CN101124472A - 传感器构建体和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了传感器构建体10，其用于检测样品中待分析物60的存在情况，其包括分子骨架20，通过Frster共振能量转移相互作用的一对标记40、50以及至少一种分子识别结构域30。当待分析物60与分子识别结构域30结合时，标记40、50之间的Frster共振能量相互作用被打断，导致光学信号的改变。

Description

传感器构建体和检测方法
本申请要求2004年3月17日提交的、名称为“Novel FluorescentNanosensor Proteins”的美国临时专利申请No.60/554,313的优先权，该申请通过引用被整体并入本文。
背景技术
免疫检验和基于聚合酶链式反应(PCR)的检验是用于检测待分析物的最为广泛使用的技术。虽然基于PCR的技术通常能给出好的检测灵敏度，但是它们并未在很多实验室中广泛用于常规筛选。一个理由是，当PCR用于检测生物材料中的待分析物时，其准确性不仅受PCR检验本身性能的强烈影响，还会被从待测生物材料中提取的核酸品质强烈影响。此外，基于PCR的方法的检测灵敏度会被提取物中干扰扩增过程的抑制剂降低。此外，还需要训练有素的实验室人员来操作PCR检验，以确保其准确性。
免疫检验通常不那么昂贵，也仅需要较少的培训即可操作。它们已以多种不同的形式被采用，其中酶联免疫吸附检验(ELISA)、横向流动免疫检验和Western印记检验是最常用的。但是，目前，ELISA和Western印记技术需要多个孵育步骤，容易出现操作错误。横向流动免疫检验通常更快，但是不如传统ELISA准确。
Tsien et al.提出了另一种检验形式，用于检测待分析物。该技术被描述于美国专利No.5,998,204中，其中使用了具有待分析物结合区域和两个荧光标记的蛋白质。当待分析物结合区域结合上待分析物时，构象变化就会发生，使得两个荧光标记改变相互间的相对位置。这就改变了标记之间的荧光共振能量相互作用，对其进行检测以测定待分析物的结合。
Frommer et al.在PCT国际申请No.03/025220中已经提出了一种类似的检验形式。该检验使用融合蛋白，其包括周质(periplasmic)结合蛋白部分和两个荧光蛋白部分。该融合蛋白在结合待分析物后构象会改变，从而改变了两个荧光蛋白部分的相对位置。由此在荧光蛋白部分之间诱导出了改变的荧光共振能量相互作用。
Tsien和Frommer公开的检验系统都需要使用在结合上目标待分析物时改变构象的传感器构建体。此外，这两者都仅能检测小的待分析物，例如简单的糖和氨基酸。因此，人们仍然需要更为通用的、利用共振能量转移相互作用的检测待分析物的方法，但其不限于必须改变构象以检测待分析物的构建体，或仅能检测小的待分析物的构建体。
发明内容
本发明的检测样品中待分析物的方法涉及使用传感器构建体，所述构建体包括：(i)与待分析物特异性结合的分子识别结构域；(ii)包含RET供体的第一标记；以及(iii)包含针对RET供体的RET受体的第二标记。RET受体与RET供体分开一个距离，该距离允许从供体到受体的Frster共振能量转移得以发生，优选是大约1到大约25纳米的距离。当传感器构建体的分子识别结构域与待分析物结合之后，待分析物与RET供体和/或RET受体的接近干扰了RET供体和RET受体之间的FRET相互作用，产生可被检测到的光学信号。样品中待分析物的存在与否是通过对该光学信号的检测来指示的。
本发明的方法还包括更为具体的步骤：在传感器构建体与样品接触之前，对传感器构建体的RET供体和RET受体之间的Frster共振能量转移相互作用所产生的对照光学信号加以测量，然后对传感器构建体与样品接触之后检测到的光学信号与对照光学信号之间的差异加以测定。该信号和对照光学信号之间的差异代表了样品中待分析物的含量，由此使得可对待分析物进行定量检测。优选地，传感器构建体的荧光或发光的强度和衰减动力学的变化被作为光学信号来测量。
在本发明的方法中，RET供体可以是大量荧光或发光基团中的任何种类，例如，荧光蛋白、发光蛋白、非蛋白荧光团、非蛋白化学发光化合物以及荧光纳米晶体。RET受体可以是能猝灭(quench)来自RET供体的信号的分子，在一些实施方式中，其展示出增加的、敏化的受体信号。为增加光学信号的强度，可在每个传感器构建体上包括多个RET供体和受体。传感器构建体自身可以是多肽，其可包含抗体或抗体片段，例如抗体的Fv部分。在此类实施方式中，分子识别结构域是传感器构建体的Fv部分的CDR区域。分子识别结构域可以包含金属，例如螯合的金属，或者作为替代，包含寡核苷酸。
在传感器构建体的一些实施方式中，分子骨架(scaffold)、分子识别结构域和/或标记可以作为单独的分子提供，然后合并起来形成传感器构建体。例如，分子骨架可以包含异二聚卷曲螺旋多肽对，分子识别结构域可以包含抗体(包含VH和VL片段)Fv片段的结合结构域。在该实施方式中，分子识别结构域还可以是螯合金属、寡核苷酸、肽、生物素分子或非肽性的酶底物/抑制剂分子。在此类实施方式中，传感器构建体的不同组分在互相接触的时候是自组装的(self-assembling)，并且允许从RET供体到RET受体的Frster共振能量转移发生。
附图说明
结合下文描述、所附的权利要求以及附图，将能更好地理解本发明的上述和其它特征、方面和优点，其中：
图1描述了根据本发明的待分析物与传感器构建体的结合。
图2描述了本发明的传感器构建体的替代性实施方式，其中，MRD与标记相连。
图2A描述了本发明的传感器构建体的另一种实施方式，其中，MRD与标记相连。
图3描述了待分析物与本发明的传感器构建体的另一种替代性实施方式的结合。
图3A描述了待分析物与本发明的传感器构建体的又一种实施方式的结合。
图4描述了本发明的传感器构建体的另一种替代性实施方式，其中，MRD是自组装的。
图4A描述了其中标记也是自组装的图4示出的传感器构建体的实施方式。
图5A描述了本发明的传感器构建体的另一种自组装的实施方式的装配。
图5B描述了待分析物与图5A示出的传感器构建体的结合。
图6描述了其中分子骨架是自组装的本发明的传感器构建体的实施方式。
图7A-7G描述了根据本发明进行的实验的结果。
本申请文件中展示的所有尺寸都仅为示例之用，不起任何限制作用。此外，这些附图中展示的比例也非必要的比例。本领域普通技术人员参考本申请文件将能理解，本申请文件中公开的任何设备或设备的任何部分的实际尺寸将由其计划用途来确定。
发明描述
本发明的传感器构建体允许对待分析物进行检测，这是通过对两种标记之间的Frster共振能量转移(FRET)相互作用加以干扰来进行的。当传感器构建体与待分析物结合时，此类干扰导致光学信号的强度改变，所述改变可被灵敏的比例测量(ratiometric)或荧光寿命测量检测到。因此本发明的传感器构建体在结合待分析物时能产生可被检测到的信号，因此它们是自身发出信号的(self-signaling)，相对目前很多必须要包括进额外的信号产生元件以检测待分析物的检测检验来说，这是优点。此外，不必将本发明的传感器构建体附到固体支持物上，因此，本发明的方法可在溶液中作为非竞争性的检验开展，并且提供了增加的检验通量。
定义
本文中使用的下述术语具有下文给出的定义，除非在使用此类术语时明确给出了不同的含义。
“待分析物”指样品中的分子、化合物或其它组分。待分析物可以是肽、蛋白质、多核苷酸、有机分子、糖或其它碳水化合物或碳水化合物聚合物、脂类或其它类型的分子，包括维生素、激素和疾病标记。待分析物可以与其它分子组合出现和/或作为其它分子的部分出现。优选地，待分析物不包括RET供体或RET受体。
“抗体”指能与待分析物特异性结合的免疫球蛋白。抗体包括多个种类和同种型(isotype)的免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM。“抗体片段”指包含完整抗体的一部分的分子，例如Fab、scFv、F(ab’)2和Fab’分子。“抗体衍生物”指具有添加或取代的抗体或其片段，例如，嵌合抗体。抗体、抗体片段和抗体衍生物可通过重组方法或本领域已知的任何其它方法从人或动物来源、从杂交瘤获得。
“表位”指待分析物表面局部定位的区域(或多个区域)，其能与分子识别结构域特异性结合。
“荧光”指暴露给外部来源的电磁辐射(通常是可见光范围的，例如，激光)导致的物质发光。就该定义的目的而言，荧光包括磷光，磷光被定义为激发辐射终止后物质上光的持续发射。
“Frster半径”指，RET供体和RET受体之间的共振能量转移达到50％效率的距离(即，FRET相互作用使得被激发的供体的50％的光谱发射暗淡)。
“FRET”、“FRET相互作用”以及类似的术语指RET供体和RET受体之间的Frster共振能量转移，以及类似类型的、不严格遵循Frster’s理论的能量转移，例如，当使用不相重叠的受体时，不相重叠的能量转移(见，例如，Anal.Chem.2005，77：1483-1487)。
“FRET比例”(在图7A-7I中由符号R来表示)指：当传感器构建体在最优RET供体激发波长(λmax)下被激发时，荧光RET供体和荧光RET受体在其各自的发射峰上的稳态荧光强度之比。“标记”指能提供可被检测到的信号的分子或基团。在本发明的传感器构建体和方法中，标记是RET供体或RET受体，信号是电磁(例如，光学)信号。
“发光”指，光从不热的来源(即，不是热的、白炽的物体)产生和发射出。若干种类型的发光包括化学发光和生物发光，其分别通过化学和生物化学反应产生。发光不包括荧光。
“基团(moiety)”指分子的具有特定性质的一部分。
“分子识别结构域”或“MRD”指能与待分析物特异性结合的分子或基团。MRD的例子包括抗体结合结构域(即，CDR区域)、抗原表位(例如，当检测抗体时)、螯合的金属、寡核苷酸、肽和激素受体。
涉及到球形蛋白或肽的“分子大小”指分子的流体动力学半径。
“寡核苷酸”指5至200个核苷酸的链，通常大约20至100个核苷酸，更优选地，大约30个核苷酸。
“肽”指包含50个或更少的相连的氨基酸的分子。
“多核苷酸”指包含两个或更多个相连的核酸的分子。多核苷酸包括核酸以及具有取代和添加的核酸分子。
“多肽”指包含两个或更多个相连的氨基酸的分子。
“蛋白质”指包含超过50个相连的氨基酸的分子。
“比例测量方法”指对来自RET供体和RET受体的荧光的比例加以测量从而测定样品中待分析物的含量的方法。比例测量可用荧光计来进行。
“RET供体”指能通过Frster共振能量转移与RET受体发生相互作用的荧光或发光基团或分子。
“RET受体”指，能通过RET受体的增强荧光和/或猝灭来自RET供体的信号，通过Frster共振能量转移与RET供体发生相互作用的基团或分子。
“传感器构建体”指分子或分子集合，其中包含在一起发生作用的亚单元(subunit)，其能提供可被检测到的信号，指示样品中待分析物的存在情况，该信号是待分析物与传感器构建体的结合所产生的。
在关于待分析物和分子识别结构域相互作用的方面，“特异性结合”或“特异性地结合”指在特定检验的条件下，分子识别结构域与待分析物结合，而不与样品中其它组分结合。在一些检验中，可以忍受相对少量的分子识别结构域的非特异性结合，但是将需要在解释检验结果的时候对此加以考虑，以避免假阳性结果或不准确的定量数据。在一些情况下，分子识别结构域可以结合特定族或特定组的分子，其仍被认为能与这些分子特异性结合，例如，当MRD与该组分子的共有表位结合的时候。待分析物与分子识别结构域的结合可以是可逆的，即，待分析物可从分子识别结构域上分开，而不会对待分析物或特异性结合伴侣的结构造成改变，或者，该结合可以是不可逆的，例如生物素或亲和素之间的结合。
“特异性表位结合”“特异性地与表位结合”和类似的术语指，分子识别结构域与待分析物的特定表位结合。此类结合仅发生于分子识别结构域和特定表位之间，虽然在一些检验中，少量的非特异性结合也是可以忍受的，例如，寡核苷酸与具有若干错配碱基的另一种寡核苷酸结合，或者抗体结合结构域与待分析物的异型体(isoform)结合。特异性表位结合不包括待分析物和大量不同分子之间都能发生的相互作用，例如，螯合剂和大量不同金属中任何一种的离子结合。但是，如果其能与特定族或组的分子的同一表位结合的话，分子识别结构域仍可被描述为展示了特异性的表位结合。例如，MRD可针对于一族抗体的Fc区域，由此与该特定族中大量不同的抗体特异性结合。
本文中使用的术语“包含”及该术语的变体，例如“包括”、“含有”等并不用于排斥其它添加物、组分、整数(intergers)或步骤。本文中使用的术语“该”和“所述”以及类似的说法将用来包含单数以及复数，除非在上下文中对其用法另有指明。
FRET
Frster共振能量转移是本发明用于检测待分析物的方法的物理原理。FRET涉及能量从RET供体(通常，是处于激发态的荧光基团或发光基团)转移到另一种可被激发的基团(即RET受体)上，这是通过非辐射的偶极-偶极相互作用造成的。针对本发明的传感器构建体来选择RET供体和受体，以确保在供体和受体之间可能发生FRET相互作用。供体的发射光谱通常应当具有比受体的发射光谱更短的波长(即，供体的最优发射波长的最大值，λmax，应较受体的要短)。在经典FRET中，供体和发射光谱和受体的吸收光谱应在一定程度上重叠。但是，当在基于镧系金属螯合供体和不相重叠的受体的抗Stokes’位移FRET的情况下，该规律也有例外(见，例如，Anal.Chem.2005 Mar 1；77(5)：1483-7)。
此外，在传感器构建体上RET供体和RET受体应当紧密靠近，以发生FRET相互作用。通常，当供体和受体分开的距离小于10纳米时，FRET看起来就会发生，但是在供体和受体之间分子距离高达25纳米时，也有过检测到FRET的情况(见，例如，J.Am.Chem.Soc.2005 Mar 9；127(9)：3115-3119)。根据Frster原理，能量转移效率还取决于供体和受体之间介质的折射系数、能量供体的荧光/发光发射的速度常数以及在没有受体的情况下供体的量子产率(quantum yield)。通过本发明传感器构建体的RET供体和RET受体之间的FRET相互作用产生的光信号强度取决于供体和受体的种类，因为不同的供体和受体对具有不同的Frster半径。
当RET供体处于激发态，并且在供体和受体之间发生FRET相互作用时，供体的荧光或发光会被猝灭(即，总的光输出减少)。对一些RET受体而言，光发射是通过从RET供体转移能量或能量吸收来触发的，这导致了受体的光发射。其它受体，例如猝灭剂，使从RET供体吸收的能量消亡，并且不会发射出光(或者发射的光很微弱)。
本发明的方法中，可通过使用本领域已知的标准技术(见，例如，Curr.Opin.Chem.Biol.2003 oct；7(5)：635-40)，对传感器构建体的稳态或时间分辨的(time-resolved)荧光或发光加以测量，来检测FRET相互作用。例如，可对RET受体的荧光，或RET供体荧光或发光的猝灭，或这两者均加以测量。当用猝灭剂作为RET受体时，通常对供体发射的猝灭加以测量。在本发明的方法中，对RET供体和RET受体之间预期的FRET相互作用的干扰显示出样品中待分析物的存在。
传感器构建体组分
如图1所示，本发明的传感器构建体10包括三个主要的元件，即，分子骨架20，分子识别结构域30和一对能通过Frster共振能量转移发生相互作用的标记40、50。标记40、50与分子骨架20相连，从而足够紧密的接近，使得在没有待分析物60与传感器构建体10的MRD 30结合的情况下能够通过Frster共振能量转移发生相互作用。分子识别结构域30被包括进分子骨架20，或与分子骨架20或标记中之一(40或50)相连，使得待分析物60与MRD 30的结合干扰标记对40、50之间的Frster共振相互作用。如图1所示，当MRD 30与待分析物60结合时，一种实施方式中的待分析物60即插入到两个标记40、50之间。
分子识别结构域
大量不同类型的MRD可被用于本发明的传感器构建体，这取决于将被检测的待分析物。在一种实施方式中，MRD是抗体的结合结构域，即，CDR区域。在某些情况下，CDR区域的一部分，例如抗体的CDR3部分可以作为MRD发挥作用。当抗体结合结构域是MRD的时候，其可以是完整抗体的一部分，在这种情况下，优选使用直接针对待分析物的单个表位的抗体。此类抗体可以是通过用杂交瘤技术制造的单克隆抗体，或其可通过本领域内已知的重组方法来制造。或者，多克隆抗体也可用作为MRD，以对待分析物加以检测。
MRD还可被包括进抗体片段，保持其特异性结合的特征。此类片段可以是，例如，缺少抗体Fc部分的抗体片段，例如，Fab、Fab’和F(ab’)2片段。Fab和F(ab’)2片段可以通过本领域已知的方法来制造，例如，通过用蛋白水解酶(例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶和/或胃蛋白酶)对单克隆抗体进行切割来制造。Fab’片段可以通过用试剂(例如二硫苏糖醇或巯基乙醇)对F(ab’)2片段进行还原切割来制造。在单条多肽链上包括整个抗体结合区域的单链Fv(scFv)抗体也可通过对连接完整抗体重链组分的二硫键进行还原切割来获得。在一种优选的实施方式中，或者可以使用重组技术来制造抗体片段。
包含抗体结合部分的MRD可通过大量的方法被包括进分子骨架。在一种实施方式中，抗体或包含抗体结合结构域的抗体部分是独立于分子骨架来制造的，然后再被连接到分子骨架上。例如，具有生物素基团的抗体可被连接到在适当位置上连有亲和素基团的分子骨架上。在一种优选的实施方式中，分子骨架包含通过重组方法制造的蛋白质，MRD是被包括进分子骨架的抗体的结合部分。以这种方式，分子骨架和MRD可以被一起制造，而无需额外步骤将MRD连接到分子骨架上。
在一种替代性的实施方式中，MRD可以是螯合的金属(例如，镍)，用于捕获结合金属的试剂。在该实施方式中，优选地，金属通过与传感器构建体螯合来结合分子骨架，螯合是通过金属-螯合基(例如，次氮基三乙酸)与分子骨架或标记通过化学方法连接来实现的。优选地，将被检测的待分析物是连接有His标签(即，靠近该肽或蛋白质的N-或C-末端的多个组氨酸残基的链，通常是五个或六个组氨酸残基)的肽或蛋白质。
或者，MRd可以是与其它多肽或甚至非肽类物质结合的肽。目前的组合肽文库筛选技术允许选出能结合多种不同分子的独特的肽(见，例如，Science.1990 Jul 27；249(4967)：404-6)。肽MRD可被包括进传感器构建体的分子骨架或标记。
MRD还可包含其它类型的特异性结合分子。例如，MRD可以是寡核苷酸，用于检测具有互补序列的多核苷酸。被命名为适配子(aptamer)的某些DNA/RNA MRD可以结合蛋白质，由此可能用于检测蛋白质待分析物。MRD还可包含典型地在免疫检验中被视为抗原的部分，以检测(例如)样品中抗体的存在情况。在一种实施方式中，样品可以包含血浆和血液，MRD可以是针对抗HIV抗体的肽表位，以检测抗HIV抗体的存在与否。
本领域技术人员将意识到，特异性结合对(例如，抗体和抗原)的任何成员可以包含分子识别结构域。特异性结合对包括碳水化合物和凝集素；生物素和亲和素；叶酸和叶酸结合蛋白；维生素B12和内因子(intrinsic factor)以及蛋白质A或蛋白质G和免疫球蛋白。
标记
大量的标记可作为RET供体和/或RET受体用于本发明的传感器构建体。RET供体和RET受体都可以是荧光标记，其中包括染料，例如，荧光素、若丹明(rhodamine)、香豆素及其衍生物。在FRET中，还可能用镧系金属(稀土元素)原子作为供体，传统有机染料作为受体(见，例如，Nat.Struct.Biol.2000 Sep；7(9)：730-4)。其它荧光染料被列于下表1中，它们全部都可从商业途径获得(例如，从Sigma Chemical，St.Louis，MO)。
表1：荧光标记
4-乙酰氨基-4’异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸 5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)
7-氨基-4-三氟甲基香豆素 N-(4-苯胺-1-萘基)马来酰亚胺
4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI) 7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)
4，4’-二异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸 四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)
喹嗪异硫氰酸荧光素(QFITC) 丹磺酰氯
异硫氰酸曙红 赤藓红B
荧光胺 荧光素
荧光素衍生物 4-甲基伞形酮
邻苯二醛 若丹明B及衍生物
若丹明6G 若丹明123
磺酰若丹明B 磺酰若丹明101
氯化磺酰若丹明101酸(sulforhodamine 101 acid chloride)
荧光标记还包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)。GFP是从水母Aequoria victoria中分离出来的自发发出荧光的蛋白质，已经发展出了大量的GFP变体(蓝移和红移的)。此类变体或衍生物包含对天然GFP序列进行取代、添加和/或缺失的分子。GFP变体包括BFP(蓝)、CFP(青)和YFP(黄)，以及这些分子的增强型变体，例如EGFP、ECFP和EYFP。当GFP是荧光团之一时，若丹明或Marina蓝(Molecular Probes，Eugene，OR)有利地被用作为FRET对的另一方。此外，来自珊瑚礁物种的红色荧光蛋白(RFP)以及它们的工程变体也可使用。
当MRD和/或分子骨架是通过重组制造的情况下，有利地，采用荧光蛋白作为本发明传感器构建体的RET供体和受体。在该情况下，RET供体和RET受体可随着分子骨架和/或MRD一起作为单个多肽分子被制造出来，RET供体和受体在分子上的位置可被精确控制。
在本发明的传感器构建体中可用作为标记的其它荧光化合物包括纳米晶体，其也被称为量子点。量子点(QD)是半导体纳米晶体，其荧光发射波长与晶体大小成比例。纳米点的直径类似化合物的激子玻尔半径，其通常为2至10纳米宽。典型地，它们包含从两种元素形成的化合物，各来自周期表的两个族，即来自周期表2和6族，周期表3和5族，或周期表4和6族。示例性的材料包括CdSe、ZnS和PbSe。量子点的外表面可以容易地与有机分子配对，从而促进与其它基团的结合，例如与本发明传感器构建体的分子骨架结合。
在一些实施方式中，传感器构建体的RET供体可以包含发光基团，以代替荧光基团。例如，RET供体可以包含萤光素酶，当其作用于其底物腔肠素上时会产生出光。荧光分子，例如YFP和GFP可以作为萤光素酶的RET受体。用可通过生物获得的化合物，例如萤光素酶或水母发光蛋白作为RET供体，有些时候被称为BRET(生物发光共振能量转移)。
其它发光基团，例如，化学发光基团也可被用作为RET供体。例如，鲁米诺(5-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮)是一种化学发光化合物，当其暴露给能氧化鲁米诺的碱性溶液，例如过硼酸盐、高锰酸盐、过氯酸盐(hyperchlorite)、碘或过氧化氢时就能发出蓝绿色的光。其它发光基团包括过氧草酸化学发光团，例如双(2，4，6-三氯苯基)草酸酯(TCPO)和双(2-(3，6，9-三氧癸基羰基)-4-硝基苯基)草酸酯(TDPO)。
此外，在本发明的方法的一些实施方式中，猝灭剂也可被用作为RET受体。使用猝灭剂，例如DABCYL、BHQ或QSY染料(例如，QSY7、QSY9、QSY21、QSY35，可从Molecular Probes，Eugene，OR，USA获得)具有优点，其可以消除直接(即，非FRET)受体激发导致的背景荧光带来的潜在问题。
分子骨架
本发明的分子骨架适用于结合RET供体、RET受体和MRD，以及保持这些基团互相之间的特定空间关系。RET供体和RET受体必须在一定距离之内，该距离能使得在没有待分析物与MRD结合时供体和受体之间的Frster共振能量相互作用得以发生。RET供体、RET受体和MRD还应被保持为正确的偶极定向，以促进FRET相互作用(见，例如，Stryer L.，Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler，Annu.Rev.Biochem.，47：819-46(1978))。MRD还优选被分子骨架保留，从而当其结合待分析物时，待分析物结合MRD或者至少其一部分插入到RET供体和RET受体之间，由此干扰供体和受体之间的Frster共振能量相互作用。本发明的传感器构建体中分子骨架不需要构象变化即可检测待分析物。
能结合标记和MRD的多种不同分子可被用作为本发明的传感器构建体中的分子骨架。例如，肽、蛋白质、碳水化合物和有机分子，以及包含此类分子的组合的分子例如核酸，可被用作为本发明传感器构建体的分子骨架基团。在一种实施方式中，分子骨架是包含抗体、抗体片段或抗体衍生物(例如Fv基团)的蛋白质。Fv基团包含VH和VL片段，所述片段优选被具有柔性的接头(linker)稳定，以形成单链Fv(scFv)，或被异二聚卷曲螺旋稳定，形成螺旋稳定的Fv(hsFv)。
在另一种实施方式中，分子骨架包含蛋白质，例如周质结合蛋白。一种此类蛋白是麦芽糖结合蛋白(MBP)。当标记(例如GFP和YFP)分别连接到MBP的N-和C-末端时，它们能通过Frster共振能量相互作用发生相互作用。
当使用周质结合蛋白(例如MBP)，或在结合到作为分子骨架的小分子上会发生构象改变的其它类似蛋白质时，可能利用此类构象改变来增强本发明检验的灵敏度，虽然此类构象改变对于用本发明的传感器构建体检测待分析物来说并非必要。存在麦芽糖的情况下，MBP会经历类似铰链弯曲(hinge-bending like)的构象改变，其使得RET供体和RET受体更为紧密接近，从而获得可被检测到的FRET相互作用。但是，在存在能与MRD结合的目标待分析物的情况下，该FRET效应会减弱。
其它类型的分子骨架也可被用于形成本发明的传感器构建体。例如，异二聚卷曲螺旋可被用于MRD和标记。或者，包含有机化合物的刚性接头，例如美国专利No.5,945,526中描述的那些，可被用于保持RET供体、RET受体和MRD。多核苷酸分子也可被用作为分子骨架。
标记的偶联
RET供体、RET受体和MRD可以以多种方式连接到分子骨架上，这取决于分子骨架的种类。当分子骨架和/或MRD是通过重组方法制造的蛋白质时，有利地，荧光或发光蛋白(例如GFP和萤光素酶)被包括进重组蛋白，并且与分子骨架和MRD一起作为单个分子被制造。例如，六-组氨酸标签可被包括进包含分子骨架或MRD的蛋白质。这不仅允许对传感器构建体方便地进行金属亲和性纯化，而且还可再用Ni-NTA桥联的荧光团对His-标签进行标记(见，例如，Kapanidis AN，Ebright YW，Ebright RH，Site-specific incorporation of fluorescent probes into protein：hexahistidine-tag-mediated fluorescent labeling with(Ni(2+)：nitrilotriacetic Acid(n)-fluorochrome conjugates，J.am.Chem.Soc.2001 Dec 5；123(48)：12123-5)。
用于对蛋白质进行定点标记的另一种方法涉及用具有硫醇反应活性的试剂进行半胱氨酸特异性标记。定点诱变被用于向蛋白质(例如scFv基团)引入N-末端半胱氨酸(见，例如，Gentle et al.，Direct production ofproteins with N-terminal cysteine for site-specific conjugation，Bioconjug.Chem.，15：658-663(2004))。然后可以用化学连接技术来引入具有硫醇反应活性的荧光或猝灭剂探针，从而获得对scFv基团氨基末端的定点标记(见，例如，Dawson，et al.，Synthesis of proteins by native chemical ligation，Science，266：776-779(1994))。大量具有硫醇反应活性的荧光团是可通过商业获得的。或者，可以用商业可获得的试剂盒，向具有硫醇反应活性的寡核苷酸中引入荧光团的多个拷贝，制造出具有硫醇反应活性的荧光寡核苷酸探针，此类具有硫醇反应活性的荧光寡核苷酸探针可用于标记半胱氨酸基团，例如，N-末端的半胱氨酸(见，例如，Tung，CH and Stain，S，Preparation and applications of peptide oligonucleotide conjugates，Bioconjug.Chem.，11：605-618(2000))。
当分子标记包含抗体、抗体片段或抗体衍生物时，可通过使用特异性结合基团，将标记特异性连接到免疫球蛋白轻链(VL)的构架区(framework)上，所述结合基团例如蛋白质L、蛋白质A和/或蛋白质G、蛋白质L(最初分离自Peptostreptococcus magnus)。蛋白质L(PpL)的单结构域还显示出与VL构架区的强有力地结合，其可以在不影响到抗原结合的情况下与VL结合。Staphylococcal蛋白质A(SPA-E)的E结构域与VH的构架区强有力地结合，其也不会影响到待分析物的结合。VL和VH结构域的氨基末端在允许FRET发生的距离之内(大约3至4nm之间)，因此是结合标记以构建传感器构建体的合适位置。
在该实施方式中，PpL和SPA-E可在Escherichia coli中表达，被纯化，以及分别用RET供体和受体标记。当与抗体、抗体片段或抗体衍生物接触的时候，经过标记的PpL和SPA-E分子结合，由此标记此类分子。将标记与分子骨架连接的其它方法也可能可行。例如，可以用传统的化学偶联反应，将标记连接到分子骨架上，导致标记与分子骨架的共价连接。
当分子骨架是多核苷酸时，可以在合成期间用染料-亚磷酰胺(在合成期间被取代为核苷酸亚磷酰胺)将标记直接包括进多核苷酸序列。将荧光染料包括进多核苷酸的其它方法也是本领域已知的。
如图3所示，标记(即，图3中的标记40)也可直接连接到MRD 30上，而不用与分子骨架直接连接，条件是此类连接不会干扰MRD与待分析物的结合。此类连接还不应干扰在MRD 30与待分析物结合之前RET供体和RET受体之间的FRET相互作用。
在一些实施方式中，有利地，将大量供体RET基团和/或大量RET受体基团包括进传感器构建体。如图4A所示，标记40上提供了多个RET供体42、44和46，而RET受体50上提供了多个RET受体52、54和56。在传感器构建体10中使用多个RET供体和受体可以加强本发明的传感器构建体产生的光学信号的强度。
传感器构建体
多种多样的分子识别结构域、标记和分子骨架可被组合，以形成本发明的传感器构建体。当对本文所述的多肽传感器构建体进行设计时，可以使用分子模型工具，例如Deep View/Swiss PDB Viewer(可从http://www.expasy.org/spdbv/获得)来进行蛋白质结构观察和操作。例如Dock 5.0的程序(可从Molecular Design Institute，University of California，San Francisco获得)可被用于分子对接，例如InterPreTS的程序(可从http://www.russell.embl.de/interprets获得)可用于分析蛋白质相互作用。用于此类工具的蛋白质结构可从例如RCSB Protein DataBank(可从http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/获得)获得。
在一种实施方式中，MRD可与传感器构建体的标记之一连接。如图2所示，MRD 30与标记40连接。有利地，标记和MRD是多肽，并一起作为单个分子被制造。在图2所示的实施方式中，MRD 30连接到标记40的N-末端上。在该详细的实施例中，标记40连接到多肽分子骨架20(可以是MBP)的N-末端上。另一个蛋白质标记50与分子骨架20的C末端相连。图2A中展示了一种类似的实施方式，其中，MRD 30是肽环，其插入到多肽标记40的序列中。
在图3所示的替代性方法中，用重组DNA技术，使多肽分子骨架20(其可以是麦芽糖结合蛋白)的末端与标记50(例如，GFP)和包含多肽分子识别结构域30(例如，scFv或其它抗体片段)的分子分别融合。包含MRD 30的分子然后再被标记40(其可以是荧光团，例如若丹明)所标记。包含MRD的肽或甚至是蛋白质结构域也可被插入到MBP核苷酸序列的某些位点，此类融合蛋白然后可以重组表达，而不会影响到MBP结合麦芽糖的能力(见，例如Betton et al.，Location of toleratedinsertions/deletions in the structure of the maltose binding protein.FEB S Lett.325(1-2)：34-8(1993)和Guntas Ostermeier，Creation of an allosteric enzyme bydomain insertion，J Mol Biol.336(1)：263-73(2004))。或者，MRD 30可与MBP的特定位置化学偶联。
图3A中描述了另一种方法。在该实施方式中，MRD 30与分子骨架20直接连接。MRD可按照上文所述连接到分子骨架上。图3A进一步示出了待分析物60与MRD 30的结合。
在本发明传感器构建体10的一些实施方式中，所述构建体可由单独的分子组成，所述单独的分子互相连接或联合，组成传感器构建体10。例如，如图所示，在一种实施方式中，本发明的传感器构建体10的分子骨架20和/或MRD 30可以包含两个分子，它们单独被制造，然后装配起来。这具有如下优点：允许RET供体与这些分子之一相连，而RET受体与另一个相连，使得分子骨架的部分和/或MRD与标记的结合可受到更好地控制。从两个单独分子制造自组装的传感器构建体的一种方法是利用异二聚卷曲螺旋多肽基团，例如WinZip-A2B1(见，例如，J Mol Biol.2000Jan 21；295(3)：627-39)。如图4所示，当异二聚卷曲螺旋基团70(例如WinZip-A2)被连接到分子骨架20的一部分22上，且另一卷曲螺旋基团80(与第一种卷曲螺旋基团70能特异性结合，例如，WinZip-B1)被连接到分子骨架20的另一部分24上时，螺旋70和80将会联合，由此拉拢分子骨架20的单独部分22和24相连，形成MRD 30。此类螺旋可通过接头，例如图4和图4A示出的肽接头26、28，加入到分子骨架部分中。
包含该实施方式的一种特殊的分子是被螺旋稳定的重组Fv，其中，Fab片段的CH1和CL结构域被异二聚卷曲螺旋(例如，WinZip-A2B1或E/L卷曲螺旋多肽)代替。分子骨架的一部分包含与WinZipA2相连的Fv片段的VH区域，另一部分包含与WinZipB1相连的VL区域。这两部分都可通过本领域已知的基因融合和标准重组方法来制造。当VH和VL部分以互相接触的方式放置时，它们会自组装，形成传感器构建体。
在相关的实施方式中，如图5A、5B和6所示，分子骨架20可以包含互相特异性结合的两个基团，例如卷曲螺旋多肽对。在图5A和5B示出的实施方式中，第一卷曲螺旋多肽伴侣70通过接头26与标记40相连。该分子中还包括特异性结合区域27。第二卷曲螺旋多肽伴侣80通过接头28与标记50相连，当互相接触时，这两种卷曲螺旋伴侣会互相特异性结合。MRD 30与针对特异性结合区域27的伴侣25相连，当接触到特异性结合区域27时，其就会与该区域联合。如图5B所示，当包含表位62(MRD30与其特异性结合)的待分析物60接触到包含该实施方式的传感器构建体10的单独分子时，与MRD 30结合的待分析物60即通过伴侣25、27与所述构建体相连，并干扰或改变了标记40和50之间的FRET相互作用。
在本发明传感器构建体10的另一种替代性实施方式中，如图6所示，MRD可以与第一特异性结合分子25相连，分子25上还连有标记40。第二标记50(在图6中示为量子点)与针对特异性结合分子25的结合伴侣27相连。当特异性结合伴侣25、27相互接触时，它们联合起来形成分子骨架20。
检验方法
本发明的传感器构建体适用于检测大的目标待分析物，例如，细胞、病毒、抗体和蛋白质，具体而言，分子大小在大约1nm至大约25nm范围内的待分析物，更优选地，在大约3nm至大约6nm范围内的。传感器构建体由此可有利地用于诊断检验。例如，可用本发明的传感器构建体，通过将来自患者的材料样品(例如，唾液、尿液、血浆、血清、血液或其它组织)与含有本发明的传感器构建体的溶液接触，来对怀疑可能具有一种医学病症的患者加以检测。传感器构建体适用于与样品中被怀疑存在的某病症的指示剂结合。如果检测到样品中指示剂与传感器构建体以适当的信号强度水平结合，那么患者可被诊断为患有该病症。还可对以部分(aliquot)或分批方式纯化或生产的实验材料或制造的材料的样品加以检测，以测定在特定的部分或批次中是否存在想要的材料。例如，可对来自色谱分离的洗出液加以检验，以检测出溶液中哪部分含有目标待分析物。还可根据本发明的方法，对其它样品(例如环境样品)加以检验，例如，用于检测这些样品中的不想要的污染物。
优选地，根据本发明的方法进行的检验是非竞争性的检验，传感器构建体应答于待分析物的结合直接产生信号。在将样品与传感器构建体结合之后，对来自传感器构建体的光学信号加以测量。如果检测到了对所述构建体的RET供体和RET受体之间的Frster共振能量转移相互作用的干扰，就表明，样品中存在目标待分析物。优选地，在将传感器构建体与样品接触之前就从含有传感器构建体的溶液中获得光学信号，以测出传感器构建体的RET供体和RET受体之间通过Frster共振能量转移相互作用产生的对照光学信号。该对照光学信号和在样品溶液中测量出的光学信号之间的差异可被用于对样品中存在的待分析物的含量加以定量测定。比例方法可被用于进行这种测定，这是本领域已知的。为此目的，可以测量传感器构建体的发射强度的变化和/或传感器构建体发射的光学信号的衰减动力学的变化。当使用长寿命的RET供体，例如镧系金属时，还可应用时间分辨方法，如本领域所已知的那样。
本发明的方法的一个优点在于，它们可以在溶液中进行，而无须将传感器构建体连到固体支持物上。这避免了固相检验(例如传统的ELISA)所需的多步结合和洗涤步骤，因此检验通量得以大幅提高，而操作错误的几率则更小。如果需要的话，本发明的构建体也可与固体支持物相连，例如与微滴定板或微阵列相连。当本发明的传感器构建体与固体支持物相连时，对于不同待分析物来说特异性的传感器构建体可被放置于固体支持物(例如，微阵列)上离散的位置上。样品中特定待分析物的存在可由来自支持物上离散位置的适当光学信号所表示，所述位置上结合了适于结合该待分析物的传感器构建体。以这种方式，可针对单种样品中多种待分析物的存在加以检测。
多种不同的固体支持物可用于本发明的这种实施方式。合适的固体支持物包括，平板、孔、膜和纤维，例如，固体支持物可以是颗粒、微阵列、微滴定板、波导管或毛细管。固体支持物可由能与本发明的传感器构建体结合、并且不会干扰MRD与待分析物的结合或RET供体和RET受体之间的FRET相互作用的任何材料制得。合适的材料包括硝酸纤维素、玻璃和大量合成聚合物，包括尼龙、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺和聚氯乙烯。
本发明的传感器构建体可通过已知方法与固体支持物偶联。例如，如果固体支持物是具有二氧化硅表面的颗粒，那么可使用腈基硅烷偶联剂(见，例如，Falipou et al.，New use of cyanosilane coupling agent for directbinding of antibodies to silica supports，Bioconjug.Chem.，10：346-353(1999))。对微阵列形式而言，传感器构建体可被点样到可通过商业途径获得的多孔玻璃微阵列玻片上。可以用针状工具类型的微阵列仪制造微阵列，用疏水涂层(可从Erie Scientific，Portsmouth，NH)来制造孔。
本领域已知多种系统可用于激发荧光团，以及用于检测和测量本发明的传感器构建体产生的光学信号。例如，可以使用广视野荧光显微镜以及激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)。
试剂盒
在一种实施方式中，本发明的传感器构建体可被提供于试剂盒中，用于检测待分析物。例如，此类试剂盒可以包括：包含抗体Fv部分的多肽；第一标记，包含RET供体，其与包含蛋白质A的E结构域的多肽结合；以及第二标记，包含RET受体，其与包含蛋白质L结合结构域的多肽相结合。当这些单独的组分在溶液中组合，第一标记就通过蛋白质A的结构域与Fv基团的VH部分相结合，第二标记就通过蛋白质L的结构域与Fv基团的VL部分相结合。或者，第一标记可以包含RET受体，而第二标记包含RET供体。
在另一种实施方式中，此类试剂盒可以包括：第一标记，包含RET供体，其与异二聚卷曲螺旋多肽相连，第二标记，包含RET受体以及异二聚卷曲螺旋多肽，其能与第一标记的异二聚卷曲螺旋多肽特异性结合。在该实施方式中，所述试剂盒还包括分子骨架上携带的分子识别结构域，其与第一标记、第二标记或这两者都能特异性结合，优选地，通过接头结合。
实施例
实施例1检测抗GFP抗体
对麦芽糖结合蛋白的构建体加以检验，以确定本发明方法的实用性。该构建体(也称为荧光指示剂蛋白，或FLP)基于麦芽糖结合蛋白。连接到MBP基团N末端的是ECFP(增强的青色荧光蛋白)，连接到MBP C末端的是EYFP(增强的黄色荧光蛋白)。将六-组氨酸标签进一步连接到该构建体的N-末端上。该构建体被描述于PCT国际专利申请No.WO03/025220中，由Carnegie Institution of Washington的Wolf Frommer教授好心提供。
用该构建体进行了若干项不同的实验。结果被展示于图7A-7I中，其中使用到了下表2中所示的符号。
表2：图7的图例说明
符号 定义
RS 传感器蛋白的FRET比例
RSA 结合到目标(抗体)时，传感器蛋白的FRET比例
RSAL 首先结合到目标然后结合到麦芽糖上时，传感器蛋白的FRET比例
RSL 结合到麦芽糖上时，传感器蛋白的FRET比例
δA RSA-RS
δAL RSAL-RSL
存在麦芽糖时，该构建体展示出增加的FRET比例(R)，这是由于该分子的MBP部分发生了构象改变，导致荧光团相互之间更为紧密接近。在存在及不存在麦芽糖的情况下，对多种不同浓度的该构建体与抗GFP多克隆抗体(其结合ECFP和EYFP)进行孵育。如图7A和7B所示，在存在抗GFP抗体的情况下，传感器构建体的FRET比例下降，该抗体与GFP的结合干扰了该构建体中RET受体和RET供体之间的FRET效应。在存在不特异于GFP的抗体的情况下，对该构建体的FRET发射进行进一步测量，结果没有观察到FRET发射强度有明显变化。这些结果被展示于图7C中，该图还包括进了图7B的结果以用于比较。
用单克隆抗GFP抗体和单克隆抗His标签抗体，也观察到了类似的来自传感器的FRET比例下降的趋势，分别如图7E和7F所示。将传感器蛋白结合到目标(本例中，为抗GFP多克隆抗体)上时的FRET比例作为时间的函数，对其进行了进一步测量。如图7D所示，FRET比例的变化儿乎立刻发生，在该系统中于30分钟之后即测到了降低最大值。将FRET比例的改变作为传感器浓度的函数，对其进行检测，显示出了本发明方法的定量性质。对该实验而言，使用固定浓度的多克隆抗-GFP抗体(30nM)作为目标待分析物，在变化的传感器浓度下来测量传感器FRET比例的改变。如图7G所示，在大约30nM处，传感器信号(FRET比例)开始饱和，这正确地显示了目标待分析物(即，多克隆抗-GFP抗体)的浓度。
实施例2 用包含MBP作为分子骨架的传感器构建体对溶液中加上了His 标签的蛋白质进行检测
制造类似于实施例1中的传感器构建体，其中包含重组麦芽糖结合蛋白，该蛋白具有与其N-末端相连的ECFP基团和与其C-末端相连的EYFP基团。但与实施例1不同的是，该融合蛋白不含六-组氨酸标签。ECFP的N末端或EYFP的C末端被突变，以包括进半胱氨酸残基，这允许了与具有硫醇反应活性的次氮基三乙酸(马来酰亚胺-C3-NTA，DoJindo，Gaithersburg，MD)的桥联。桥联的次氮基三乙酸被用于螯合金属离子，例如，镍离子，其随后与加上了组氨酸标签的蛋白结合。或者，可用本领域已知的定点诱变和化学桥联技术，将次氮基三乙酸基偶联到麦芽糖结合蛋白在其N-和C-末端之间的位置上。该传感器可被用于检测包含His标签的蛋白质。
实施例3 用包含卷曲螺旋作为分子骨架的自组装传感器构建体对溶液中 加上了His标签的蛋白质进行检测
按照下文所述来制造包含异二聚卷曲螺旋作为分子骨架的传感器构建体。用本领域已知的重组方法，将E-螺旋(EVSALEK七元序列)通过肽接头偶联到WinZip-A2螺旋上(见，例如，J.Mol.Biol.2000 Jan 21；295(3)：627-39)。E-螺旋的N-末端被突变，以包括进半胱氨酸残基，用于与RET标记进行硫醇偶联。用N-末端半胱氨酸修饰过的K-螺旋(KVSALKE七元序列)是通过化学肽合成或重组方法来制造的，用具有硫醇反应活性的次氮基三乙酸对其进行标记。此外，使用本领域已知的基因融合和重组方法，将E-螺旋(其N-末端被突变，以包括进半胱氨酸残基，用于与RET标记进行硫醇偶联)通过肽接头与WinZip-B1螺旋(见，例如，J.Mol.Biol.2000 Jan 21；295(3)：627-39)偶联。将这三种肽螺旋一起孵育，使得其形成图5A示出的自组装卷曲螺旋传感器构建体。当与加上了His标签的蛋白质结合时，该传感器构建体的FRET性质会有所改变，如图5B所示。
实施例4 包含重组Fv抗体的自组装传感器构建体
通过单独生产两种融合蛋白来制造包含重组Fv抗体片段的传感器构建体(见，例如，J Mol Biol.2001 Sep 7；312(1)：221-8)。第一融合蛋白包含Fv分子的VH部分，其C-末端与接头相连，该接头将其连接到肽螺旋WinZip-A2的N-末端上，形成VH::接头::WinZip-A2。该接头包含有柔性的14个氨基酸的肽，其大约2.4-2.6nm长，由氨基酸Gly、Ser、Thr、Pro构成。第二融合蛋白包含Fv分子的VL部分，其C-末端与接头相连，该接头将其连接到另一种肽螺旋WinZip-B1的N-末端上，形成VL::接头::WinZip-B1。该接头包含有柔性的14个氨基酸的肽，其大约2.4-2.6nm长，由氨基酸Gly、Ser、Thr、Pro构成。
然后用PpL和SPA-E去标记这两种融合蛋白。将加上了六-组氨酸标签的PpL和SPA-E在E.coli中表达，通过固定金属亲和色谱(IMAC)来纯化，再分别用RET供体和RET受体荧光团标记。然后将荧光团标记过的PpL和SPA-E与合适的融合蛋白一起孵育，以允许分别与VL和VH结构域特异性结合。
实施例5  包含单克隆抗体的自组装传感器构建体
按照实施例4中所述来制造荧光团桥联的PpL和SPA-E，用于标记单克隆抗体的VH和VL区域。PpL仅能结合VL的构架区，SPA-E则既能与VH结合，还以较轻的程度与Fc结合。因此SPA-E与Fc的结合亲和力小于能与Fc结合的Streptococcus蛋白质G的B1(SPG-B1)结构域与Fc的结合亲和力，故而首先用单克隆抗体与SPG-B1孵育，封闭掉SPA-E与Fc的结合。然后将用荧光团标记的PpL和SPA-E与抗体一起孵育。
虽然参考某些优选的实施方式，对本发明进行了相当详细的讨论，但是其它实施方式也是可行的。针对本发明的方法公开的步骤并不是限制性的，它们也并不意味着所描述的每一步对于本发明来说都是关键的，实际上，它们仅是示例性的步骤。因此，对本申请文件所含的优选实施方式的描述应不用于对所附的权利要求的范围加以限制。本文提到的所有参考文献都通过引用全部并入本文。

Claims (41)

1.一种方法，用于检测样品中的待分析物，所述方法包括如下步骤：
(a)提供一种传感器构建体，所述传感器构建体包括：
(i)能与所述待分析物特异性结合的分子识别结构域；
(ii)第一标记，包含RET供体；以及
(iii)第二标记，包含针对所述第一标记的所述RET供体的RET受体，所述RET受体与所述RET供体分开使得Frster共振能量转移得以发生的距离，其中，当所述分子识别结构域结合所述待分析物时，所述待分析物与所述RET供体和/或所述RET受体的接近对所述RET供体和所述RET受体之间的FRET相互作用产生干扰；
(b)将所述样品与所述传感器构建体相接触，然后
(c)测量来自所述传感器构建体的光学信号，其中，当检测到对所述RET供体和所述RET受体之间的Frster共振能量转移相互作用的干扰时，则确定所述样品中存在所述待分析物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述RET受体与所述RET供体分开的距离小于大约25纳米。
3.如权利要求2所述的方法，其包含多个RET供体和RET受体。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述RET供体选自荧光蛋白、发光蛋白、非蛋白荧光团、非蛋白化学发光化合物以及荧光纳米晶体的组。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述供体是选自由GFP、EGFP、RFP、BFP、CFP、ECFP、YFP、EYFP和上述物质衍生物所构成的组的荧光蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述RET受体选自由荧光蛋白、发光蛋白、非蛋白荧光团、荧光纳米晶体和猝灭剂所构成的组。
7.如权利要求1所述的方法，还包括如下步骤：
在将所述传感器构建体与所述样品接触之前，对所述传感器构建体的所述RET供体和所述RET受体之间的Frster共振能量转移相互作用产生的对照光学信号加以测量；以及
测定所述对照光学信号与步骤(c)中所述光学信号之间的差异，其中，所述对照光学信号与步骤(c)中所述光学信号之间的差异代表所述样品中所述待分析物的含量。
8.如权利要求7所述的方法，其中，对所述对照光学信号与步骤(c)中所述光学信号之间的差异进行的测定包括：对所述传感器构建体的所述荧光或发光的衰减动力学或强度的变化加以测量。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述传感器构建体包含多肽。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述多肽包含抗体的Fv部分，以及所述分子识别结构域包含所述Fv部分的CDR区域。
11.如权利要求10所述的方法，其中，提供传感器构建体的步骤包含，单独提供包含所述分子识别结构域、所述第一标记和所述第二标记的所述多肽。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述第一标记包含接头，其中包含蛋白质A的E结构域；所述第二标记包含蛋白质L的结合结构域。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述分子识别结构域包含螯合的金属。
14.如权利要求1所述的方法，其中，所述分子识别结构域包含寡核苷酸。
15.用于检测待分析物的传感器构建体，其中包含：
(a)能与所述待分析物的表位特异性结合的分子识别结构域；
(b)第一标记，包含RET供体；以及
(c)第二标记，包含针对所述第一标记的所述RET供体的RET受体，所述RET受体与所述RET供体分开使得Frster共振能量转移得以发生的距离，其中，当所述分子识别结构域结合所述待分析物时，所述待分析物的一部分插入到所述RET受体和所述RET供体之间。
16.如权利要求15所述的传感器构建体，其中，所述传感器构建体包含多肽。
17.如权利要求16所述的传感器构建体，其中，所述传感器构建体包含单链Fv(scFv)，并且其中所述分子识别结构域包含所述scFv的CDR区域。
18.如权利要求17所述的传感器构建体，其中，所述第一标记与所述scFv偶联。
19.如权利要求17所述的传感器构建体，其中，所述第二标记与所述scFv偶联。
20.如权利要求16所述的传感器构建体，其中，所述传感器构建体包含抗体的Fv部分，并且，其中，所述分子识别结构域包含所述Fv部分的CDR区域。
21.如权利要求20所述的传感器构建体，其中，所述第一标记与所述Fv的VH基团偶联，所述第二标记与所述Fv的VL基团连接。
22.如权利要求21所述的传感器构建体，其中，所述第一标记包含蛋白质A的E结构域，所述第二标记包含蛋白质L的结合结构域。
23.如权利要求20所述的传感器构建体，其中，所述第一标记与所述Fv的VL基团相连，所述第二标记与所述Fv的VH基团相连。
24.如权利要求23所述的传感器构建体，其中，所述第一标记包含蛋白质L的结合结构域，所述第二标记包含蛋白质A的E结构域。
25.如权利要求16所述的传感器构建体，其中，所述传感器构建体包含抗体。
26.如权利要求25所述的传感器构建体，其中，所述第一标记包含选自由蛋白质L的结合结构域和蛋白质A的E结构域所组成的组的接头。
27.如权利要求25所述的传感器构建体，其中，所述第二标记包含选自由蛋白质L的结合结构域和蛋白质A的E结构域所组成的组的接头。
28.如权利要求16所述的传感器构建体，其中，所述分子识别结构域包含肽表位。
29.如权利要求15所述的传感器构建体，其中，所述分子识别结构域包含寡核苷酸。
30.如权利要求15所述的传感器构建体，其中，所述第一标记包含所述分子识别结构域。
31.如权利要求15所述的传感器构建体，其中，所述第二标记包含所述分子识别结构域。
32.如权利要求16所述的传感器构建体，其中，所述传感器构建体包含一对异二聚卷曲螺旋多肽。
33.如权利要求32所述的传感器构建体，其中，所述异二聚卷曲螺旋多肽的对选自由WinZip-A2/WinZip-B1和E/K螺旋构成的组。
34.如权利要求16所述的传感器构建体，其中，所述传感器构建体包含周质结合蛋白。
35.如权利要求28所述的传感器构建体，其中，所述周质结合蛋白是麦芽糖结合蛋白。
36.如权利要求16所述的传感器构建体，其中，所述分子识别结构域能与传感器构建体特异性结合。
37.用于检测待分析物的传感器构建体，其中包含：
(a)分子骨架，包含能与所述待分析物特异性结合的分子识别结构域；
(b)第一标记，包含RET供体；以及
(c)第二标记，包含针对所述第一标记的所述RET供体的RET受体，所述RET受体与所述RET供体分开使得Frster共振能量转移得以发生的距离，其中，当所述分子识别结构域结合所述待分析物时，所述待分析物的一部分插入到所述RET受体和所述RET供体之间。
38.如权利要求37所述的传感器构建体，其中，所述传感器构建体包含多肽。
39.如权利要求37所述的传感器构建体，其中，所述分子识别结构域包含螯合的金属。
40.用于制造权利要求20所述的传感器构建体的试剂盒，其中包含作为单独组分的如下物质：
(a)包含抗体Fv部分的多肽；
(b)第一标记，包含RET供体；以及
(c)第二标记，包含针对所述第一标记的所述RET供体的RET受体，
其中，所述第一标记和所述第二标记中的任何一种包含蛋白质A的E结构域，并且其中另一种标记包含蛋白质L的结合结构域。
41.用于制造传感器构建体的试剂盒，其中包含作为单独组分的如下物质：
(a)第一标记，包含RET供体以及第一种异二聚卷曲螺旋多肽；
(b)第二标记，包含针对所述第一标记的所述RET供体的RET受体，以及第二种异二聚卷曲螺旋多肽，其中，所述第一种异二聚卷曲螺旋多肽能与第二种异二聚卷曲螺旋多肽特异性结合；以及
(c)分子骨架，其中包含分子识别结构域，其中，所述分子骨架与接头相连，所述接头能与所述第一标记或所述第二标记特异性结合。
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