JP7461661B2 - 複数の蛍光色素を結合させたペプチドを用いるホモジニアス免疫測定法 - Google Patents
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Description
〔1〕FRETペアを形成し得る二つの蛍光色素又はBRETペアを形成し得る蛍光色素と発光物質を結合させた第一のペプチド、及び第二のペプチドを付加した抗体断片を含む抗原検出用キットであって、1)第一のペプチド及び第二のペプチドは、いずれか一方が正電荷を帯び、他方が負電荷を帯びていること、並びに2)第一のペプチドと第二のペプチドはコイルドコイルを形成し得ることを特徴とする抗原検出用キット。
(1)試料を、〔1〕乃至〔6〕のいずれかに記載のキットと接触させる工程、
(2)第一のペプチドと結合させた蛍光色素の蛍光を検出する工程。
(A)抗原検出用キット
本発明の抗原検出用キットは、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)ペアを形成し得る二つの蛍光色素又はBRET(生物発光共鳴エネルギー移動)ペアを形成し得る蛍光色素と発光物質を結合させた第一のペプチド、及び第二のペプチドを付加した抗体断片を含む抗原検出用キットであって、1)第一のペプチド及び第二のペプチドは、いずれか一方が正電荷を帯び、他方が負電荷を帯びていること、並びに2)第一のペプチドと第二のペプチドはコイルドコイルを形成し得ることを特徴とするものである。
1)蛍光強度を測定しなくても、色の変化により簡易に抗原を検出できる。
2)2色の蛍光ピーク比で抗原を検出できるため、使用するQ-body濃度の誤差による測定誤差を減らすことができる。
3)抗原によるアクセプター色素のクエンチ解除に加えて、アクセプター色素が抗原添加により抗体外に移動し、ドナー色素に近づくことによる抗原依存的なFRET効率の向上により、蛍光応答が向上する。
4)フローサイトメトリーにおいて最もよく使われるが、TAMRAを効率よく励起できない488 nmレーザーを使用できる。
5)血清中でも抗原を検出可能であり、臨床診断分野において有用である。
本発明の抗原の検出方法は、試料中の抗原を検出する方法であって、(1)試料を、上記の抗原検出用キットと接触させる工程、及び(2)第一のペプチドと結合させた蛍光色素の蛍光を検出する工程を含むことを特徴とするものである。
〔実施例1〕 anti-BGP E4-Fab/K2-FITC-K2C-TMRを利用したQ-body
(1)anti-BGP E4-Fabの作製
オステオカルシン(BGP)を認識するFab断片(抗BGP-Fab) (Abe, R et al., Scientific Reports 4, 4640, 2014)の重鎖側のN末端に、E4ペプチド((EIAALEK)4)を付加したペプチド(anti-BGP E4-Fab)をコードするプラスミドベクターを構築し、大腸菌SHuffle T7 express lys Y を用いて、このタンパク質を発現させ、精製した。
K4ペプチド((KIAALKE)4)のN末端から13番目のLysにFITCを導入し、そのC末端にCysを付加したペプチド(K2-FITC-K2C)、およびK4ペプチドのN末端をFITC修飾しそのC末端にCysを付加したペプチド(FITC-K4C)を受託合成により合成した(Lifetein, NJ, USA)。これらのペプチドに、蛍光色素5-TMR-C6-maleimideを反応させ、C末端に付加したCysにTMRを導入した。得られた修飾ペプチドを逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製し、それぞれK2-FITC-K2C-TMR,FITC-K4C-TMRを得た。
(3-1)材料
・anti-BGP E4-Fab
・K2-FITC-K2C-TMR
・PBST (PBS + Tween20 0.1 %)
1.0 μM anti-BGP E4-Fab 2.0 μLと0.97 μM K2-FITC-K2C-TMR 1.3 μLを混合し、遮光して室温で10分間静置した。その後、PBST 250 μLを加えて懸濁し、anti-BGP E4-Fabの濃度を8.0 nM、K2-FITC-K2C-TMRの濃度を5 nMとした。
(4-1)機器
・FP-8500 分光蛍光光度計(日本分光)
・5×5 mm 石英マイクロセル (Starna Scientific, UK)
温度 : 25 ℃
励起バンド幅 : 5 nm
蛍光バンド幅 : 5 nm
レスポンス : 2 sec.
感度 : High
データ取り込み間隔:0.5 nm
走査速度 : 500 nm/min
励起波長 : 485 nm
測定波長 : 510 - 700 nm
光源:キセノンランプ
作製したFRET CQ-body 250 μLを石英セルに加えた。同時に、スターラーをマイクロセルに入れ攪拌させることで、測定中の溶液の均一化を図った。また、別のセルに、8 nM anti-BGP E4-Fab溶液をブランクとして用意した。さらに別のセルに、5 nM K2-FITC-K2C peptide 溶液を用意した。これらのセルを測定装置にセットし、ブランクを測定後、試料測定を行った。その後、抗原として100 μM BGP-C7 2.5 μL (終濃度 1 μM)を添加し、攪拌と静置をそれぞれ5分間実施し、再度試料測定を行った。抗原添加前と添加後のFRET CQ-bodyの蛍光スペクトルを図1に示す。
図1のスペクトルにK2-FITC-K2C peptideのスペクトルを重ね合わせ、FRET CQ-body - BGP、FRET CQ-body + BGP、K2-FITC-K2C peptideのそれぞれのスペクトルについて、 510~525 nmの範囲でのスペクトルのトップにおける蛍光強度値で、全波長範囲における蛍光強度値を除した(規格化、図2)。
オステオカルシン(BGP)を認識するFab断片(抗BGP-Fab)の代わりに、抗がん剤Methotrexate(MTX)を認識するラマ由来重鎖抗体断片VHH(抗MTX-VHH) (Fanning, SW. and Horn,JR. Protein Science 20, 1196-1207, 2011)を用い、他は実施例1と同様にFRET CQ-bodyを作製した。このFRET CQ-bodyの抗原添加前と添加後の蛍光スペクトルを図4に示す。また、実施例1における図2及び図3と同様の処理を行ったスペクトルをそれぞれ図5及び図6に示す。
K4ペプチドのN末端から13番目のLysにFITCを導入する代わりに、N末端にFITCを導入しC末端のCysをTAMRAで修飾したFITC-K4C-TMRを用い、他は実施例1と同様にFRET CQ-bodyを作製した。このFRET CQ-bodyの抗原添加前と添加後の蛍光スペクトルを図7に示す。また、実施例1における図2及び図3と同様の処理を行ったスペクトルをそれぞれ図8及び図9に示す。
オステオカルシン(BGP)を認識するFab断片(抗BGP-Fab)の代わりに、抗がん剤Methotrexate(MTX)を認識するラマ由来重鎖抗体断片VHH(抗MTX-VHH)を用い、FITC-K4C-TMRとモル比8:5となるように混合し、実施例1と同様にFRET CQ-bodyを作製した。このFRET CQ-bodyの抗原添加前と添加後の蛍光スペクトルを図10に示す。また、実施例1における図2及び図3と同様の処理を行ったスペクトルをそれぞれ図11及び図12に示す。
(1)E4付加VHH断片酵母提示用ベクターの作製
溶液中のみならず、酵母細胞表面にE4を付加した抗体断片を提示して蛍光応答を測定し、Q-bodyとしての性能に応じて選択することができれば、性能の高いQ-bodyの選択が可能となると考えられる。そこで実施例2において用いた、MTX認識VHHの下流にBamHI切断部位を持つプラスミドpEQ-VHH(MTX)を鋳型とし、プライマーNheI_E4back (TCAGCTAGCATGGCTGAAATCGCTGC) (配列番号5)およびT7 terminator (ATGCTAGTTATTGCTCAGCGG) (配列番号6)を用いて、常法に従いPCRを行い、末端にNheIとBamHI切断部位を含むE4-VHH(MTX)断片を作製した。またNheI_E4backおよびBamHI_E4for (CGCGGATCCCTGACCGGTGCCTCC) (配列番号7)の2つのプライマーを用いることで、末端にNheIとBamHI切断部位を含むE4断片も作製した。これらと、pYD1に由来する単量体ストレプトアビジン酵母提示用プラスミドpYD1-mSA(Lim et al. Biotechnology and Bioengineering, 2013, 39865,Addgene)のそれぞれについて、NheIおよびBamHIで制限酵素処理を行い、E4-VHH(MTX)あるいはE4のN末端にAga2アンカータンパク質遺伝子が付加された2種類のプラスミドを作製した。プラスミドの部分構造を図13に示す。
作製した2つのplasmidはFrozen-EZ Yeast Transformation II Kit(ZYMO RESEARCH)を用いて製造者の指示に従いEBY100(ATCC(登録商標)MYA-4941TM)に形質転換した。
(3-1)材料
・SD寒天培地(Minimal SD base 26.7 g/L、Dropout (DO) supplement(-Trp,-Ura) 0.72 g/L、2 % d-Glucose、1.5 % Agar、50 μg/ml ampicillin)
・SD液体培地(Minimal SD base 26.7 g/L、DO supplement(-Trp,-Ura) 0.72 g/L、2 % Glucose、100 mM Phosphate buffer pH 6、50 μg/ml ampicillin)
・SG液体培地(Minimal SD base 26.7 g、DO supplement (-Trp,-Ura) 0.72 g、2 % Galactose、100 mM phosphate buffer pH 6、50 μg/ml ampicillin)
上記の形質転換体はSD寒天培地で選択した後、形成したコロニーを10 mlのSD液体培地に加えて、一晩30℃、250 rpmで培養した。翌日OD600を測定し、SD液体培地で希釈してSD液体培地20 ml、OD600を0.2として、OD600が0.4~0.8になるまで培養した。その後、2,500 g、4℃、5 min遠心して、上清を除いたのち、20 mlのSG液体培地を加えて、20℃、250 rpmで48時間培養した。
(4-1)材料
・(3)においてE4を発現させた酵母菌体サンプル
・K4-TAMRAペプチド
・FITC-K4ペプチド
・K2-FITC-K2ペプチド
・FITC-K4-TAMRAペプチド
・K2-FITC-K2-TAMRAペプチド
・BPBS(PBS+0.1 % BSA)
・セルソーター機能付フローサイトメトリー(FACS) SH-800(ソニー社製)
発現誘導後、培養液のOD600を測定し、培養液中の菌体数を推定した(OD600=1を1.0×107個/mlとした)。その後、1.0×107 個の細胞が含まれる培養液を5サンプル分分注し、14000 g、1 min、4 ℃で遠心して上清を取り除き、BPBS 2 mlで洗浄後、再度14000 g、1 min、4 ℃で遠心後、上清を取り除いて50μlとした。そこに実施例1で作製したK4-TAMRA、FITC-K4、K2-FITC-K2、FITC-K4-TAMRA、K2-FITC-K2-TAMRAをそれぞれ最終濃度1μMとなるように加え、さらにBPBS 50μlを加えて100μlとし、氷上で30 min静置した。これを14000 g、1 min、4 ℃で遠心し、上清を取り除いてBPBS 1 mlを加えて攪拌する操作を2回繰り返し、結合していないペプチドを除いた。そしてBPBS 500μlを加えてサンプル溶液とした。
レーザー(488 nm)を使用し、検出器はFSC、BSC、FITC、PE(TAMRA検出用)を使用した。ただし検出器の感度はSH-800のソフトフェアで調整し、それぞれFSC (13)、BSC (37.5%)、FITC (39.5%)、PE (42.5%)とした。
FITCのPE検出器への漏れ込みおよびTAMRAのFITC検出器への漏れ込みを補正するため、K4-TAMRA、FITC-K4、K2-FITC-K2をラベルしたサンプルを用い、SH-800のソフトフェアにしたがって補正を行った。以下の測定及び結果では本結果をもとに補正を行った後の結果を示す。
FITC-K4-TAMRA、K2-FITC-K2-TAMRAでラベルしたサンプルについてFACSによる測定を行い、細胞100,000個についてヒストグラムを作製した(図14-1及び図14-2)。左上のグラフのAで示した細胞集団についてその蛍光強度分布を測定したところ、いずれの細胞においてもTAMRA由来の蛍光(PE-A-Compensated)を、薄い灰色で示したラベルしていないサンプルの蛍光と比較して十分な強度で検出出来る事が判明した。
(5-1)材料
・(3)においてE4-VHH(MTX)を発現させた酵母菌体サンプル
・FITC-K4-TAMRAペプチド
・K2-FITC-K2-TAMRAペプチド
・BPBS
・SH-800(ソニー社製)
発現誘導後、培養液のOD600を測定し、培養液中の菌体数を推定した(OD600=1を1.0×107個/mlとした)。その後、2.0×107 個の細胞が含まれる培養液を2サンプル分分注し、14,000 g、1 min、4℃で遠心して上清を取り除き、BPBS 2 mlで洗浄後、再度14,000 g、1 min、4 ℃で遠心後、上清を取り除いて50μlとした。そこに実施例で作製したFITC-K4-TAMRA、K2-FITC-K2-TAMRAをそれぞれ最終濃度1μMとなるように加え、さらにBPBS 50μlを加えて100μlとし、氷上で30 min静置した。これを14,000 g、1 min、4℃で遠心し、上清を取り除いてBPBS 1 mlを加えて攪拌する操作を2回繰り返して、未反応のペプチドを取り除いた。そしてBPBS 1 mlを加えて攪拌し、これを500μlずつに分けて、片方に抗原としてmethotrexate (MTX)を最終濃度1μMとなるよう加えた。
(4-4)と同じ条件を用いた。
(4-5)と同じ条件を用いた。
FITC-K4-TAMRAでラベルしたサンプルについて、抗原MTXなし(図15-1)とあり(図15-2)の状態でFACSによる測定を行い、細胞100,000個についてヒストグラムを作製した。なお、ラベルしなかったサンプルの蛍光をヒストグラム上に薄い灰色で示した。この結果、抗原なしでは図14-1と比較して低いTAMRA由来の蛍光強度(PE-A-Compensated)が、抗原を加えた場合に顕著に増加する事が明らかとなった。これに対し、FITC由来の蛍光強度は特に変化を示さなかった。
(1)FRET CQ-bodyの作製
(1-1)材料
・anti-BGP E4-Fab(実施例1で使用したものと同じものを使用した。)
・FITC-K4C-TMR(実施例3で使用したものと同じものを使用した。)
・BPBST (PBS + Tween20 0.1 % + BSA 0.1 %)
5.0 μM anti-BGP E4-Fab 2.0 μLと1.7 μM FITC-K4C-TMR 5.8 μLを混合し、BPBST 2.2 μLを加え、それそれの終濃度を1.0 μMとし、遮光して室温で10分間静置した。その後、1.5 mL tubeに反応液5 μLを取り、BPBST 1.0 mLを加えて懸濁し、E4-FabとFITC-K4C-TMRの濃度を5.0 nMとした。
(2-1)機器
実施例1で使用した機器と同じ機器を使用した。
実施例1の条件と同じ条件とした。
まず、石英セルにBPBST 250 μLを用意し、ブランクとして測定した。続いて、作製したFRET CQ-body 250 μLを3本の石英セルにそれぞれ加えた。同時に、スターラーをマイクロセルに入れ攪拌させることで、測定中の溶液の均一化を図った。20分間室温で攪拌した後、抗原0 nMの試料として測定を行った。その後、それぞれのセルに抗原として0.1 μM BGP-C7 2.0 μLを添加した。15分室温で攪拌した後、抗原0.8 nMの試料として測定を行った。以降、同様の手順で、抗原の添加、15分室温で攪拌、試料測定を行い、抗原濃度4.7、12.5、35.7、134 nMの蛍光スペクトル測定の結果を得た(図17)。
3回分の測定結果について、各抗原濃度におけるTAMRAの蛍光ピーク(551 ~ 710 nm区間での最大値)とFluoresceinの蛍光ピーク(510 ~ 550 nm区間での最大値)の比(TAMRA/Fluorescein)をそれぞれ取り、平均値と標準偏差を算出した(n = 3)。次いで、抗原濃度0 nMにおける蛍光ピーク比の値で、全抗原濃度における蛍光ピーク値を除した(規格化)。回帰モデルとして4係数ロジスティック曲線を用いたCurve fittingの結果、EC50 16 nM、Hill係数2.1となった。3σ法により求めた検出限界濃度は2.0 nMであった。得られた回帰曲線の横軸を対数表示にしたグラフを図18に示す。
(1)FRET CQ-bodyの作製
(1-1)材料
・anti-BGP E4-Fab(実施例1で使用したものと同じものを使用した。)
・FITC-K4C-TMR(実施例3で使用したものと同じものを使用した。)
・PBS
・BPBST (PBS + Tween20 0.1 % + BSA 0.1 %)
・HUMAN POOLED SERUM (MP Biomedicals, LLC, Cat# 2931149)
5.0 μM anti-BGP E4-Fab 5.0 μLと1.7 μM FITC-K4C-TMR 13 μLを混合し、BPBST 7.0 μLを加え、それそれの終濃度を1.0 、0.9 μMとし、遮光して室温で10分間静置した。その後、PBSで20 %に希釈したヒト血清 2.5 mLを加えて懸濁し、E4-Fabの濃度を10 nM、FITC-K4C-TMRの濃度を8.8 nMとした。
(2-1)機器
・CLARIOstar (BMG LABTECH)
・Microplate 96 well, PS, Half area, Black, High binding, Sterile (Greiner Bio-One, Cat# 675077)
共通
Gain:1500
Forcal height:8.0 mm
Target value:1%
単波長測定
Ex:541.2 ± 14
Dichroic:562.5
Em:580 ± 13
二波長測定
For FITC
Ex:480 ± 20
Dichroic:502.5
Em:530 ± 30
For TAMRA
Ex:480 ± 20
Dichroic:auto 530
Em:585 ± 30
抗原濃度0 - 500 nM の範囲で8点測定した。1.5 mLのエッペンチューブにFRET CQ-body溶液300 μLと各濃度の抗原1.5 μLをそれぞれ加え、96 Wellプレートに3点(95 μL × 3)ずつ添加した。この時、別のWellに、ブランクとして20 %ヒト血清溶液も同様に添加した。遮光して室温で20分間静置した後、Fluoresceinを励起した場合とTAMRAを励起した場合について試料測定を行った。これと同時に、20 %ヒト血清の代わりにPBSを使用した場合についても同様に試料を調製し、蛍光強度測定を実施した。
Fluoresceinを励起した場合について、全ての測定結果からブランクの値を差し引いた後、各抗原濃度にけるTAMRAの蛍光強度とFluoresceinの蛍光強度の比(TAMRA/Fluorescein)をそれぞれ取り、平均値と標準偏差を算出した(n = 3)。次いで、抗原濃度0 nMにおける蛍光強度比の値で、全抗原濃度における蛍光強度の値を除した(規格化)。回帰モデルとして4係数ロジスティック曲線を用いたCurve fittingを行い、得られた回帰曲線の横軸を対数表示にしたグラフを図19に示した。TAMRAを励起した場合については、全ての測定結果からブランクの値を差し引いた後、平均値と標準偏差を算出し(n = 3)、以降は、Fluoresceinを励起した場合と同様の手順でデータの処理を行った(図20)。その結果、BGP-C7の濃度依存的に蛍光輝度が上昇し、実サンプル中でも抗原の検出が可能であることが示され、臨床診断分野などでのFRET CQ-bodyの有用性が示された。
FRET CQ-bodyは、蛍光ピーク比の変化で抗原を検出できるので、プローブ濃度が変化するような状況でも正確に抗原の定量が可能なはずである。これを示すために、FRET CQ-bodyの濃度が5 nMと10 nMの系について、実施例6と同様の手順で、抗原存在時にTAMRAを励起した場合とFluoresceinを励起した場合の蛍光強度をそれぞれ測定した。その結果、 TAMRAを励起した場合では、FRET CQ-body 10 nMの時の蛍光強度は5 nMの時の蛍光強度の約二倍となり、プローブ濃度の影響を顕著に受ける結果となった(図21)。一方で、Fluoresceinを励起し、TAMRAとFluoresceinの蛍光ピークの比をとった場合では、FRET CQ-body 10 nMと5 nMの時の検量線は一致し、プローブ濃度の影響によらず抗原を検出可能なことが示された(図22)。プローブ濃度が異なる状況でも正確に抗原の検出が可能であることから、生細胞イメージングなどへの応用も期待される。
Claims (7)
- FRETペアを形成し得るアクセプターとなる蛍光色素とドナーとなる蛍光色素又はBRETペアを形成し得るアクセプターとなる蛍光色素とドナーとなる発光物質を結合させた第一のペプチド、及び第二のペプチドを付加した抗体断片を含む抗原検出用キットであって、1)第一のペプチド及び第二のペプチドは、いずれか一方が正電荷を帯び、他方が負電荷を帯びていること、2)第一のペプチドと第二のペプチドはコイルドコイルを形成し得ること、並びに第一のペプチドと第二のペプチドが結合した際、試料中に抗原が存在しない場合、アクセプターとなる蛍光色素が抗体断片の内部に取り込まれ消光し、試料中に抗原が存在する場合、アクセプターとなる蛍光色素が抗体断片の外に移動し、消光が解除されることを特徴とする抗原検出用キット。
- 第一のペプチドがアミノ酸配列:X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(X1及びX6は正電荷を帯びたアミノ酸を表し、X7は負電荷を帯びたアミノ酸を表し、X2及びX5は疎水性アミノ酸を表し、X3及びX4は任意のアミノ酸を表す。)の反復を含み、第二のペプチドがアミノ酸配列:X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14(X8及びX13は負電荷を帯びたアミノ酸を表し、X14は正電荷を帯びたアミノ酸を表し、X9及びX12は疎水性アミノ酸を表し、X10及びX11は任意のアミノ酸を表す。)の反復を含むことを特徴とする請求項1に記載の抗原検出用キット。
- 第一のペプチドがアミノ酸配列:Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gluの反復を含み、第二のペプチドがアミノ酸配列:Glu Ile Ala Ala Leu Glu Lysの反復を含むことを特徴とする請求項1に記載の抗原検出用キット。
- 第一のペプチドが配列番号1に記載のアミノ酸配列からなり、第二のペプチドが配列番号2に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1に記載の抗原検出用キット。
- FRETペアを形成し得るアクセプターとなる蛍光色素とドナーとなる蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素とフルオレセイン系蛍光色素であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載の抗原検出用キット。
- 抗体断片が、Fab又はラクダ属重鎖抗体由来VHHであることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の抗原検出用キット。
- 試料中の抗原を検出する方法であって、以下の工程(1)及び(2)を含むことを特徴とする抗原の検出方法、
(1)試料を、請求項1乃至6のいずれか一項に記載のキットと接触させる工程、
(2)第一のペプチドと結合させた蛍光色素の蛍光を検出する工程。
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---|---|---|---|---|
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JP2007529747A (ja) | 2004-03-17 | 2007-10-25 | ユニバーシティ オブ ハワイ | センサ構造物及び検出方法 |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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JEONG, Hee-Jin,One-pot construction of Quenchbodies using antibody-binding proteins,Analytical Methods,2016年11月21日,8(43),7774-7779 |
LITOWSKI, Jennifer R.,Designing Heterodimeric Two-stranded α-Helical Coiled-coils,The Journal of Biological Chemistry,2002年10月04日,277(40),37272-37279 |
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