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In der Bioanalytik und der darauf beruhenden Diagnostik werden häufig biochemische Bindungsreaktionen genutzt, um chemische Stoffe oder biologische Entitäten nachzuweisen. Die verwendeten Komponenten werden dabei aus biologischem Material aufbereitet und diese in einem Assay so kombiniert, dass am Ende einer Reaktionskette ein sichtbares oder messbares Signal entsteht.
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Als Beispiel seien die viel verwendeten Immunoassays genannt: Antikörper werden aus Tierblut (polyklonale) oder aus Zellkulturen von eigens dafür hergestellten Hybridomazelllinien (monoklonale) isoliert. Bei einem ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) wird ein erster Antikörper an eine Oberfläche geheftet (der Fänger-Antikörper wird irrmobilisiert), die Zielstruktur (Analyt) kann nun binden und ein zweiter Antikörper, der einen Mechanismus zur Signalgenerierung trägt, bindet nun wiederum an den eingefangenen Analyten. Die Markierung besteht beim ELISA aus einem Enzym, dem nun ein Substrat zugegeben wird, das durch die Katalyse des Enzyms so verändert wird, dass eine leicht nachweisbare Komponente entsteht, zum Beispiel durch Verfärbung. Dieses Verfahren bedarf einer Vielzahl von Schritten, die durch eine Person oder aber auch durch einen Automaten ausgeführt werden, in jedem Falle aber ein ausführliches Fluidhandling in zeitlicher Abfolge von Minuten bis Stunden benötigt. Bemühungen, durch vereinfachende Prozessführung sogenannte „homogene Assays”, das sind Assays, die ohne Trennschritte zum Signal führen, aufzubauen, sind bislang an den Nachweis spezieller Substanzen gebunden und nicht Plattform-fähig.
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Vor diesem Hintergrund besteht eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von neuen signalgebenden Molekülen, die in der Lage sind, eine Eindungs- bzw. Erkennungsreaktion mit einem Signal zu verknüpfen, ohne dass Zugabe von Reagenzien, Wasch- oder Spülschritte erforderlich sind. Solche Moleküle könnten in homogenen Assays in Reaktionsgefäßen als Ein-Schritt-Analyse, aber auch in immobilisierter Form in Sensoren (Biosensoren) eingesetzt werden. Sie könnten auch als Signalgeber in Textilien, Folien oder Hygienetüchern für den Gebrauch und in Gegenstände des täglichen Bedarfs direkt integriert werden. Mit solchen durch Sensor-Aktor-Moleküle präparierten Taschentüchern könnte zum Beispiel eine Infektionserkrankung unmittelbar sichtbar gemacht werden und die richtige Therapie sofort angewandt werden.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit der Bereitstellung der Sensor-Aktor-Moleküle nach Anspruch 1 sowie der Bereitstellung von Sensorvorrichtungen nach Anspruch 16 und des Verfahrens nach Anspruch 21 gelöst. Spezielle oder bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der Erfindung sind Gegenstand der weiteren Ansprüche.
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Beschreibung der Erfindung
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Die erfindungsgemäßen Sensor-Aktor-Moleküle nach Anspruch 1 umfassen mindestens zwei Bindungsdomänen, die gleich oder verschieden sein können, welche jeweils an mindestens eine Zielstruktur binden können, sowie ein Rückgratmolekül, an dem diese Bindungsdomänen in einem definierten Abstand fixiert sind, und an dem molekulare oder nanopartikuläre Signalstrukturen so angebracht sind, dass sie sich in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander oder in räumlichen Kontakt befinden, wenn die Bindungsdomänen nicht an ihre Zielstruktur gebunden sind, und räumlich getrennt sind, wenn die Bindungsdomänen an ihre Zielstruktur gebunden sind, oder umgekehrt die Signalstrukturen räumlich getrennt sind, wenn die Bindungsdomänen nicht an ihre Zielstrukturen gebunden sind, und sich in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander oder in Kontakt befinden, wenn die Bindungsdomänen an ihre Zielstruktur gebunden sind, welche Signalstrukturen eine physikalische Eigenschaft aufweisen, die sich durch Änderung des räumlichen Abstands der Signalstrukturen nachweisbar verändert, so dass bei einem Übergang von räumlicher Nähe oder Kontakt der Signalstrukturen zu Trennung der Signalstrukturen oder umgekehrt ein Signal entsteht. Auf diese Weise wird ein Bindungsereignis unmittelbar in ein Signal überführt, so dass weitere Prozessschritte nicht erforderlich sind.
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Vorzugsweise sind die verwendeten Bindungsdomänen vollständige Biomoleküle oder Teile von Biomolekülen. Derartige Biomoleküle bzw. Teile von Biomolekülen können natürlich vorkommende Biomoleküle sein oder von natürlichen Biomolekülen abgeleitet sein. Solche Modifikationen oder Derivate von Biomoekülen können ganz oder teilweise synthetisch hergestellt sein, wobei eine teilweise synthetische Herstellung auch die Anwendung gentechnischer Verfahren einschließen kann.
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In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung sind die Bindungsdomänen Peptide. Geeignete Peptide sind beispielsweise Peptide, die Paratope von Antikörpern darstellen oder davon abgeleitet sind, Fab-Fragmente von Antikörpern, Peptide, welche aus Rezeptoren ermittelt oder gewonnen wurden, und andere an gewünschte Zielstrukturen, wie z. B. Oberflächenstrukturen oder Komponenten von Bakterien oder Viren, bindende Peptide. Solche bindenden Peptide können beispielsweise mit Hilfe von kombinatorischen oder evolutiven in vitro-Screening-Verfahren, z. B. mittels Phagen-Display, in Gegenwart der Zielstrukturen identifiziert und erfindungsgemäß eingesetzt werden.
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Die Bindungsdomänen von Antikörpern befinden sich als variable Bereiche an den Enden der schweren und leichten Ketten der Polypeptide. Die bindenden Bereiche werden auch als Paratope bezeichnet. Diese Paratope oder daraus abgeleitete antigenbindende Peptide können nach bekannten Verfahren identifiziert und dann isoliert bzw. synthetisiert werden. Für viele Antigene sind die Paratope auch bereits bekannt oder sogar kommerziell erhältlich.
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Spezieller sind die Bindungsdomänen Peptide, die von Antikörpern gegen Viren, insbesondere Influenzaviren, oder deren Oberflächen-determinanten bzw. Ausschnitten davon abgeleitet sind, oder andere Peptide, die an Oberflächenstrukturen oder Komponenten von Viren, insbesondere Influenzaviren, binden können.
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In einer weiteren speziellen Ausführungsform handelt es sich bei den Bindungsdomänen um Peptide, die aus der Sequenz von an die (bakterielle) Wirtszelle bindenden Proteinen von Bakteriophagen abgeleitet sind. Ein spezielles Beispiel dafür sind Peptide, die aus der Sequenz des Tailspike-Proteins oder von Mutanten des Tailspike-Proteins des Phagen P22 abgeleitet sind und an die O-Antigenpolysaccharide auf der Zelloberfläche von pathogenen Salmonella enterica-Serovarianten (Serovare Typhi, Paratyphi, Typhimurium, Enteriditis) binden. Damit können pathogene Salmonella-Stämme nachgewiesen werden. Analoge Bindungsproteine, z. B. von anderen bekannten Phagen, aber nicht darauf beschränkt, ermöglichen den Nachweis von Norovirus, Methicillinresistenten Staphylococcus aureus (MRSA), Camphylobacter jejuni und anderen Mikroorganismen, insbesondere pathogenen Erregern.
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In einer anderen speziellen Ausführungsform sind die Bindungsdomänen Glycanstrukturen oder eine Mischung von Glycanstrukturen und Peptiden. Ein konkretes Beispiel für Glycan-Bindungsdomänen bilden die Sialinsäurerezeptoren von menschlichen Zellen bzw. synthetischen Nachbildungen davon, die an das Hämagglutinin von Influenzaviren binden.
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In einer weiteren speziellen Ausführungsform sind die Bindungsdomänen Lektine oder Teile von Lektinen.
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Als Rückgratmolekül kommt grundsätzlich jedes Molekül mit einer Struktur in Betracht, an welche die gewünschten Bindungsdomänen in einem definierten Abstand sowie die gewünschten Signalstrukturen gekoppelt werden können.
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In einer speziellen Ausführungsform ist das Rückgratmolekül eine Nukleinsäure, insbesondere eine Desoxyribonukleinsäure, Ribonukleinsäure, Peptidnukleinsäure (PNA), eine Locked Nukleinsäure (LNA) oder ein Derivat davon. Das Nukleinsäure-Rückgratmolekül weist eine Länge von mindestens 25, vorzugsweise mindestens 30, bevorzugter mindestens 50 oder mindestens 75 Nukleotiden auf.
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In einer anderen speziellen Ausführungsform ist das Rückgratmolekül ein Polymer, dessen Hauptkette oder Nebenkette in der Lage ist, an den Enden oder in Teilbereichen mit sich selbst eine nicht-kovalente Bindung einzugehen, die durch Strukturveränderung des Polymers aufgebrochen werden kann. Bei diesem Rückgratmolekül kann es sich beispielsweise um ein Peptid oder Polymer, dessen Monomere Wasserstoffbrücken ausbilden können, handeln.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Rückgratmolekül eine einzelsträngige Nukleinsäure, deren Enden mit sich selbst hybridisieren.
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Die Kopplung der Bindungsdomänen an ein Nukleinsäure-Rückgratmolekül oder anderes Rückgratmolekül geschieht nach grundsätzlich bekannten Verfahren in Abhängigkeit von der chemischen Natur der Bindungsdomänen und des Rückgratmoleküls.
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Bei Verwendung eines Nukleinsäure-Rückgratmoleküls werden die Bindungsdomänen vorzugsweise an Oligonukleotide gebunden, welche zu bestimmten Bereichen des Nukleinsäure-Rückgratmoleküls komplementär sind und daher damit hybridisieren. In einer spezielleren Ausführungsform werden Peptid-Bindungsdomänen an Oligonukleotide gebunden. Die Kopplung dieser Peptid-Bindungsdomänen an die Oligonukleotide erfolgt nach bekannten Verfahren, beispielsweise wie in Harrison et al, Nucleic Acids Research 26, (13) 3136–3145 (1998), Venkatesan and Kim, Chemical Reviews 106 (9) 3712–3761 (2006), oder Lu et al., Bioconjugate Chemistry 21 (2), 187–202, beschrieben.
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Als Signalstrukturen sind grundsätzlich alle molekularen oder partikulären Strukturen geeignet, bei denen sich eine physikalisch leicht erfassbare Eigenschaft in Abhängigkeit vom räumlichen Abstand zweier oder mehrerer Elemente nachweisbar ändert. Diese physkalische Eigenschaft kann beispielsweise die Emission oder Absorption von elektromagnetischer Strahlung, z. B. Licht, insbesondere Fluoreszenzstrahlung, Leitfähigkeit, Brechungsindex, Viskosität, Schermodul bzw. eine Anisotropie einer dieser Größen sein.
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In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Signalstrukturen Fluorochrome, insbesondere organische Fluorophore oder Quantendots.
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Spezieller wird als Fluorochrom ein molekulares Energietransferpaar verwendet, das zum Beispiel ein Fluoreszenzdonor und ein -Akzeptormolekül sein kann (Förster-Energie-Transfer, oder Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer, FRET). Bei der Anregung des Fluoreszenzdonors wird dieser keine Fluoreszenzstrahlung emittieren, da die Energie direkt an den Akzeptor übertragen wird. Dieser kann die Energie bei längerer Wellenlänge (Rotshift) oder aber auch nicht strahlend abgeben. Die Bindungsdomänen sind beispielsweise so an der Rückgratstruktur verteilt, dass bei einem Bindungsereignis Donor und Akzeptor getrennt werden und somit die Fluoreszenz des Donormoleküls frei abgestrahlt wird. Damit wird durch das Bindungsereignis unmittelbar ein Signal ausgelöst. Neben FRET können auch alle strahlungsfreien Energietransferreaktionen, beispielsweise nach dem Mechanismus des „statischen Quenching” (z. B. wie bei Molecular Beacons bekannt), erfindungsgemäß genutzt werden.
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Als FRET-Donor-Akzeptor-Paare können grundsätzlich alle im Stand der Technik bekannten FRET-Paare, insbesondere alle für die Markierung von Nukleinsäuren und Oligonukleotid-Sonden bekannten FRET-Paare verwendet werden. Einige geeignete, nicht beschränkende Beispiele sind Fluorescein/Rhodamin, Cyanin 3/Cyanin 5, Fluorescein/Cy3, sowie ferner 6-FAM (6-Carboxcyfluorescein)/BHQ-1 (BlackHole® Quencher, Biosearch Technologies, Cy3/BHQ-2, Cy5 BHQ-3, Cy5/BlackBerryTM Quencher 659 (Berry Associates, Inc.), bei denen die Quencher nicht selbst fluoreszieren (als sog. „dark quencher” bezeichnet). Auch Goldnanopartikel können als effiziente Quencher eingesetzt werden.
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Eine Übersicht über weitere Donor/Akzeptor-Paare ist beispielsweise in B. V. van der Meer et al. „Resonance Energy Transfer", Wiley VCH, Weinheim, 1994, oder in „Molecular Probes", Eugene, Oregon, USA, Handbook of Fluoresecent Probes and Research Products, 2002, zu finden.
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Statt herkömmlicher Fluorophore können auch Quantendots als Signalstrukturen verwendet werden. Quantendots sind Nanokristalle aus Halbleitermaterialien und umfassen typischerweise nur 10 bis 50 Atome. Quantendots haben häufig sehr günstige Fluoreszenzeigenschaften wie hohe Quantenausbeute, eine schmale symmetrische Emissionsbande, eine breit Absorptionsbande und eine hohe Photostabilität. Es ist auch relativ einfach, Quantendots unterschiedlicher Größe und damit unterschiedlicher Emissionswellenlänge aber gleicher Absorptionswellenlänge über Pyrolysereaktionen von organometallischen Verbindungen zu synthetisieren. Quantendots können beispielsweise nach bekannten Verfahren aus üblichen Halbleitermaterialien wie Cdse, GaAs, InP etc. hergestellt werden.
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Von besonderem Interesse sind CdSe-Qantendots, denn sie emittieren zwischen etwa 480–650 nm und damit im sichtbaren Bereich des Spektrums. Zur Erhöhung der photochemischen Stabilität kann man CdSe-Kerne mit einer mindestens einlagigen ZnS-Schicht umgeben und dann mit weiteren Ummantelungen, z. B. auf der Basis von Mizellen oder Polymerhüllen, chemisch modifizieren und an Biomoleküle oder andere Substrate binden. Analoge Verfahren sind auch auf Quantendots aus anderen Materialien anwendbar. Quantendots können herkömmliche Fluoreszenzfarbstoffe auf vielen Gebieten ersetzen und wurden beispielsweise auch schon als Fluoreszenzmarker, insbesondere auch in FRET-Vefahren, an Nukleinsäuren (z. B. an Thiol-ss-DNA über eine Metall-Thiol-Bindung) gekoppelt (vgl. z. B. Algar und Krull in Anal. Chem 2009, 81, (15), S. 6562).
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Alternativ kann das Signal auch durch Trennung von Nanopartikeln erfolgen, bei denen durch räumliche Separation während des Bindungsvorganges z. B. eine Farbänderung oder eine andere nachweisbare Änderung einer physikalischen Eigenschaft stattfindet. In diesem Falle können die als Donor und Akzeptor bezeichneten Moleküle bzw. Partikel auch identisch sein. Beispielsweise haben Goldnanopartikel die Eigenschaft, durch Verdichtung (z. B. bei Koagulation oder Aggregation) ihre Farbe zu ändern.
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In einer speziellen Ausführungsform sind die Signalstrukturen an die Enden des Rückgratmoleküls gekoppelt.
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Die erfindungsgemäßen Sensor-Aktor-Moleküle bieten breite Anwendungsmöglichkeiten auf den Gebieten der Sensortechnik, Bioanalytik, Medizin, Hygienetechnik, Umwelt- und Lebensmittelüberwachung.
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Dementsprechend betrift ein Aspekt der vorliegenden Erfindung Sensorvorrichtungen, welche diese Sensor-Aktor-Moleküle umfassen.
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In einer speziellen Ausführungsform einer solchen Sensorvorrichtung liegen die Sensor-Aktor-Moleküle an einer Substratoberfläche immobilisiert vor.
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Diese Substratoberfläche kann beispielsweise die Oberfläche eines Biosensors, eine Textilfaser oder ein flächiges Textilgebilde, eine Polymerfolie oder Hygienetuch auf der Basis von Papier bzw. einer Faser, insbesondere Zellstoff, sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
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In einer anderen speziellen Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße Vorrichtung, insbesondere Sensorvorrichtung, die Sensor-Aktor-Moleküle gekoppelt mit Elektroden.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vesikel oder Mizellen, welche die erfindungsgemäßen Sensor-Aktor-Moleküle enthalten. Dabei werden die Sensor-Aktor-Moleküle vorzugsweise mit den Bindungsdomänen nach aussen weisend in die Oberflächen (Membran) von Vesikeln oder Mizellen eingebracht, so dass die durch Bindung der Zielstruktur ausgelöste Aktion, z. B. Trennung eines teilweise doppelsträngigen Nukleinsäure-Moleküls, die teilweise oder vollständige Öffnung oder Auflösung des Partikels einleitet. Damit wird eine gezielte und gerichtete Freisetzung von Wirkstoffen und/oder Signalsubsubstanzen aus diesen Vesikeln oder Mizellen ermöglicht.
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Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit oder Menge einer Zielstruktur in einer Probe, welches das Kontaktieren der erfindungsgemäßen Sensor-Aktor-Moleküle mit der Probe, wobei sich im Falle der Bindung der Zielstruktur eine physikalisch erfassbare Eigenschaft der Signalstrukturen ändert und somit unmittelbar ein Signal erzeugt wird, sowie das Erfassen und Auswerten des gegebenenfalls erzeugten Signals umfasst.
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In einer typischen Ausführungsform dieses Verfahrens befinden sich die Signalstrukturen in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander oder in räumlichem Kontakt, wenn die Bindungsdomänen nicht an ihre Zielstruktur gebunden sind, und die Bindung der Bindungsdomänen an ihre Zielstruktur bewirkt eine räumliche Trennung der Signalstrukturen, welche mit der Änderung einer physikalisch erfassbaren Eigenschaft der Signalstrukturen verbunden ist.
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Umgekehrt können die Signalstrukturen auch räumlich getrennt sein, wenn die Bindungsdomänen nicht an ihre Zielstrukturen gebunden sind, und sich in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander oder in Kontakt befinden, wenn die Bindungsdomänen an ihre Zielstruktur gebunden sind, und die Bindung der Bindungsdomänen an ihre Zielstruktur bewirkt dann eine Aufhebung der räumlichen Trennung der Signalstrukturen, welche Änderung mit der Änderung einer physikalisch erfassbaren Eigenschaft der Signalstrukturen verbunden ist.
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Das folgende Beispiel dient zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese jedoch darauf zu beschränken.
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BEISPIEL
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Als Rückgratstruktur wird ein einzelsträngiges DNA- oder RNA-Molekül von mindestens 30 Nukleotiden verwendet. An die Enden des einzelsträngigen Moleküls werden jeweils ein Donor und ein Akzeptormolekül eines FRET-Paares (5': 6-FAM (6-Carboxyfluorescein, 3': BHQ-1 (BlackHole® Quencher, Biosearch Technologies) gekoppelt. Die Kopplung wird nach bekannten Standardverfahren durchgeführt, beispielsweise wie von Tyagi et al. in Nature Biotechnology 14 (3), 303–308 (1996) beschrieben. Der Einzelstrang ist so konstruiert, dass die Sequenz ausschließlich am Ende selbstkomplementär ist, d. h. in unmittelbarer Nachbarschaft der Donor- und Akzeptor-Moleküle bildet sich ein Doppelstrang aus, der diese beiden Moleküle räumlich so nah zusammenbringt, dass Energietransfer stattfindet und die Fluoreszenz des Donormoleküls unterdrückt ist. Die übrige Sequenz ist nicht selbstkomplementär und bildet mit sich selbst keine weitere Hybridisierung aus, sondern eine einzelsträngige Schleife. An diese Schleife werden mindestens zwei Oligonukleotide hybridisiert. Die Oligonukleotide tragen an ihrem Ende Bindungsdomänen, die gegen den Analyten gerichtet sind, d. h. an diesen andocken bzw. diesen binden können. Diese Bindungsdomänen sind gegen Bereiche des Analyten gerichtet, die auf dem Analyten räumlich getrennt vorliegen. Als Bindungsdomänen werden beispielsweise Peptide verwendet, die an die Hämagglutinin- oder Neuraminidase-Oberflächenproteine eines Influenzavirus binden können. Die Peptide bzw. Bindungsdomänen können verschieden oder identisch sein, da diese Oberflächenbereiche beide mehrfach auf dem Virus vorkommen. Binden nun die Peptide an die Ziel-Oberflächenbereiche des Virus, so wird das schwächer gekoppelte Ende des Nukleotidstranges aufgerissen und die Donor- und Akzeptormoleküle getrennt. Fluoreszenz des Donors tritt auf und kann nachgewiesen werden.
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Die Bindungsdomänen werden zum Beispiel aus Antikörpern gegen ein Influenzavirus gewonnen. Die Bindungsdomänen der Antikörper befinden sich als variable Bereiche an den Enden der schweren und leichten Ketten der Polypeptide. Die bindenden Bereiche werden auch als Paratope bezeichnet. Diese Paratope oder daraus abgeleitete antigenbindende Peptide werden isoliert bzw. synthetisiert und als Peptide an Oligonukleotide gekoppelt. Es entstehen neue Bindungsstrukturen, welche die bindenden Bereiche der Antikörper enthalten. Die Kopplung dieser Peptid-Bindungsdomänen an die jeweiligen Oligonukleotide erfolgt nach bekannten Verfahren, beispielsweise wie von Lu et al. (oben) oder Chaudri et al. (FEBS Letters 450 (1–2), 23–26 (1999)) beschrieben.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Harrison et al, Nucleic Acids Research 26, (13) 3136–3145 (1998) [0018]
- Venkatesan and Kim, Chemical Reviews 106 (9) 3712–3761 (2006) [0018]
- Lu et al., Bioconjugate Chemistry 21 (2), 187–202 [0018]
- B. V. van der Meer et al. „Resonance Energy Transfer”, Wiley VCH, Weinheim, 1994 [0023]
- „Molecular Probes”, Eugene, Oregon, USA, Handbook of Fluoresecent Probes and Research Products, 2002 [0023]
- Algar und Krull in Anal. Chem 2009, 81, (15), S. 6562 [0025]
- Tyagi et al. in Nature Biotechnology 14 (3), 303–308 (1996) [0038]
- Lu et al. (oben) oder Chaudri et al. (FEBS Letters 450 (1–2), 23–26 (1999)) [0039]