여체로부터 비방사능 쌍극자-쌍극자 상호작용에 의해 다른 여기성 잔기인 RET 수용체로 에너지 전달하는 것을 포함한다. RET 공여체 및 수용체 쌍은 공여체와 수용체 사이에 FRET 상호작용이 생기도록 하기 위해 본 발명의 센서 구조물에 대해 선택된다. 공여체의 방출 스펙트럼은 일반적으로 수용체의 방출 스펙트러에 비하여 더 짧은 파장을 가져야 한다(즉, 공여체의 최적 방출 최대 파장, λmax 는 수용체의 최적 방출 최대 파장보다 짧아야 하다). 전통적인 FRET에서, 공여체의 방출 스펙트럼 및 수용체의 흡수 스펙트럼은 어느 정도 중첩해야 한다. 그러나 란타나이드 킬레이트 공여체 및 비중첩성 수용체를 기본한 항-스토크의 시프트 FRET 경우에서와 같이 법칙에는 예외가 있을 수 있다 (예컨대 Anal. Chem. 2005 Mar 1; 77(5): 1483-7 참조).
또한 RET 공여체 및 RET 수용체는 FRET 상호작용이 일어나도록 하기 위해 센서 구조물 상에 아주 근접하게 위치해야 한다. 일반적으로 FRET는 공여체 및 수용체가 10 nm 미만 정도로 떨어져 있을 때 관측되지만, 공여체와 수용체 사이에 25 nm 정도 분자 거리에 있어도 FRET가 검출되었다(예컨대 J. Am. Chem. Soc. 2005 Mar 9; 127(9): 3115-3119 참조). 푀르스터의 이론에 따르면, 에너지 전달 효율은 공여체와 수용체 사이의 매질의 굴절율, 에너지 공여에 의한 형광/발광 방출에 대한 속도 상수 및 수용체 부재하에서 공여체의 분해수율(quantum yield)에 따라 달라진다. 본 발명의 센서 구조물의 RET 공여체 및 RET 수용체 사이의 FRET 상호작용에 의해 생성된 광학 신호의 세기는 공여체 및 수용체의 정체성에 따라 달라지는데, 이는 상이한 공여체 및 수용체 쌍은 상이한 푀르스터 반경을 갖기 때문이다.
RET 공여체가 여기 상태에 있고 또 FRET 상호작용이 공여체와 수용체 사이에 일어나면, 공여체의 형광 또는 발광이 소멸(quench)된다(즉, 전체 광 출력의 감소). 일부 RET 수용체의 경우, 광 방출은 RET 공여체로부터의 에너지 흡수 또는 전달에 의해 유도되어, 수용체에 의한 광 방출을 초래한다. 켄처(quencher)로 공지된 다른 수용체는 RET 공여체로부터 흡수된 에너지를 발산하고 광을 방출하지 않는다(또는 아주 약하게 방출한다).
본 발명의 방법에서 FRET 상호작용은 당업자에게 공지된 표준 수법을 이용하여 센서 구조물의 정상 상태 또는 시간-분해 형광 또는 발광을 측정함으로써 검출될 수 있다(예컨대 Curr. Opin. Chem. Biol. 2003 Oct; 7(5): 635-40 참조). 예컨대 RET 수용체의 형광 또는 RET 공여체 형광 또는 발광의 소멸 또는 이들 모두가 측정될 수 있다. 켄처가 RET 수용체로 사용되면, 공여체의 발광 소멸이 일반적으로 측정된다. 본 발명의 방법에서, RET 공여체 및 RET 수용체 사이의 예상되는 FRET 상호작용의 방해는 샘플 중 분석물의 존재를 나타낸다.
센서 구조물 성분
도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명의 센서 구조물(10)은 3개의 주요 요소, 즉 분자골격(20), 분자 인식 도메인(30) 및 한 쌍의 라벨(40,50)을 포함하며 푀르스터 공명 에너지 전달을 통하여 상호작용할 수 있다. 라벨(40,50)은 분자 골격(20)에 단단히 고정되어서 센서 구조물(10)의 MRD(30)에 결합된 분석물(60)의 부재시에 푀르스터 공명 에너지 전달을 통하여 상호작용하기에 충분히 근접한 상태에 있다. 분자인식 도메인(30)은 분자 골격(20) 또는 1개의 라벨(40 또는 50중의 하나)에 통합되거나 고정되어 있어서 분석물(60)의 MRD(30) 결합은 라벨(40,50) 쌍 사이의 푀르스터 공명 상호작용을 방해한다. 도 1에 도시된 바와 같이, MRD(30)는 분석물(60)과 결합하고, 일개 구체예의 분석물은 2개 라벨(40,50) 사이에 개재된다.
분자 인식 도메인
검출할 분석물에 따라서 다수의 상이한 유형의 MRD가 본 발명의 센서 구조물에 사용될 수 있다. 일개 구체예로서, MRD는 항체의 결합 도메인, 즉 CDR 영역이다. 일부 경우에서, 항체의 CDR3 부분과 같은 CDR 영역의 일부는 MRD로 작용할 수 있다. 항체 결합 도메인이 MRD이면, 완전한 항체의 일부일 수 있으며, 이 경우 분석물의 단일 항원결정기에 대한 항체가 바람직하게 사용된다. 이러한 항체는 하이브리도마 수법을 이용하여 제조된 단일클론 항체일 수 있거나 또는 당분야에 공지된 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 다중클론 항체가 분석물을 검출하기 위한 MRD로서 사용될 수 있다.
MRD는 이들의 특이적 결합 특징을 보유하는 항체 단편에 포함될 수 있다. 이러한 단편은 예컨대 항체의 Fc 부분이 결여된 항체 단편, 예컨대 Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편일 수 있다. Fab 및 F(ab')2 단편은 공지 방법에 의해, 예컨대 파파인, 트립신, 피신 및/또는 펩신과 같은 단백질분해 효소에 의해 단일클론 항체를 분해함으로써 제조할 수 있다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편을 디티오트레이톨 또는 머캅토에탄올과 같은 물질을 사용하여 환원 분해함으로써 제조할 수 있다. 단일 폴리펩티드 사슬에 전체 항체 결합 영역을 포함하는 단일 사슬 Fv(scFv) 항체는 완전한 항체의 중쇄 성분을 연결하는 디술피드 결합의 환원 분해를 통하여 얻을 수 있다. 바람직한 구체예로서, 항체 단편은 재조합 수법을 이용하여 제조될 수 있다.
항체의 결합 부분을 포함하는 MRD는 다수의 방식으로 분자 골격에 혼입될 수 있다. 일개 구체예로서, 항체 또는 항체 결합 도메인을 포함하는 그의 일부는 분자 골격과 독립적으로 제조되어 분자 골격에 부착된다. 예컨대 비오틴 잔기를 갖는 항체는 적합한 위치에 부착된 애비딘 잔기를 갖는 분자 골격에 부착될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 분자 골격은 재조합적으로 제조된 단백질을 포함하며, 또 MRD는 분자 골격에 포함된 항체의 결합 부분이다. 이렇게 하여 분자 골격 및 MRD가 함께 제조될 수 있으며 분자 골격에 MRD를 부착하기 위한 부가적 단계는 필요치 않다.
다른 구체예로서, MRD는 니켈과 같이 금속-결합제를 포획하기 위한 킬레이트화된 금속일 수 있다. 이 구체예에서, 금속은 분자 골격 또는 라벨에 화학적으로 결합된 금속-킬레이트화 기(니트릴로트리아세트산)를 통하여 센서 구조물에 킬레이트화되는 것에 의해 분자 골격에 결합된다. 바람직하게는 검출할 분석물은 펩티드 또는 단백질의 N- 또는 C-말단 근처의 다수의 히스티딘 잔기(통상 5 내지 6개)의 사슬인 His-태그가 부착된 펩티드 또는 단백질이다.
MRD는 다른 폴리펩티드 또는 비-펩티드를 결합하는 펩티드일 수 있다. 현재의 조합적인 펩티드 라이브러리 스크리닝 수법은 다수의 분자를 결합하는 독특한 펩티드의 선택을 가능하게 한다(예컨대 Science, 1990 Jul 27; 249 (4967): 404-6 참조). 펩티드 MRD는 센서 구조물의 분자 골격 또는 라벨에 통합될 수 있다.
MRD는 또한 다른 유형의 특이 결합 분자를 포함할 수 있다. 예컨대 MRD는 상보적 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 앱타머(aptamer)로 불리는 특정 DNA/RNA MRD는 단백질을 결합할 수 있으므로 단백질 분석물을 검출하는데 유용하다. MRD는 샘플 중에 항체의 존재를 검출하기 위하여 면역분석용 항체로 전형적으로 간주되는 잔기를 포함할 수 있다. 샘플은 일 구체예에 혈장 또는 혈액을 포함할 수 있고 또 MRD는 항-HIV 항체의 존재를 검출하기 위하여 항-HIV 항체에 대한 펩티드 항원결정기일 수 있다.
당업자들은 특정 결합 쌍(항체 및 항원과 같은)의 구성원은 분자 인식 도메인을 포함할 수 있음을 익히 알고 있을 것이다. 특정 결합 쌍은 탄수화물과 렉틴; 비오틴과 애비딘; 엽산과 폴레이트 결합 단백질; 비타민 B12와 고유 인자; 및 단백질 A 또는 단백질 G와 면역글로불린을 포함한다.
라벨
다수의 라벨이 RET 공여체 및/또는 RET 수용체로서 본 발명의 센서 구조물에 사용될 수 있다. RET 공여체 및 RET 수용체 모두는 형광 라벨일 수 있으며, 이것은 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 이들의 유도체와 같은 염료를 포함한다. 이것은 또한 FRET에서 공여체로서 란타나이드 (희토류 원소) 원자를 그리고 수용체로서 통상적인 유기 염료를 사용할 수 있다(예컨대 Nat. Struct. Biol. 2000 Sep; 7(9): 730-4 참조). 또한 형광 염료는 하기 표 1에 수록되어 있으며, 이들은 시중에서 구입할 수 있다(예컨대 Sigma Chemicals, St. Louis, MO 로부터).
표 1: 형광 라벨
| 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2-2'-디술폰산 | 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인 (DTAF) |
| 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린 | N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드 |
| 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) | 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC) |
| 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디술폰산 | 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC) |
| 퀴놀리지노 플루오레세인 이소티오시아네이트 (QFITC) | 단실 클로라이드 |
| 에오신 이소티오시아네이트 | 에리쓰로신 B |
| 플루오레스카민 | 플루오레센 |
| 플루오레세인 유도체 | 4-메틸움벨리페론 |
| o-프탈디알데히드 | 로다민 B 및 유도체 |
| 로다민 6G | 로다민 123 |
| 술포로다민 B | 술포로다민 101 |
| 술포로다민 101 산 클로라이드 |
형광 라벨은 또한 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP)와 같은 형광 단백질을 포함한다. GFP는 해파리 아에쿠오리아 빅토리아(Aequoria victoria)로부터 분리한 자연 형광 단백질이며, 다수의 GFP 변이체(청색 변이 및 적색 변이)가 개발되었다. 이러한 변이체 또는 유도체는 천연 GFP 서열에 치환, 부가 및/또는 결실을 갖는 분자를 포함한다. GFP 변이체는 BFP(블루), CFP(시안) 및 YFP(옐로우) 뿐만 아니라 EGFP, ECFP 및 EYFP와 같은 이들 분자의 향상된 변이체도 포함한다. GFP가 형광단 중의 하나이면, 로다민 또는 마리나 블루(몰리큘라 프로브스, 유진, OR)가 FRET 쌍의 다른 파트너로서 유리하게 이용된다. 또한 산호초 종 및 이들의 유전자변형된 변이체로부터 얻은 다수의 적색 형광 단백질(RFP)도 사용될 수 있다.
형광 단백질은 MRD 및/또는 분자 골격이 재조합적으로 사용될 때 본 발명의 센서 구조물에서 RET 공여체 및 수용체로서 유리하게 사용된다. 이 경우, RET 공여체 및 RET 수용체는 단일 폴리펩티드 분자로서 분자 골격 및/또는 MRD와 함께 제조될 수 있고 또 분자 상에서 RET 공여체 및 수용체의 치환은 정교하게 제어될 수 있다.
본 발명의 센서 구조물에서 라벨로 사용될 수 있는 다른 형광 화합물은 퀀텀 도트(quantum dot)로 불리는 나노결정을 포함한다. 퀀텀 도트(QD)는 형광 방출 파장이 결정의 크기에 비례하는 반도체 나노결정이다. 퀀텀 도트는 화합물의 엑시톤 보어 반경(Excition Bohr Radius) 순으로 직경을 가지며 일반적으로 2 내지 10 나노미터 폭이다. 이들은 전형적으로 2개 원소, 즉 주기율표의 2개 족으로부터의 원소, 즉 주기율표 2족 및 6족, 주기율표 3족 및 5족 또는 주기율표 4족 및 6족의 원소로부터 형성된 화합물을 포함한다. 예시적 물질은 CdSe, ZnS 및 PbSe를 포함한다. 퀀텀 도트의 외부 표면은 본 발명의 센서 구조물의 분자 골격과 같은 다른 잔기에 대한 부착을 촉진시키기 위하여 유기 분자에 대하여 용이하게 콘쥬게이트될 수 있다.
일부 구체예로서, 센서 구조물의 RET 공여체는 형광 잔기 대신 발광 잔기를 포함할 수 있다. 예컨대 RET 공여체는 그 기질 상에 작용할 때 강을 생성하는 루시페라제, 코엘렌테라진을 포함할 수 있다. YFP 및 GFP와 같은 형광 분자는 루시페라제와 함께 RET 수용체로서 작용할 수 있다. 루시페라제 또는 아에쿠오린과 같은 생물학적으로 유도된 화합물을 RET 공여체로 사용하는 것은 BRET(생체발광 공명 에너지 전달)이라 칭한다.
화학발광 잔기와 같은 다른 발광 잔기도 RET 공여체로서 사용될 수 있다. 예컨대 루미놀(5-아미노-2,3-디히드로-1,4-프탈아진-디온)은 과붕산염, 과망간염, 과염소산염, 요오딘 또는 루미놀을 산화시키는 과산화수소와 같은 염기성 용액에 노출될 때 녹색-청색 광을 방출하는 화학발광 화합물이다. 다른 발광 잔기는 비스(2,4,6-트리클로로페닐)옥살레이트(TCPO) 및 비스(2-(3,6,9-트리오아데카닐옥시카르보닐)-4-니트로페닐)옥살레이트(TDPO)와 같은 퍼옥시옥살레이트 화학발광단을 포함한다.
또한 켄처는 본 발명의 방법의 다른 구체예에 대한 RET 수용체로서 사용될 수 있다. DABCYL, BHQ 또는 QSY 염료(예컨대 QSY 7, QSY 9, QSY 21, QSY 35, 몰리큘라 프로브, 유진, OR, USA로부터 구입할 수 있음)와 같은 켄처의 사용은 직접(즉, 비-FRET) 수용체 여기에 기인한 배경 형광의 문제를 없애는 이점이 있다.
분자 골격
본 발명의 분자 골격은 RET 공여체, RET 수용체 및 MRD를 결합하고 또 이들 잔기를 서로에 대하여 특정 공간 관계로 유지하는데 적합하다. RET 공여체 및 RET 수용체는 MRD에 결합된 분석물의 부재하에서 공여체 및 수용체 사이의 푀르스터 공명 에너지 상호작용을 허용하는 거리에 존재해야 한다. RET 공여체, RET 수용체 및 MRD는 FRET 상호작용을 촉진시키기 위하여 정확한 쌍극자 배향으로 유지되어야한다(예컨대 Stryer L., Fluorescence energy transfer as spectroscopic ruler, Annu. Rev. Biochem., 47: 819-46 (1978) 참조). MRD는 바람직하게는 분석물을 결합할 때 MRD에 의해 결합된 분석물 또는 그의 일부가 RET 공여체와 RET 수용체 사이에 개재되게 하는 분자 골격으로 유지되어야하므로, 공여체와 수용체 사이의 푀르스터 공명 에너지 상호작용을 방해한다. 분석물의 검출을 가능하게 하기 위하여 본 발명의 센서 구조물에서 분자 골격의 변형은 필요치 않다.
라벨 및 MRD를 결합할 수 있는 다수의 상이한 분자는 본 발명의 센서 구조물에 분자 골격으로 사용될 수 있다. 예컨대 펩티드, 단백질, 탄수화물, 및 유기 분자 뿐만 아니라 핵산과 같은 분자의 조합물을 포함하는 분자가 본 발명의 센서 구조물의 분자 골격 잔기로서 사용될 수 있다. 일개 구체예로서, 분자 골격은 항체, 항체 단편, 또는 Fv 잔기와 같은 항체 유도체를 포함하는 단백질이다. Fv 잔기는 유연한 링커에 의해 안정화되어 단일-사슬 Fv (scFv)를 형성하거나, 또는 이질이합체성 나선형 코일에 의해 헬릭스-안정화된 Fv(hsFv)를 형성하는 VH 및 VL 단편을 포함한다.
다른 구체예로서, 분자 골격은 원형질막 주위공간 결합 단백질과 같은 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein: MBP)이다. GFP 및 YFP와 같은 라벨이 MBP의 N-말단 및 C-말단에 각기 부착되면, 이들은 푀르스터 공명 에너지 상호작용을 통하여 상호작용할 수 있다.
MBP와 같은 원형질막 주위공간 결합 단백질 또는 소형 분자에 결합되면 변형되는 다른 유사 단백질을 분자 골격으로 사용하면, 본 발명의 분석법의 감도를 향상시키기 위해 형태적 변화를 이용할 수 있지만, 이러한 형태적 변화는 본 발명의 센서 구조물을 이용한 분석물 검출에 불가결한 조건은 아니다. 말토오스 존재하에서 MBP는 힌지가 구부러지는 것과 유사한 형태적 변화를 거쳐서 RET 공여체와 RET 수용체로 하여금 더 근접하게 존재하게하여 검출가능한 FRET 상호작용을 초래한다. 그러나, MRD와 결합하는 표적 분석물의 존재하에서, FRET 효과는 감소된다.
다른 유형의 분자 골격을 사용하여 본 발명의 센서 구조물을 형성할 수 있다. 예컨대 이질이합체성 나선형 코일은 MRD 및 라벨을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 다르게는, 미국특허 5,945,526호에 기재된 바와 같은 유기 화합물을 포함하는 강질 링커를 사용하여 RET 공여체, RET 수용체 및 MRD를 유지할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자는 분자 골격으로 사용될 수 있다.
라벨의 커플링
RET 공여체, RET 수용체 및 MRD는 분자 골격의 유형에 따라 다양한 방식으로 분자 골격에 부착될 수 있다. 분자 골격 및/또는 MRD가 재조합 방법에 의해 제조된 단백질이면, 형광 또는 발광 단백질(GFP 및 루시페라제와 같은)은 재조합 단백질에 통합될 수 있고 분자 골격 또는 MRD와 함께 단일 분자로 제조될 수 있다. 예컨대 헥사-히스티딘 태그는 분자 골격 또는 MRD를 포함하는 단백질에 포함될 수 있다. 이것은 센서 구조물의 편리한 금속-친화성 정제를 가능하게 할 수 있고 His-태그는 Ni-NTA 콘쥬게이트된 형광단에 의해 라벨링될 수 있다(예컨대 Kapanidis AN, Ebright YW, Ebright RH, Site-speicfic incorporation of fluorescent probes into protein: hexahistidine-tag-mediated fluorescent labeling with (Ni(2+): nitrilotricetic Acid(n)-fluorochrome conjugates, J. Am. Chem. Soc. 2001 Dec 5; 123 (48): 12123-5 참조).
단백질의 위치-특이적으로 라벨링하는 다른 방법은 티올-반응성 시약으로 시스테인-특이적 라벨링하는 것을 포함한다. 위치-특이적 돌연변이를 이용하여 N-말단 시스테인을 scFv 잔기와 같은 단백질에 도입할 수 있다(예컨대 Gentle et al., Direct production of proteins with N-terminal cysteine for site-specific conjugation, Bioconjug. Chem., 15: 658-663 (2004) 참조). scFv 잔기의 아미노 말단의 위치-특이적 라벨링은 화학적 결찰 수법을 이용하여 티올-반응성 형광 또는 켄처 프로브를 통합할 수 있다(예컨대 Dawson, et al., Synthesis of proteins by native chemical liagtion, Science, 266: 776-779 (1994) 참조). 다양한 티올-반응성 형광단은 시중에서 구입할 수 있다. 다르게는, 티올-반응성 형광 올리고뉴클레오티드 프로브는 시중에서 입수할 수 있는 키트를 이용하여 복수 카피의 형광단을 티올-반응성 올리고뉴클레오티드에 도입할 수 있고, 또 이러한 티올-반응성 형광 올리고뉴클레오티드 프로브는 N-말단 시스테인과 같은 시스테인 잔기를 라벨링하기 위해 사용될 수 있다(예컨대 Tung, CH and Stein, S, Preparation and applications of peptide oligonucleotide conjugates, Bioconjug. Chem., 11: 605-618 (2000) 참조).
분자 골격이 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함하면, 라벨은 단백질 L, 단백질 A 및/또는 단백질 G와 같은 특정 결합 잔기를 사용함으로써 특이적으로 부착될 수 있다. 단백질 L(펩토스트렙토코커스 마그누스(Peptostreptococcus magnus)로부터 처음 분리됨)은 면역글로불린 경쇄(VL)의 구조(framework) 영역에 결합된다. 단백질 L(PpL)의 단일 도메인은 VL의 구조 영역에 강한 결합을 나타내고 또 항원 결합에 영향을 주지 않고 VL를 결합할 수 있다. 스타필로코컬(Staphylococcal) 단백질 A의 E 도메인(SPA-E)은 분석물 결합에 영향을 주지 않고 VH의 구조 영역에 강하게 결합한다. VL 및 VH 도메인의 아미노 말단은 FRET가 생기는 거리(약 3 내지 4 nm)에 존재하며 또 센서 구조물을 작성하기 위해 라벨을 결합하는 적합한 위치여야 한다.
상기 구체예에서, PpL 및 SPA-E는 정제된 에세리키아 콜리(Escherichia coli: 대장균)에서 발현될 수 있으며 또 RET 공여체 및 수용체와 함께 라벨링될 수 있다. 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체와 접촉하면, 상기 라벨링된 PpL 및 SPA-E 분자는 결합됨으로써 그러한 분자를 라벨링한다. 라벨을 분자 골격에 부착하는 다른 방법도 또한 가능하다. 예컨대 라벨은 통상의 화학 커플링 반응을 이용하여 분자 골격에 부착될 수 있으므로, 분자 골격에 라벨을 공유 부착할 수 있다.
분자 골격이 폴리뉴클레오티드이면, 라벨은 합성되는 동안 뉴클레오티드 포스포르아미다이트로 치환된 염료-포스포르아미다이트를 사용하여 폴리뉴클레오티드의 서열에 직접 혼입될 수 있다. 형광 염료를 폴리뉴클레오티드에 혼입하는 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
도 3에 도시된 바와 같이, 라벨(즉, 도 3에서 라벨(40))은 MRD에 의해 분석물 결합을 방해하지 않는 한 분자 골격에 직접 부착되기 보다는 MRD(30)에 직접 부착될 수 있다. 이러한 부착은 분석물이 MRD(30)에 의해 결합되기 전에, RET 공여체 및 RET 수용체 사이의 FRET 상호작용을 방해하지 않아야 한다.
일부 구체예에서, 센서 구조물에는 복수의 공여체 RET 잔기 및/또는 복수의 RET 수용체 잔기를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 도 4A에 도시한 바와 같이, 복수의 RET 공여체(42, 44, 46)은 라벨(40) 상에 제공되어 있고, 복수의 RET 수용체(52, 54, 56)는 RET 수용체(50) 상에 제공되어 있다. 센서 구조물(10)에 복수의 RET 공여체 및 수용체를 사용하는 것은 본 발명의 센서 구조물에 의해 생성된 광학 신호의 세기를 증가시킬 수 있다.
센서 구조물
다양한 분자 인식 도메인, 라벨, 및 분자 골격이 조합되어 본 발명의 센서 구조물을 형성할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 센서 구조물을 설계할 때, Deep View/Swiss PDB Viewer (http://www.expasy.org/spdbv/로부터 입수가능)와 같은 분자 모델링 도구가 단백질 구조 시각화 및 조작에 이용될 수 있다. Dock 5.0 (몰리큘라 디자인 인스티튜트, 유니버시티 오브 캘리포니아, 샌프란시스코로부터 입수가능)과 같은 프로그램은 분자 도킹에 이용될 수 있고, 또 InterPreTS (http://www.russell.embl.de/interprets/로부터 입수가능)은 단백질 상호작용을 분석하는데 이용될 수 있다. 이러한 도구에 사용하기 위한 단백질 구조물들은 예컨대 RCSB Protein DataBank (http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/로부터 입수가능)로부터 얻을 수 있다.
일개 구체예로서, MRD는 센서 구조물의 라벨 중의 하나에 부착될 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, MRD(30)는 라벨(40)에 부착된다. 유리하게는, 라벨 및 MRD가 폴리펩티드이고, 또 합쳐져서 단일 분자로서 생성된다. 도 2에 도시된 구체예에서, MRD(30)는 라벨(40)의 N-말단에 부착된다. 예시된 구체예에서 라벨(40)은 MBP일 수 있는 폴리펩티드 분자골격(20)의 N-말단에 부착된다. 다른 단백질 라벨(50)은 분자골격(20)의 C-말단에 부착된다. 유사한 구체예는 도 2A에 도시되며, 여기서 MRD(30)는 폴리펩티드 라벨(40)의 서열에 삽입된 펩티드 루프이다.
도 3에 도시된 다른 방법에서, 폴리펩티드 분자골격(20)(말토오스-결합 단백질일 수 있음)의 말단은 GFP와 같은 라벨(50)에 융합되고 또 scFv 또는 기타 항체 단편과 같은 폴리펩티드 분자 인식 도메인(30)을 포함하는 분자에 재조합 DNA 수법을 이용하여 융합될 수 있다. MRD(30)을 포함하는 분자는 라벨(40)에 의해 라벨링되며, 이것은 로다민과 같은 형광단일 수 있다. 펩티드 및 단백질 도메인을 포함하는 MRD는 MBP의 뉴클레오티드 서열의 특정 부위에 삽입될 수 있고, 또 이러한 융합 단백질은 말토오스를 결합하는 MBP의 능력에 영향을 주지 않고 재조합적으로 발현될 수 있다(예컨대 Betton et al., Location of tolerated insertions/deletions in the structure of the maltose binding protein, FEBS Lett. 325 (1-2): 34-8 (1993) 및 Guntas Ostermeier, Creation of an allosteric enzyme by domian insertion, J. Mol. Biol. 336(1): 263-73 (2004) 참조). 다르게는, MRD(30)는 MBP의 특정 위치에 화학적으로 결합될 수 있다.
다른 방법은 도 3A에 도시되어 있다. 이 구체예에서, MRD(30)는 분자 골격(20)에 직접 추가된다. MRD는 상술한 바와 같이 분자 골격에 부착될 수 있다. 도 3A는 분석물(60)이 MRD(30)에 결합되는 것을 도시한다.
본 발명의 센서 구조물(10)의 일부 구체예에서, 구조물은 서로 부착되거나 결합될 수 있는 개별 분자로부터 센서 구조물(10)을 형성할 수 있다. 예컨대 도면에 도시한 바와 같이, 일개 구체예로서, 본 발명의 센서 구조물(10)의 분자골격(20) 및/또는 MRD(30)는 별개로 제조되어 조립되는 2개 분자를 포함한다. 이것은 RET 공여체로 하여금 분자의 하나 및 서로 부착될 RET 수용체에 부착되게함으로써 분자골격 및/또는 MRD의 일부에 대한 라벨 부착을 더 잘 제어할 수 있다. 2개의 별개 분자로부터 자가 조립 센서 구조물을 생성하는 1가지 방법은 Winzip-A2B1과 같은 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드 분자를 이용하는 것이다(예컨대 J. Mol Biol. 2000 Jan 21; 295(3): 627-39). 도 4에 도시한 바와 같이, WinZip-A2와 같은 이질이합체성 나선형 코일 잔기(70)가 분자 골격(20)의 일부분(22)에 부착되고 또 제1 나선형 코일 잔기(70)(WinZip-B1과 같은)에 특이적으로 결합되는 다른 나선형 코일 잔기(80)가 분자골격(20)의 다른 부분(24)에 부착되면, 코일(70, 80)은 조합되어 분자골격(20)의 별개 부분(22, 24)을 결합하여 MRD(30)를 형성한다. 이러한 코일은 도 4 및 도 4A에 도시된 바와 같은 짧은 펩티드 링커(26, 28)와 같은 링커를 통하여 분자 골격 부분에 결합될 수 있다.
상기 구체예를 포함하는 1개의 특정 분자는 Fab 단편의 CH1 및 CL 도메인이 이질이합체성 나선형 코일(WinZip-A2B1 또는 E/K 나선형 코일 폴리펩티드와 같은)로 교체된 헬릭스-안정화된 재조합 Fv이다. 분자 골격의 1개 부분은 WinZipA2에 부착된 Fv 단편의 VH 영역을 포함하는 반면에, 다른 부분은 WinZipB1에 부착된 VL 영역을 포함한다. 양쪽 부분은 당업자에게 공지된 유전자 융합 및 표준 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. VH 및 VL 부분이 각각 서로 접촉하는 위치에 있으면, 이들은 자가조립하여 센서 구조물을 형성한다.
관련된 구체예에서, 도 5A, 도 5B 및 도 6에 도시된 바와 같이, 분자 골격(20)은 나선형 코일 폴리펩티드 쌍과 같이 서로에 대하여 특이적으로 결합하는 2개의 잔기를 포함할 수 있다. 도 5A 및 도 5B에 도시된 구체예에서, 제1 나선형 코일 폴리펩티드 파트너(70)는 링커(26)를 통하여 라벨(40)에 부착된다. 이 분자에는 특이 결합 영역(27)도 포함된다. 제2 나선형 코일 폴리펩티드 파트너(80)는 링커(28)를 통하여 라벨(50)에 부착되며, 또 서로에 대해 접촉되면 2개의 나선형 코일 파트너는 서로에 대해 특이적으로 결합한다. MRD는 특정 결합 영역(27)에 대한 파트너(25)에 부착되고 또 그와 접촉하면 특이적 결합 영역(27)과 결합되게 된다. 도 5B에 도시된 바와 같이, MRD(30)가 특이적으로 결합하는 항원결정기(62)를 포함하는 분석물(60)이 센서 구조물(10)의 상기 구체예를 포함하는 개별 분자와 접촉하게되면, MRD(30)에 결합된 분석물(60)은 결합 파트너(25, 27)를 통하여 구조물에 부착되어 라벨(40, 50) 사이의 FRET 상호작용을 방해하거나 변화시킨다.
도 6에 도시된 바와 같은 본 발명의 센서 구조물(10)의 다른 구체예로서, MRD는 라벨(40)이 역시 부착되어 있는 제1 특이 결합 분자(25)에 부착될 수 있다. 제2 라벨(50)(도 6에서 퀀텀 도트로서 예시)은 특이 결합 분자(25)에 대한 결합 파트너(27)에 부착된다. 서로 접촉되면, 이들 특이 결합 파트너(25, 27)는 결합하여 분자 골격(20)을 형성한다.
분석 방법
본 발명의 센서 구조물은 세포, 항체 및 단백질과 같은 대형 표적 분석물, 특히 약 1 nm 내지 약 25 nm, 보다 바람직하게는 약 3 nm 내지 약 6 nm 범위의 분자 크기를 갖는 분석물을 검출하기에 적합하다. 따라서 본 발명의 센서 구조물은 진단 분석법에 유리하게 사용된다. 예컨대 어떤 의료 상태에 있을 것으로 예상되는 사람은, 그 환자로부터 얻은 샘플물질(침, 요, 혈장, 혈청, 혈액 또는 기타 조직)을 본 발명의 센서 구조물을 함유하는 용액과 접촉시키는 것에 의해 본 발명의 센서 구조물을 사용하여 시험될 수 있다. 본 발명의 센서 구조물은 샘플에 존재할 것으로 예상되는 상태의 지시제와 결합하기에 적합하다. 샘플 중의 지시제를 적합한 신호 세기 수준으로 센서 구조물에 결합된 것을 검출하면, 환자는 그 상태에 있는 것으로 진단될 수 있다. 동일 분량 또는 뱃치로 정제되거나 제조된 실험 또는 제조된 물질의 샘플은 특정 동일 분량 또는 뱃치에 소망하는 물질의 존재를 검출하기 위해 시험될 수 있다. 예컨대 크로마토그래피 분리로부터 얻은 용출물의 분획은 용액중 관심을 두고 있는 분석물을 함유하는 분획을 검출하기 위해 시험될 수 있다. 환경 샘플과 같은 다른 샘플은 샘플 중에 원하지 않는 오염물질을 검출하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 시험될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 따라 실시된 분석법은 비-경쟁적 분석법이고, 상기 센서 구조물은 분석물을 결합하는 것에 대하여 직접적으로 신호를 생성한다. 샘플을 센서 구조물과 접촉시킨 후, 센서 구조물로부터 얻은 광학 신호가 측정된다. 구조물의 RET 공여체 및 RET 수용체 사이의 푀르스터 공명 에너지 전달 상호작용의 방해가 검출되면, 이것은 목적하는 분석물이 샘플에 존재함을 의미한다. 바람직하게는, 광학 신호는 센서 구조물의 RET 공여체 및 RET 수용체 사이의 푀르스터 공명 에너지 전달 상호작용에 의해 생성된 제어 광학 신호를 측정하기 위하여, 센서 구조물이 샘플과 접촉하기 전에 센서 구조물을 함유하는 용액으로부터 얻는다. 대조용 광학 신호 및 샘플 중에 측정된 광학 신호 사이의 차이는 샘플에 존재하는 분석물의 양을 정량 측정하기 위해 사용될 수 있다. 레이셔메트릭 방법은 당업자에게 공지된 바와 같이 상기 측정을 실시하기 위해 이용될 수 있다. 센서 구조물에 의한 방출 세기 및/EH는 센서 구조물에 의해 방출된 광학 신호의 분해 동력학의 변화는 상기 목적을 위해 측정될 수 있다. 시간-분해 방법은 란타나이드와 같은 긴 수명을 갖는 RET 공여체가 당업자에게 공지된 바와 같이 사용될 때 적용된다.
본 발명의 방법의 한가지 이점은 센서 구조물을 고체 지지체에 부착하지 않고 용액 중에서 실시될 수 있는 점이다. 이것은 통상적인 ELISA와 같은 고체 상 분석법에 필요한 다수의 결합 및 세척 단계를 피할 수 있어 분석 처리량이 현저히 증가되며 작업자 실수가 적다. 필요한 경우, 본 발명의 구조물은 마이크로티터 웰 또는 마이크로어레이와 같은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 본 발명의 센서 구조물이 고체 지지체에 부착된 경우, 상이한 분석물에 특이적인 센서 구조물은 고체 지지체, 예컨대 마이크로어레이 상의 구별되는 위치에 위치할 수 있다. 샘플에 특정 분석물이 존재하는 것은 분석물을 결합하도록 되어 있는 센서 구조가 결합된 지지체 상의 구별되는 위치로부터 나온 적합한 광학 신호에 의해 표시된다. 이렇게하여 단일 샘플이 복수의 분석물의 존재에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 구체예에는 다수의 고체 지지체가 사용될 수 있다. 적합한 고체 지지체는 플레이트, 웰, 멤브레인 및 파이버를 포함한다. 예컨대 고체 지지체가 입자, 마이크로어레이, 마이크로티터 웰, 도파관 또는 모세관일 수 있다. 고체 지지체는 MRD에 의한 분석물 결합 또는 RET 공여체와 RET 수용체 사이의 FRET 상호작용을 방해하지 않고 본 발명의 센서 구조물이 결합되는 물질로 제조될 수 있다. 적합한 물질은 니트로셀룰로오스, 유리 및 합성 중합체, 예컨대 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리스티렌, 폴리프로피렌, 폴리카르보네이트글리시딜메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아미드 및 폴리비닐클로라이드를 포함한다.
본 발명의 센서 구조물은 당업자에게 공지된 고체 지지체에 결합될 수 있다. 예컨대, 고체 지지체가 실리카를 갖는 입자이면, 표면 결정성 커플링제가 사용될 수 있다(예컨대 Falipou etal., New use of cyanosilane coupling agent for direct binding of antibodies to silica supports, Bioconjug. Chem., 10: 346-353 (1999) 참조). 마이크로어레이 포맷의 경우, 센서 구조물은 시중에서 구입할 수 있는 멀티웰 글래스 마이크로어레이 슬라이드에 스포팅될 수 있다. 웰은 소수성 코팅(Erie Scientific, Portsmouth, NH로부터 구입)을 사용하고 핀-툴(pin-tool)형 마이크로어레이어를 이용하여 마이크로어레이를 생성할 수 있다.
형광단을 여기시키고 또 본 발명의 센서 구조물로부터 생성된 광학 신호를 검출하고 측정하기 위한 다양한 계가 당분야에 공지되어 있다. 예컨대 와이드-필드 형광 현미경 및 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSCM)이 사용될 수 있다.
키트
일개 구체예로서, 본 발명의 센서 구조물은 분석물을 검출하는데 사용하기 위한 키트로 제공된다. 예컨대, 키트는 항체의 Fv 부분을 포함하는 폴리펩티드; 단백질 A의 E 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합된 RET 공여체를 포함하는 제1 라벨; 및 단백질 L의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합된 RET 수용체를 포함하는 제2 라벨을 포함할 수 있다. 이들 별개의 성분이 용액중에서 조합되면, 제1 라벨은 단백질 A 도메인을 통하여 Fv 잔기의 VH 부분에 결합되게 되고, 또 제2 라벨은 단백질 L 도메인의 Fv 잔기의 VL 부분에 결합되게 된다. 다르게는, 제1 라벨은 RET 수용체를 포함할 수 있는 반면에 제2 라벨은 RET 공여체를 포함한다.
다른 구체예로서 이러한 키트는 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드에 결합된 RET 공여체를 포함하는 제1 라벨 및 RET 수용체 및 제1 라벨의 나선형 코일 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드를 포함하는 제2 라벨을 포함할 수 있다. 이 구체예에서 키트는 제1 라벨, 제2 라벨 또는 양쪽에 바람직하게는 링커를 통하여 특이적으로 결합되는 분자 골격 상에 포함된 분자 인식 도메인을 포함한다.
도 1은 본 발명의 방법에 따라 센서 구조물에 분석물이 결합되는 것을 도시한다.
도 2는 MRD가 라벨에 부착된 본 발명의 센서 구조물의 다른 구체예를 도시한다.
도 2A는 MRD가 라벨에 부착된 본 발명의 센서 구조물의 다른 구체예를 도시한다.
도 3은 본 발명의 센서 구조물의 다른 구체예에 분석물이 결합되는 것을 도시한다.
도 3A는 본 발명의 센서 구조물의 다른 구체예에 분석물이 결합되는 것을 도시한다.
도 4는 MRD가 자가 조립되는 본 발명의 센서 구조물의 다른 구체예를 도시한다.
도 4A는 라벨이 또한 자가 조립되는 도 4에 도시된 센서 구조물의 구체예를 도시한다.
도 5A는 본 발명의 센서 구조물의 다른 자가 조립 구체예를 도시한다.
도 5B는 도 5A에 도시된 센서 구조물에 분석물이 결합되는 것을 도시한다.
도 6은 분자 골격이 자가 조립성인 본 발명의 센서 구조물의 구체예를 도시한다.
도 7A 내지 도 7G는 본 발명의 방법에 따라 실시되는 실험 결과를 도시하는 그래프이다.
실시예
1: 항-
GFP
항체의 검출
본 발명의 방법의 단일성을 확인하기 위하여 말토오스 결합 단백질 구조물을 시험하였다. 이 구조물(형광 지시제 단백질, 또는 FLIP로 공지)은 말토오스 결합 단백질을 기본으로 한다. MBP 잔기의 N-말단에 결합된 것은 ECFP(향상된 시안 형광 단백질)이고, MBP의 C-말단에 결합된 것은 EYFP(향상된 황색 형광 단백질)이다. 헥사-히스티딘 태그는 이 구조물의 N-말단에 부착되었다. PCT 국제 특허출원 WO 03/025220호에 기재된 이 구조물은 워싱톤 카네기 인스티튜션의 울프 프로머 교수로부터 제공받았다.
이 구조물을 이용하여 몇 개의 상이한 실험을 실시하였다. 결과를 도 7A-7I에 도시하며, 이것은 하기 표 2에 나타낸 기호를 이용하고 있다.
표 2: 도 7 설명
| 기호 | 정의 |
| RS | 센서단백질의 FERT 비 |
| RSA | 표적(항체)에 결합될 때 센서 단백질의 FERT 비 |
| RSAL | 먼저 표적에 결합된 다음 말토오스에 결합될 때 센서 단백질의 FERT 비 |
| RSL | 말토오스에 결합될 때 센서 단백질의 FERT 비 |
| δA | RSA - RS |
| δAL | RSAL - RSL |
상기 구조물은 분자의 MBP 부분에서 형태적 변화로 인하여 말토오스 존재하에서 증가된 FRET 비(R)를 나타내며, 이는 형광단이 서로 더 근접하게 존재하게 한다. 몇개의 상이한 농도의 구조물을 항-GFP 다중클론 항체(ECFP 및 EYFP에 결합)와 함께 말토오스 존재하 및 부재하에서 배양하였다. 도 7A 및 도 7B에 도시한 바와 같이, 센서 구조물의 FRET 비는 항-GFP 항체 존재하에서 감소하였으며, GFP에 결합됨으로써 구조물의 RET 수용체 및 RET 공여체 사이의 RET 효과를 방해한다. 이 구조물로부터의 FRET 방출은 GFP에 특이적이지 않는 항체 존재하에서 측정하여 FRET 방출 세기에서 실제적 변화는 없었다. 이들 결과를 도 7C에 도시하며, 대조를 위하여 도 7B에 도시된 결과도 포함한다.
센서로부터의 FRET 비 감소에서의 유사한 경향은 도 7E 및 도 7F에 도시한 바와 같이 단일 클론 항-GFP 항체 및 단일클론 항-His 태그 항체에 의해서도 관찰되었다. 표적(이 경우, 항-GFP 다중클론 항체)과 결합될 때 센서 단백질의 FERT 비 는 시간 함수로 측정되었다. 도 7D에 도시된 바와 같이, FERT 비에서의 변화는 즉각적으로 나타나며, 최대 감소는 계에서 약 30분 후에 측정되었다. 본 발명의 방법의 정량 특징은 센서 농도의 함수로서 FERT 비의 변화를 시험함으로써 나타내었다. 이 실험의 경우, 다중클론 항-GFP 항체(30 nM)의 고정 농도는 표적 분석물로서 사용되었고 센서의 FRET 비의 변화는 다양한 센서 농도하에서 측정되었다. 도 7G에 도시한 바와 같이, 센서 신호(FRET 비)는 약 30 nM에서 포화되기 시작하며, 이는 표적 분석물의 농도를 정확하게 나타낸다(다중클론 항-GFP 항체).
실시예
2: 용액에서
His
-
태그된
단백질에 대한 분자 골격으로서
MBP
를 포함하는 센서 구조물
N-말단에 부착된 ECFP 잔기 및 C-말단에 부착된 EYFP 잔기를 갖는 재조합 말토오스 결합 단백질을 포함하는 실시예 1에 기재된 바와 유사한 센서 구조물을 제조하였다. 그러나 실시예 1과는 달리 상기 융합 단백질은 헥사-히스티딘 태그를 함유하지 않는다. ECFP 의 N-말단 및 EYFP의 C-말단은 시스테인 잔기를 함유하도록 돌연변이처리되며, 그에 의해 티올-반응성 니트릴로트리아세트산과 화학적 콘쥬게이션을 허용한다(Maleimideo-C3-NTA; DoJindo, Gaithersburg, MD). 콘쥬게이트된 니트릴로트리아세트산은 히스티딘-태그된 단백질에 결합되는 니켈과 같은 금속 이온을 킬레이트화하기 위해 사용된다. 다르게는, 니트릴로트리아세트산 기는 당업자에게 공지된 부위 특이적 돌연변이 및 화학 콘쥬게이션 수법을 이용하여 N-말단 및 C-말단 사이의 위치에서 말토오스 결합 단백질에 결합될 수 있다. 이 센서는 His 태그를 포함하는 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
실시예
3:
His
-태깅된 단백질을 용액에서 검출하기 위한 분자 골격으로서 나선형 코일을 포함하는 자가 조립 센서 구조물
분자 골격으로서 이질이합체성 나선형 코일을 포함하는 센서 구조물은 다음과 같이 제조하였다. E-코일(EVSALEK 헵타드(heptad) 서열)은 당업자에게 공지된 재조합 수법을 이용하고 펩티드 링커를 통하여 WinZip-A2 코일(예컨대 J. Mol. Biol. 2000 Jan 21; 295(3): 627-39)에 결합시켰다. E-코일의 N-말단을 RET 라벨에 티올 커플링하기 위한 시스테인 잔기에 포함되도록 돌연변이시켰다. N-말단 서열에 의해 변형된 K-코일(KVSALKE 헵타드 서열)은 화학적 펩티드 합성 또는 재조합 수법에 의해 생성되며 티올-반응성 니트릴로트리아세트산에 의해 라벨링하였다. 또한 E-코일(RET 라벨에 티올 커플링하기 위한 시스테인 잔기에 혼입되도록 돌연변이된 N-말단을 가짐)은 당업자에게 공지된 유전자 융합 및 재조합 방법을 이용하여 펩티드 링커를 통하여 WinZip-B1 코일(예컨대 J. Mol. Biol. 2000 Jan 21; 295(3): 627-39 참조)에 결합시켰다. 이들 3개 펩티드 코일을 함께 배양하여 도 5A에 도시된 바와 같은 자가 조립 나선형 센서 구조물이 형성되도록 하였다. His-태깅된 단백질에 결합되면, 센서 구조물의 FERT 특성은 도 5B에 도시된 바와 같이 변화될 것이다.
실시예
4: 재조합
Fv
항체를 포함하는 자가 조립 센서 구조물
재조합 Fv 항체 단편을 포함하는 센서 구조물은 별도의 2개의 융합 단백질에 의해 제조하였다(예컨대 J. Mol. Biol. 2001 Sep 7; 312(1):221-8 참조). 제1 융합 단백질은 그의 C-말단에서 링커에 결합된 Fv 분자의 VH 부분을 포함하며, 이것은 자신을 펩티드 코일의 N-말단, WinZip-A2에 결합시켜 VH::링커::WinZip-A2를 형성한다. 상기 링커는 유연성의 14개 아미노산 펩티드를 포함하며 약 2.4 내지 2.6 nm 길이이며 아미노산 Gly, Ser, Thr, Pro로 구성된다. 제2 융합 단백질은 그의 C-말단에서 링커에 결합된 Fv 분자의 VL 부분을 포함하며, 이것은 자신을 펩티드 코일의 N-말단, WinZip-B1에 결합시켜 VL::링커::WinZip-B1을 형성한다. 제2 융합 단백질에 대한 링커는 마찬가지로 유연성의 14개 아미노산 펩티드를 포함하며 약 2.4 내지 2.6 nm 길이이며 아미노산 Gly, Ser, Thr, Pro로 구성된다.
PpL 및 SPA-E를 사용하여 2개 융합 단백질을 라벨링한다. PpL 및 SPA-E로 태깅된 헥사-히스티딘은 대장균에서 발현되고, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 정제되고 RET 공여체 및 RET 수용체 형광단에 의해 라벨링된다. 형광단-라벨링된 PpL 및 SPA-E는 적합한 융합 단백질과 함께 배양하여 VL 및 VH 도메인에 대한 특이적 결합을 허용한다.
실시예
5: 단일 클론 항체를 포함하는 자가 조립 센서 구조물
형광단-콘쥬게이트된 PpL 및 SPA-E는 단일클론 항체의 VH 및 VL 영역을 라벨링하기 위해 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조하였다. PpL 는 VL의 구조 영역에만 결합되는 반면에, SPA-E는 VH에 결합되고 또 적은 정도로 Fc에 결합된다. Fc에 대한 SPA-E의 결합 친화성은 스트렙토코커스(Streptococcus) 단백질-G B1 (SPG-B1)도메인의 Fc 결합 친화력에 비하여 적기 때문에. 단일클론 항체는 SPG-B1과 먼저 배 양되어 SPA-E가 Fc에 결합되는 것을 차단한다. 형광단-라벨링된 PpL 및 SPA-E는 항체와 함께 배양된다.
본 발명은 특정 바람직한 구체예를 참조하여 자세하게 논의하였지만, 다른 구체예도 가능하다. 본 발명의 방법에 기재된 단계는 본 발명을 제한하지 않으며 또는 각 단계에 개시된 단계는 상기 방법에 필수적인 것은 아니며, 오로지 예시적 목적의 단계이다. 따라서, 본 발명의 특허청구범위는 본 명세서에 함유된 바람직한 구체예의 개시에 한정되어서는 안된다. 본 명세서에 개시된 모든 참고문헌은 전체적으로 본 발명에 대한 참고문헌으로 포함된다.
Claims (41)
- (a) (i) 분석물과 특이적으로 반응하는 분자 인식 도메인;(ii) RET 공여체를 포함하는 제1 라벨; 및(iii) 제1 라벨의 RET 공여체에 대한 RET 수용체를 포함하는 제2 라벨을 포함하는 센서 구조물을 제공하는 단계;(b) 샘플을 상기 센서 구조물과 접촉시키는 단계; 및(c) 센서 구조물로부터 생긴 광학 신호를 측정하는 단계를 포함하며,상기 RET 수용체는 공여체로부터 수용체로 푀르스터(Foerster) 공명 에너지 전달이 생기게 하는 거리에 의해 RET 공여체로부터 분리되며,상기 분자량 인식 도메인이 분석물과 결합하면, RET 공여체 및/또는 RET 수용체에 대한 분석물의 근접성은 RET 공여체 및 RET 수용체 사이의 FRET 상호작용을 방해하며,샘플 중의 분석물의 존재는 RET 공여체와 RET 수용체 사이의 푀르스터 공명 에너지 전달 상호작용에 의한 방해가 검출될 때 측정되는,샘플 중의 분석물을 검출하는 방법.
- 제 1항에 있어서, RET 수용체는 약 25 nm 미만의 거리 정도로 RET 공여체로부터 분리되어 있는 방법.
- 제 2항에 있어서, 복수의 RET 공여체 및 RET 수용체를 더 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, RET 공여체는 형광 단백질, 발광 단백질, 비-단백질 형광단, 비-단백질 화학발광 화합물 및 형광 나노결정으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 공여체는 GFP, EGFP, RFP, BFP, CFP, ECFP, YFP, EYFP 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 1항에 있어서, RET 수용체는 형광 단백질, 비-단백질 형광단, 형광 나노결정 및 켄처로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 1항에 있어서,센서 구조물이 샘플과 접촉하기 전에, 센서 구조물의 RET 공여체 및/또는 RET 수용체 사이의 푀르스터 공명 에너지 전달 상호작용에 의해 생긴 대조용 광학 신호를 측정하는 단계; 및상기 대조용 광학 신호와 단계 (c)의 광학 신호 사이의 차이를 측정하는 단계를 더 포함하며, 상기 대조용 광학 신호와 단계(c)의 광학 신호 사이의 차이는 샘플 내의 분석물의 양을 나타내는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 대조용 광학 신호와 단계 (c)의 광학 신호 사이의 차이를 측정하는 단계는 센서 구조물의 형광 또는 발광 세기의 변화 또는 분해 동력학을 측정하는 것을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 센서 구조물은 폴리페티드를 포함하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 폴리펩티드는 항체의 Fv 부분을 포함하며, 또 분자 인식 도메인은 Fv 부분의 CDR 영역을 포함하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 센서 구조물을 제공하는 단계는 분자 인식 도메인, 제1 라벨 및 제2 라벨을 포함하는 폴리펩티드를 별도로 제공하는 것을 포함하는 방법.
- 제 11항에 있어서, 제1 라벨은 단백질 A의 E 도메인을 포함하는 링커를 포함하고 또 제2 라벨은 단백질 L의 결합 도메인을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 분자 인식 도메인은 킬레이트화된 금속을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 분자 인식 도메인은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법.
- (i) 분석물의 항원결정기와 특이적으로 반응하는 분자 인식 도메인;(ii) RET 공여체를 포함하는 제1 라벨; 및(iii) 제1 라벨의 RET 공여체에 대한 RET 수용체를 포함하는 제2 라벨을 포함하며,상기 RET 수용체는 공여체로부터 수용체로 푀르스터(Foerster) 공명 에너지 전달이 생기게 하는 거리에 의해 RET 공여체로부터 분리되며,분자 인식 도메인이 분석물과 결합할 때, 분석물의 일부는 RET 수용체와 RET 공여체 사이에 개재되는, 분석물을 검출하기 위한 센서 구조물.
- 제 15항에 있어서, 센서 구조물은 폴리펩티드를 포함하는 센서 구조물.
- 제 16항에 있어서, 센서 구조물은 단쇄 Fv(scFv)를 포함하며, 또 분자인식 도메인은 scFv의 CDR 영역을 포함하는 센서 구조물.
- 제 17항에 있어서, 제1 라벨은 scFv에 결합되는 센서 구조물.
- 제 17항에 있어서, 제2 라벨은 scFv에 결합되는 센서 구조물.
- 제 16항에 있어서, 센서 구조물은 항체의 Fv 부분을 포함하며, 또 분자 인식 도메인은 Fv 부분의 CDR 영역을 포함하는 센서 구조물.
- 제 20항에 있어서, 제1 라벨은 Fv의 VH 잔기에 결합되고 제2 라벨은 Fv의 VL 잔기에 부착되는 센서 구조물.
- 제 21항에 있어서, 제1 라벨은 단백질 A의 E 도메인을 포함하고 또 제 라벨은 단백질 L의 결합 도메인을 포함하는 센서 구조물.
- 제 20항에 있어서, 제1 라벨은 Fv의 VL 잔기에 부착되고 또 제2 라벨은 Fv의 VH 잔기에 결합되는 센서 구조물.
- 제 23항에 있어서, 제1 라벨은 단백질 L의 결합 도메인을 포함하고 또 제2 라벨은 단백질 A의 E 도메인을 포함하는 센서 구조물.
- 제 16항에 있어서, 센서 구조물은 항체를 포함하는 센서 구조물.
- 제 25항에 있어서, 제1 라벨은 단백질 L의 결합 도메인 및 단백질 A의 E 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 링커를 포함하는 센서 구조물.
- 제 25항에 있어서, 제2 라벨은 단백질 L의 결합 단백질 및 단백질 A의 E 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 링커를 포함하는 센서 구조물.
- 제 16항에 있어서, 분자 인식 도메인은 펩티드 항원결정기를 포함하는 센서 구조물.
- 제 15항에 있어서, 분자 인식 도메인은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 센서 구조물.
- 제 15항에 있어서, 제1 라벨은 분자 인식 도메인을 포함하는 센서 구조물.
- 제 15항에 있어서, 제2 라벨은 분자 인식 도메인을 포함하는 센서 구조물.
- 제 16항에 있어서, 제2 구조물은 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드 쌍을 포함하는 센서 구조물.
- 제 32항에 있어서, 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드 쌍은 WinZip-A2/WinZip-B1 및 E/K 코일로 구성된 군으로부터 선택되는 센서 구조물.
- 제 16항에 있어서, 센서 구조물은 원형질막 주위공간 결합 단백질을 포함하는 센서 구조물.
- 제 28항에 있어서, 원형질막 주위공간 결합 단백질이 말토오스 결합 단백질인 센서 구조물.
- 제 16항에 있어서, 분자 인식 도메인은 센서 구조물에 특이적으로 결합되는 센서 구조물.
- (a) 분석물에 특이적으로 결합되는 분자 인식 도메인을 포함하는 분자 골격;(ii) RET 공여체를 포함하는 제1 라벨; 및(iii) 제1 라벨의 RET 공여체에 대한 RET 수용체를 포함하는 제2 라벨을 포함하며,상기 RET 수용체는 공여체로부터 수용체로 푀르스터(Foerster) 공명 에너지 전달이 생기게 하는 거리에 의해 RET 공여체로부터 분리되며,분자 인식 도메인이 분석물과 결합할 때, 분석물의 일부는 RET 수용체와 RET 공여체 사이에 개재되는, 분석물을 검출하기 위한 센서 구조물.
- 제 37항에 있어서, 센서 구조물은 폴리펩티드를 포함하는 센서 구조물.
- 제 37항에 있어서, 분자인식 도메인은 킬레이트화된 금속을 포함하는 센서 구조물.
- 별개 성분으로(a) 항체의 Fv 부분을 포함하는 폴리펩티드;(b) RET 공여체를 포함하는 제1 라벨; 및(c) 제1 라벨의 RET 공여체에 대한 RET 수용체를 포함하는 제2 라벨을 포함하며,상기 제1 라벨 또는 제2 라벨 중의 하나는 단백질 A의 E 도메인을 포함하고, 또 나머지 라벨은 단백질 L의 결합 도메인을 포함하는, 제20항의 센서 구조물을 제조하기 위한 키트.
- 별개 성분으로(a) RET 공여체 및 제1 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드를 포함하는 제1 라벨;(b) 제1 라벨의 RET 공여체에 대한 RET 수용체 및 제2 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드를 포함하는 제2 라벨; 및(c) 분자 인식 도메인을 포함하는 분자 골격을 포함하며;상기 제1 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드는 제2 이질이합체성 나선형 코일 폴리펩티드에 특이적으로 결합되며, 또` 상기 분자 골격은 제1 라벨 또는 제2 라벨에 특이적으로 결합되는 링커에 부착되는,센서 구조물을 제조하기 위한 키트.
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