CN103901000B - 一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素b1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素B₁的方法。首先，将NaYF₄:Yb，Ho上转换荧光纳米颗粒与金纳米颗粒分别共价结合到特殊的分子信标茎状部分两端，由于荧光共振能量转移上转换荧光被金纳米颗粒淬灭。后将伏马菌毒素B₁适配体与其互补链杂交固定在磁性纳米颗粒表面，加入被测物伏马菌毒素B₁与其适配体发生特异性结合，导致互补链从磁性纳米颗粒上脱落，脱落的互补链与分子信标杂交，能够使分子信标环状部分打开，此时荧光共振能量转移体系被打破，荧光信号恢复。通过检测荧光信号强度，确定伏马菌毒素B₁的含量，该方法检测限达到0.01 ng·mL^‑1。本发明可以快速、准确、灵敏的检测食品样品中伏马菌毒素B₁的含量。

Description

一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素B1的方法

技术领域

一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素B₁(FB₁)的方法，属于纳米材料和分析化学技术领域，用于对粮食、食品中FB₁含量进行检测。

背景技术

伏马菌素(fumonisin，FB)是一类主要由串珠镰刀菌产生的真菌毒素。目前已知FB共有11种衍生物，其中FB₁(C₃₄H₅₉O₁₅N，分子量721)和FB₂(C₃₄H₅₉O₁₄N，分子量705)是污染食品的主要成分，也是导致FB毒性作用的主要原因。经研究证实，FB₁、FB₂可引起马脑白质软化症(ELEM)和猪肺水肿综合症(PPE)。FB对人类健康也构成威胁，若感染可能诱发食道癌、肝癌、胃癌等疾病。研究表明，FB特别是FB₁广泛存在于玉米及其制品中；在大米、小麦、大麦、调味品、高粱、啤酒、牛奶等食品和饲料中也有一定浓度的FB存在，对人的健康和食品业、畜牧业发展构成潜在威胁。

由于FB分布广泛且毒性较大，因此它在食品安全检测中越来越受到人们的重视。国际上认为FB是一种具有重大卫生学意义的真菌毒素，已形成继黄曲霉毒素之后的又一个研究热点。世界卫生组织亦将FB作为近几年需要优先进行研究的几种真菌毒素之一。国际癌症研究机构与加利福尼亚环境保护机构已宣布伏马毒素为人类潜在的致癌物质(2B级致癌物)。但目前国际上对于食品与饲料中伏马毒素的限量及检测方法尚无统一标准。瑞典规定人类食物中伏马毒素的限量为1mg/kg，美国食品与药品管理局(FDA)发布了供人类食用的玉米和玉米产品伏马毒素的最高限量指导性公告，规定人类食用玉米中伏马毒素最高限量为2mg/kg。同时，FDA的畜牧医学中心(CVM)也发布了动物饲料中伏马毒素的最高限量指导性公告，规定其限量范围为1～50 mg/kg。在FAO/WHO联合会上关于食品添加剂的会议(2001年2月)中规定，伏马毒素对人体的安全限量为每天摄入量按人体体重算FB₁、FB₂、FB₃量不超过2μg/_kg。FB₁以低于最大限量为最好，对FB₂、FB₃的限制相对较宽。我国对此的相关法规也正在制定中。

关于伏马毒素的检测国内外已建立了多种方法。由于FB₁在天然食品中的含量最多，所以目前的大多数检测方法都针对FB₁如：薄层色谱法TLC，高效液相色谱法HPLC，液质联用技术，色谱法普遍精确性及可重复性较好，然而操作相对繁琐，成本昂贵尤其是样品的处理要求较高，不适合大批量样品检测。酶联免疫测定法ELISA，由于特异性、灵敏度较好，样品几 乎不需特殊处理即可检测，且适用于大批量样品检测，但试剂的稳定性还难以达到要求。

荧光共振能量转移(FRET)技术作为能在生物活体和体外检测纳米级距离变化的工具，为研究生物大分子内部结构、性质、反应机理及其动态监测，乃至定量分析等提供了一条快速简便的途径。FRET具有灵敏度高、适用广泛、分析速度快等优点，目前已在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸蛋白检测等方面有了广泛的应用。而对于FRET体系中，能量供体(donor)和能量受体(acceptor)的选择和改进成为近年来研究的热点。上转换材料(UCNPs)是在稀土掺杂的无机纳米材料中一类特殊的发光材料，它能够通过多光子机制把长波辐射(近红外光)转换成短波辐射，发射出比激发光波长短的荧光(紫外可见光)，即上转换荧光。它是一种反Stokes发光，已成为把红外光转换成可见光的有效方法。上转换材料具有如下诸多优点：光化学稳定，检测背景低，穿透性强，且不会引起背景信号的干扰，因此利用上转换荧光材料作为能量供体大大提高了检测的灵敏度和准确性。

核酸适配体(aptamer)是从一个体外合成的随机寡核苷酸文库中通过指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术筛选得到的与靶物质特异性结合的一簇DNA或RNA片段。这种寡核苷酸序列形成的高级结构具有能识别与之相对应的任何类型的蛋白和低分子的靶物质，并与靶物质有高亲和力而形成靶物质一适配子的复合物。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、易修饰、易固定、可反复使用和长期保存的优点，并且核酸适配体作为识别分子在蛋白质研究、药物检测、医学诊断和食品安全等方面得到了广泛应用。

因此本发明利用FB₁适配体特异性识别被测物中的FB₁，同时利用合成得到的表面生物功能化的上转换纳米材料为供体和金纳米材料为受体构成荧光共振能量转移体系，以980nm激光诱导上转换荧光为检测信号，通过对不同浓度FB₁标准品的检测，建立标准曲线，达到对含FB₁样品进行定量检测的目的。该发明可以用于玉米、小麦，饲料及其制品中FB₁含量的检测。

发明内容

一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素B₁的方法：首先，将经过生物功能化修饰的NaYF₄:Yb，Ho上转换荧光纳米颗粒与金纳米颗粒分别共价结合到特殊的分子信标(MB)茎状部分两端，由于荧光共振能量转移上转换荧光被金纳米颗粒淬灭。后将伏马菌毒素B₁适配体与其互补链杂交固定在生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面，加入被测物伏马菌毒素B₁与其适配体发生特异性结合，导致互补链从Fe₃O₄磁性纳米颗粒上脱落，脱落的互补链 与分子信标杂交，能够使分子信标环状部分打开，此时荧光共振能量转移体系被打破，荧光信号恢复。在一定范围内FB₁的含量与上转换荧光信号恢复的趋势相关，以此现象对FB₁标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对FB₁样品进行定量检测的目的；步骤为：

1.通过水热-溶剂热技术，制备NaYF₄:Yb，Ho上转换纳米颗粒(Y/Yb/Ho:78/20/2mol％)，并利用正硅酸四乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷对上转换纳米颗粒表面进行修饰，最终得到带有氨基基团在水溶液中分散性良好的NaYF₄:Yb，Ho上转换纳米颗粒。

2.利用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法得到粒径为1 5 nm左右的金纳米颗粒。

3.分别通过共价键结合，将功能化NaYF₄:Yb，Ho上转换纳米颗粒与分子信标3’端连接，作为能量共振供体；将金纳米颗粒与分子信标5’端连接，作为能量共振受体。此时因为荧光共振能量转移，上转换荧光被金纳米颗粒淬灭。

4.制备羧基化的Fe₃O₄磁性纳米颗粒，并在EDC和NHS的作用下利用缩合反应将FB₁的适配体固定到Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面，随后按照碱基互补配对原则使得FB₁适配体的互补链也成功固定到Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面。

5.在核酸修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒体系中加入被分析物FB₁，FB₁选择与FB₁适配子特异性结合，使得适配体互补链从Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面脱落，利用磁场从溶液中移去Fe₃O₄磁性纳米颗粒，加入上转换纳米材料连接分子信标连接金纳米颗粒的复合物中(UCNPs-MB-AuNPs)。由于适配体互补链会与分子信标环状部分碱基配对，从而打开分子信标，打破上转换纳米颗粒与金纳米颗粒构成的FRET体系。最后上转换荧光得以恢复。

6.利用以上实验设计，对不用浓度FB₁标准品进行检测，在980 nm激光激发下得到550nm处的上转换荧光信号，空白组检测得到的荧光信号(I₀)最低，随着FB₁浓度的增加荧光信号(I)逐步增大。根据荧光差值(ΔI＝I₀-I)与对应的FB₁标准品浓度建立标准曲线。实验结果在0.01-100ng/mL区间内得到良好线性关系。

7.对含有FB₁的实际样品进行检测：对样品做简单的处理，随后直接加入到上述体系中孵育根据在980nm激光激发下得到550 nm处的上转换荧光信号，从标准曲线中求得对应的FB₁的浓度。

利用上转换纳米颗粒与金纳米颗粒荧光共振能量转移方法检测伏马菌毒素B₁的方法有益效果：

1.本发明采用适配体对被检物质能够特异性识别的功能，提高了检测的准确性和稳定性。

2.本发明利用激光诱导上转换荧光发射，检测背景低大大提高了检测的灵敏度。

3.本发明利用荧光共振能量转移体系，简化了前处理步骤，缩短了检测时间。

附图说明

图1：上转换纳米颗粒与金纳米颗粒荧光共振能量转移方法检测伏马菌毒素B₁的方法的实验原理图。

图2：NaYF₄:Yb，Ho上转换纳米颗粒电镜图(a)；NaYF₄:Yb，Ho@SiO₂上转换荧光纳米材料电镜图(b)。

图3：金纳米颗粒紫外吸收图(a)；NaYF₄:Yb，Ho上转换纳米颗粒荧光光谱(b)。

图4：金纳米颗粒电镜图(a)；NaYF₄:Yb，Ho上转换纳米颗粒与金纳米颗粒复合物电镜图。

图5：上转换荧光强度随伏马菌毒素B₁变化叠加图(a)；伏马菌毒素B₁检测标准曲线图，浓度范围在0.01-100ng/mL内(b)。

图6：本发明和ELISA方法检测同样的实际样品得到的相关性曲线。

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实施例1：玉米实际样品中伏马菌毒素B₁检测标准曲线的建立及检测样品预处理：玉米高速粉碎过筛，称取20g于100mL烧瓶中，加入5gNaCl，80％乙醇水溶液，充分混匀后置于均质器中高速搅拌提取2min，静止片刻，过滤，取10mL滤液置于50mL烧瓶中，再次在均质器中高速搅拌提取2min，静止后用超细玻璃纤维过滤纸过滤，直至滤液澄清，收集滤液备用。

从本地四家农贸市场购买15种不同类别的玉米，利用本发明方法和酶联免疫法分别测定其中伏马菌毒素B₁的含量，结果见表一，将得到的数据进行相关性比较，结果P＜0.0001，两者无显著差异。说明该发明方法快速可靠，灵敏度高，稳定性好，适合用于玉米实际样品中伏马菌毒素B₁的检测。

表一：玉米实际样品检测，本发明方法与ELISA方法对比

注：ND为未检出。

实施例2：玉米实际样品中伏马菌毒素B₁的检测及加标回收率实验样品预处理同实施例1。

从实施例1得到的15组伏马菌毒素B₁浓度数据中选择三组作为本底值，接着选取0.5ng/mL、5.0ng/mL、50ng/mL三种不同浓度的FB₁标准品分别添加到待测物中，同样利用本发明方法再次检测其中FB₁的含量，得到检测值。回收率％＝(检测值-本底值)/添加量×100％。从表二的结果来看，回收率在91.1％～120％，说明本发明稳定，灵敏，准确，适合用于玉米实际样品中FB₁的检测。

表二：玉米实际样品中伏马菌毒素B₁的检测及加标回收率

Claims (2)

1.一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素B₁的方法，其特征在于：在伏马菌毒素B₁适配体与其互补链杂交修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒分散液中，加入伏马菌毒素B₁标准液或处理好的待测样品，孵育1小时后磁分离移去Fe₃O₄磁性纳米颗粒，将分离得到的上清溶液加入NaYF₄：Yb，Ho上转换纳米颗粒连接分子信标连接金纳米颗粒的复合物溶液中，孵育1小时，用980nm激光激发NaYF₄：Yb，Ho上转换纳米颗粒，测定荧光强度，对照标准曲线计算样品中的伏马菌毒素B₁含量。

2.根据权利要求1所述一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素B₁的方法，其特征在于：将氨基功能化NaYF₄：Yb，Ho上转换纳米颗粒与分子信标3’端连接，将金纳米颗粒与分子信标5’端连接，在此荧光共振能量转移体系中，NaYF₄：Yb，Ho上转换纳米颗粒作为荧光共振能量转移体系的能量供体，金纳米颗粒作为荧光共振能量转移体系的能量受体。