CN114324279B - 伏马毒素b1的检测方法及生物传感器、试剂盒的制备方法及其应用 - Google Patents

伏马毒素b1的检测方法及生物传感器、试剂盒的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于检测伏马毒素B1的生物传感器，由上转换纳米材料和氧化石墨烯组成；还提供用于检测伏马毒素B1的试剂盒，由所述生物传感器和FB1标准品组成；还提供所述生物传感器和试剂盒的制备方法及应用。同时，还提供伏马毒素B1的检测方法，根据标准曲线计算待测样品中FB1的浓度；还包括磁性微球上连接FB1适配体及其互补DNA(cDNA)、由cDNA引发的催化发夹自组装扩增、ssDNA‑UCNPs连接扩增产物、氧化石墨烯淬灭UCNPs的荧光。优选检测待测样品时采用所述生物传感器或所述试剂盒。本发明提供了一种高效、灵敏、便捷的上转换荧光适配体传感技术以检测食品中微量的FB1，同时验证了核酸信号放大策略可高效应用于食品安全检测领域。

Description

伏马毒素B1的检测方法及生物传感器、试剂盒的制备方法及 其应用
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体讲，涉及用于检测伏马毒素 B1的生物传感器、试剂盒及其制备方法和应用及伏马毒素B1的检测方法。
背景技术
真菌毒素是真菌在适宜的温湿度条件下，产生的具有致病性和致死性的次级代谢产物，每年全世界的粮食产量约有1/4受真菌毒素污染，直接经济损失达上千亿美元。真菌毒素可以产生于粮食作物生长的每一时期，在仓储以及加工期内都有一定的污染风险。其中，由串珠镰刀菌(F.moniliforme)和再育镰刀菌(F.proliferatum)等镰刀菌产生的伏马毒素(Fumonisin，FB)是玉米、小麦、燕麦及其制品中标志性的真菌毒素，其中伏马毒素B1(FB1)被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)列为对人类可能的致癌物质(Group 2B)，一些研究发现人类食管癌患病率与该区域内作物所含的FB1存在密不可分的联系。
在人类生产生活中，发生FB1污染的概率比较大，并且FB1具有结合其他真菌毒素的能力，进一步扩大了对人体的危害。因此，对食品中FB1进行高灵敏检测，是一个亟待深入解决的问题。传统的FB1 定量分析方法包括LC-MS、HPLC-FLD和ELISA，这些方法具有很高的灵敏度，但也存在一定的缺陷，如需要昂贵的仪器、复杂的前处理以及繁琐的操作，限制了在实际检测中的应用。
公开号为CN113092766A的中国发明专利申请提供了一种多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用。试剂盒包括：分别偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒、分别偶联有待测真菌毒素抗体的磁性纳米颗粒、真菌毒素的标准品溶液；待测真菌毒素至少包括玉米赤霉烯酮和伏马毒素B1。但是其仍然存在灵敏度低的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术中灵敏度低的技术问题，本发明提供用于检测伏马毒素B1的生物传感器、试剂盒及其制备方法和应用及伏马毒素B1的检测方法。本发明可高效、灵敏、便捷的检测食品中微量的FB1。
第一方面，本发明提供用于检测伏马毒素B1的生物传感器，由上转换纳米材料(UCNPs)和氧化石墨烯(GO)组成。
优选的是，所述上转换纳米材料选自纳米颗粒。
上述任一方案优选的是，所述上转换纳米材料粒径为25-30nm。
上述任一方案优选的是，所述生物传感器制成或包装成试剂盒。
第二方面，本发明提供用于检测伏马毒素B1的试剂盒，由所述生物传感器和FB1标准品组成。
优选的是，所述标准品为一系列浓度梯度的标准品溶液。
上述任一方案优选的是，所述标准品浓度为0.032-500ng/mL。
上述任一方案优选的是，所述标准品浓度为0.032、0.16、0.8、 4、20、100、500ng/mL。
第三方面，本发明提供所述生物传感器或试剂盒的制备方法：
步骤一，合成磁性微球并对其进行表面修饰；
步骤二，合成上转换纳米材料并对其进行表面修饰；
步骤三，进行分装、包装和/或保存。
第四方面，本发明提供所述生物传感器在食品中FB1的检测的应用。
优选地，所述食品包括但不限于玉米、燕麦及其制品。
第五方面，本发明提供伏马毒素B1的检测方法，根据标准曲线计算待测样品中FB1的浓度；还包括磁性微球上连接FB1适配体及其互补DNA(cDNA)、由cDNA引发的催化发夹自组装扩增、ssDNA-UCNPs 连接扩增产物、氧化石墨烯淬灭UCNPs的荧光。
优选的是，检测待测样品时采用第一方面所述生物传感器或第二方面所述试剂盒。
上述任一方案优选的是，所述检测方法步骤如下：
步骤(1)：将适配体和cDNA连接到磁性微球表面，然后适配体与目标物FB1进行特异性结合，通过磁分离富集得到cDNA，cDNA作为引发链与发夹H1、H2进行杂交，发生催化发夹自组装反应，得到H1-H2 的dsDNA扩增产物；
步骤(2)：氨基化的ssDNA偶联在UCNPs表面，得到ssDNA-UCNPs；
步骤(3)：ssDNA-UCNPs与步骤(1)中得到的H1-H2的dsDNA扩增产物进行结合；
步骤(4)：向体系中加入氧化石墨烯溶液，结合了扩增产物的UCNPs 不会被氧化石墨烯淬灭荧光，通过荧光响应实现对目标物FB1的灵敏检测。
上述任一方案优选的是，步骤(1)具体操作为：将链霉亲和素修饰的MMPs与生物素化的FB1适配体进行孵育，得到Apt-MMPs溶液；然后取Apt-MMPs溶液与过量cDNA进行杂交，磁分离后得到cDNA-Apt-MMPs，重悬于PBS缓冲液；然后，将不同浓度的FB1标准品(100μL)分别与cDNA-Apt-MMPs溶液于37℃反应0.5h；随后进行磁分离得到上清液，得到富集的cDNA，与发夹H1、发夹H2混合进行杂交1h，得到dsDNA；
上述任一方案优选的是，步骤(2)具体操作为：PEI-UCNPs与戊二醛溶液于室温下震荡反应，离心，用PBS缓冲液洗涤两次后重悬于PBS缓冲液中；加入氨基化的ssDNA，缓慢震荡，离心，洗涤，重悬于PBS缓冲液中得到ssDNA-UCNPs；
上述任一方案优选的是，步骤(3)具体操作为：将ssDNA-UCNPs 与dsDNA在37℃下结合1h；
上述任一方案优选的是，步骤(4)具体操作为：立即加入GO，然后在980nm激发光下测量体系的荧光强度值，选择546nm处的发射峰作为定量标准。
本发明提供了一种高效、灵敏、便捷的上转换荧光适配体传感技术以检测食品中微量的FB1，同时验证了核酸信号放大策略可高效应用于食品安全检测领域。UCNPs荧光寿命长，化学稳定性好，无背景信号干扰，是进行信号输出的优良载体。本发明首次将CHA策略应用于UCNPs-GO传感体系，巧妙地利用GO对于不同结构DNA的作用力，通过荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer， FRET)作用极大地提升了UCNPs-GO体系的检测能力，并且可进一步通过合成新的UCNPs材料、替换适配体与设计CHA结构以实现高通量、多用途、全场景检测，在未来食品检测、环境监测、临床诊断等领域具有广阔的潜在应用价值。
附图说明
图1是建立的标准曲线。
图2是不同FB1浓度下的UCNPs-GO的线性拟合曲线图。
图3是MMPs与适配体反应后上清液的DNA浓度与适配体添加量关系图。
图4是MMPs与适配体反应后上清液的DNA浓度与反应时间的关系图。
图5是UCNPs与CHA扩增产物结合的时间影响图。
图6是GO的含量对UCNPs的淬灭影响图。
图7是生物传感器的特异性研究，各物质的浓度均为100ng/mL。
图8是基于催化发夹自组装的上转换-氧化石墨烯荧光共振能量转移生物传感器高灵敏检测伏马毒素B1的原理示意图。
具体实施方式
为了更加正确、清楚地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图进行进一步的说明、解释。
试剂和仪器：实验所用水均为超纯水(Milli–Q,18MΩcm, Millipore)。YCl·6H2O，YbCl·6H2O，ErCl3·6H2O，FeCl3·6H2O， CH3COONa，Na3C6H5O7，油酸(OA)，1-十八烯(ODE)，聚乙烯亚胺(PEI)购自上海易恩化学技术有限公司，均为分析纯。氟化铵，乙二醇，氢氧化钠，甲醇，环己烷购自麦克林生化科技有限公司，均为分析纯。戊二醛(50％)购自阿拉丁生化科技有限公司。链霉亲和素购自上海源叶生物科技有限公司。PBS缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司。FB1 标准品，玉米赤霉烯酮(ZEN)标准品，T-2毒素(T-2)标准品，赭曲霉毒素A(OTA)标准品，黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品，黄曲霉毒素 M1(AFM1)标准品，黄曲霉毒素M2(AFM2)标准品购自山东绿都生物科技有限公司。所有DNA序列由上海生工生物有限公司合成并经高效液相色谱纯化。
以下实施例用到的样品均为进口的玉米粉、燕麦粉、婴幼儿玉米辅食，购自淘宝网站。样品处理方法为：将1g实际样品与10mL含有不同浓度(最终浓度为0.1、1、10ng/mL)的FB1的提取溶剂(乙腈：水，1：1(v:v))均匀混合，13000rpm离心后保留上清液，然后取上清液(10μL)与PBS缓冲液(990μL)均匀混合进行检测。
实施例1
一方面，本实施例提供用于检测进口玉米粉中的FB1的生物传感器，其由上转换纳米材料和氧化石墨烯组成，本实施例中所述上转换纳米材料为NaYF4:Yb,Er。
磁性微球(MMPs)的合成：将1.3g FeCl3·6H2O与3.5g CH3COONa 混合于40mL乙二醇中，接着加入2.4g Na3C6H5O7，机械搅拌0.5h，然后密封在50mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜内。将高压釜于 210℃持续15h，然后冷却至室温。将产物用乙醇洗涤3次后于60℃干燥8h，得到羧基化磁性微球。
磁性微球的表面修饰：将羧基化磁性微球(500μL，10mg/mL) 经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(C8H17N3，EDC)(50μL， 50mg/mL，pH5.0)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(50μL，50mg/mL， pH5.0)活化0.5h后，与链霉亲和素(200μL，1mg/mL)在室温下震荡混合2h，反应结束后用PBS缓冲液清洗三次，得到链霉亲和素修饰的MMPs。
UCNPs的合成：通过溶剂热法合成UCNPs，将1mmolRECl3·6H2O (Y:Yb:Er＝80:18:2),9mLOA，15mLODE置入100mL三口瓶中，加热至120℃进行真空脱气除水，待降至室温后逐滴加入10mL溶有4 mmoL NH4F和2.5mmoL NaOH的甲醇，于20℃下搅拌0.5h。将溶液加热至120℃进行冷凝回流除去甲醇，最终在氮气环境下升温至320℃持续1.5h，待降至室温后加入乙醇进行沉淀，于13000rpm条件下离心，得到的沉淀用环己烷清洗三次后于60℃真空干燥过夜，得到粒径为25-30nm的UCNPs。
UCNPs的表面修饰：通过配体交换法对UCNPs进行表面修饰，将300mg聚乙烯亚胺溶于5mL超纯水中，再加入2mg/mL UCNPs溶液 10mL(溶剂为环己烷)，机械搅拌24h，于12000rpm条件下离心，收集沉淀，并用乙醇多次清洗，冷冻干燥后得到PEI-UCNPs。
本实施例中，提供试剂盒的形式，由上述上转换纳米材料和氧化石墨烯，还有伏马毒素B1标准品。其中伏马毒素B1标准品浓度为 0.032-500ng/mL(具体为0.032、0.16、0.8、4、20、100、500ng/mL)。
所述UCNPs-GO生物传感器用于检测FB1，具体方法如下：
(一)标准曲线的建立
为了建立标准曲线，我们分别检测了不同浓度(0.032、0.16、 0.8、4、20、100、500ng/mL)的FB1的荧光信号响应值。如图1所示，在0.032-500ng/mL的范围内，FB1浓度与UCNPs的荧光强度呈良好的线性关系，图2显示线性方程拟合的结果为 F＝163.8849lgC+405.5395(R2＝0.9971)，检测限为0.0457ng/mL (S/N＝3)。与未使用信号扩增方式(如Wu等(dx.doi.org/10.1021/ac301534w|Anal.Chem.2012,84,6263 -6270)提供的技术方案。)比较，直接利用UCNPs-Apt-GO体系检测 FB1，检测灵敏度要高出一个数量级，检测范围更广；比公开号为 CN113092766A的中国发明专利申请中公开的技术方案的最低限也更低，灵敏度更高。
(二)待检样品检测
将链霉亲和素修饰的MMPs(100μL,10mg/mL)与生物素化的 FB1适配体(Aptamer，简称Apt，Biotin-(CH2)6-序列1，210pmol) 在37℃下孵育2h，得到Apt-MMPs溶液。然后取200μL的Apt-MMPs 溶液与过量cDNA(序列2)在37℃下杂交1h，磁分离后得到 cDNA-Apt-MMPs，重悬于PBS缓冲液(200μL)。然后，将不同浓度的FB1标准品(100μL)分别与cDNA-Apt-MMPs溶液于37℃反应0.5 h。随后进行磁分离得到上清液(180μL)，得到富集的cDNA，与H1 (序列3，10μL，10μM)，H2(序列4，10μL，10μM)混合，于37℃下杂交1h，得到dsDNA。
将PEI-UCNPs(200μL，2mg/mL)与25％戊二醛溶液(100μL) 于室温下震荡反应2h，离心，用PBS缓冲液洗涤两次后重悬于PBS 缓冲液中(180μL)。加入氨基化的ssDNA(NH2-(CH2)6-序列5，20μL， 10μM)，37℃下缓慢震荡过夜，离心，洗涤，重悬于PBS缓冲液(200 μL)中得到ssDNA-UCNPs。
将ssDNA-UCNPs(100μL，2mg/mL)与H1，H2杂交混合液(H1-H2 的dsDNA扩增产物)在37℃下结合1h，立即加入GO(100μL，0.6 mg/mL)，然后在980nm激发光下测量混合物的荧光强度值，选择546 nm处的发射峰作为定量标准。
(3)根据标准曲线计算待测液中FB1的加标-回收率
如表1所示，本实施例中，玉米粉的加标-回收率为 95.20-105.34％。
本实施例中的生物传感器也可以每种成分单独保存或者临时制备，只要是由上转换材料加氧化石墨烯组成生物传感器来检测FB1都属于本发明的发明构思。
实施例2
与实施例1不同的是，本实施例中的检测样品为购自淘宝的进口燕麦粉。
如表1所示，本实施例中，玉米粉的加标-回收率为 99.79-103.20％。
实施例3
与实施例1不同的是，本实施例中的检测样品为购自淘宝的进口婴幼儿玉米辅食。
如表1所示，本实施例中，玉米粉的加标-回收率为 91.20-103.21％。
表1加标回收结果
Figure BDA0003442063660000101
实施例4.1
与实施例1不同的是，本实施例中，适配体添加量为150pmoL。
实施例4.2
与实施例1不同的是，本实施例中，适配体添加量为180pmoL。
实施例4.3
与实施例1不同的是，本实施例中，适配体添加量为240pmoL。
实施例4.4
与实施例1不同的是，本实施例中，适配体添加量为270pmoL。
实施例1和实施例4.1-4.4的MMPs与适配体反应后上清液的DNA 浓度与适配体添加量关系图如图3所示，MMPs与适配体反应后上清液的DNA浓度与适配体添加量呈正相关，为确保MMPs表面固定足够多的适配体，推荐适配体添加量为210pmoL。
实施例5.1
与实施例1不同的是，本实施例中，MMPs与适配体的反应时间为0.5h。
实施例5.2
与实施例1不同的是，本实施例中，MMPs与适配体的反应时间为1h。
实施例5.3
与实施例1不同的是，本实施例中，MMPs与适配体的反应时间为4h。
实施例5.4
与实施例1不同的是，本实施例中，MMPs与适配体的反应时间为8h。
实施例1和实施例5.1-5.4的MMPs与适配体反应后上清液的DNA 浓度与反应时间的关系图如图4所示，显示当反应时间超过2h后，上清液中的DNA浓度只有轻微下降，因此推荐MMPs与适配体反应时间为2h。
实施例6.1
与实施例1不同的是，本实施例中，UCNPs与CHA扩增产物结合的时间为0.5h。
实施例6.2
与实施例1不同的是，本实施例中，UCNPs与CHA扩增产物结合的时间为1h。实施例6.3
与实施例1不同的是，本实施例中，UCNPs与CHA扩增产物结合的时间为1.5h。
实施例6.4
与实施例1不同的是，本实施例中，UCNPs与CHA扩增产物结合的时间为2h。
UCNPs与CHA扩增产物结合的时间影响如图5所示，它说明UCNPs 与CHA扩增产物在结合1h后达到饱和状态。
实施例7.1
与实施例1不同的是，本实施例中，GO的含量为25μL。
实施例7.2
与实施例1不同的是，本实施例中，GO的含量为50μL。
实施例7.3
与实施例1不同的是，本实施例中，GO的含量为150μL。
实施例7.4
与实施例1不同的是，本实施例中，GO的含量为200μL。
如图6所示，GO的含量对UCNPs的淬灭具有较大的影响，当GO 添加量为100μL时，荧光响应的变化值最大，因此100μL为GO 最佳添加量。
图7为该生物传感器对目标物FB1的特异性评估，研究了生物传感器对其它真菌毒素的响应。如图7所示，当加入其它真菌毒素时，传感器没有明显的荧光响应，说明所用的FB1适配体只与FB1发生特异性结合，该传感器具有良好的选择性。
本发明的UCNPs-GO传感器的原理是基于CHA扩增的。如图8所示， FB1适配体及其cDNA通过链霉亲和素-生物素作用固定在MMPs表面，当不存在FB1时，cDNA不会触发CHA反应，UCNPs表面连接的是ssDNA，与GO的不饱和结构之间发生π-π相互作用而靠近GO表面，导致 FRET发生，荧光被淬灭。而当目标物存在时，目标物与适配体特异性结合导致cDNA脱离，从而触发CHA扩增，产生大量H1-H2的dsDNA，连接至UCNPs表面，致使UCNPs不会靠近GO表面，荧光信号增强。
需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 伏马毒素B1的检测方法及生物传感器、试剂盒的制备方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 6
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ataccagctt attcaattaa tcgcattacc ttataccagc ttattcaatt acgtctgcac 60
ataccagctt attcaattag atagtaagtg caatct 96
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattgaataa gctggtatgt gcag 24
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcacatac cagcttattc aattgataca tcgagaattg aataagctgg tcctaatcca 60
tg 62
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attcaattct cgatgtatca attgaataag ctggtgatac atcgag 46
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttttttcatg gattagg 17

Claims (8)

1.伏马毒素B1的检测方法，包括建立标准曲线；检测待测样品；根据标准曲线计算待测样品中FB1的浓度；还包括磁性微球上连接FB1适配体及其互补DNA（cDNA）、由cDNA引发的催化发夹自组装扩增、ssDNA-UCNPs连接扩增产物、氧化石墨烯淬灭UCNPs的荧光，所述检测方法步骤如下：
步骤（1）：将适配体和cDNA连接到磁性微球表面，然后适配体与目标物FB1进行特异性结合，通过磁分离富集得到cDNA， cDNA作为引发链与发夹H1、H2进行杂交，发生催化发夹自组装反应，得到H1-H2的dsDNA扩增产物；具体操作为：将链霉亲和素修饰的MMPs与生物素化的FB1适配体进行孵育，得到Apt-MMPs溶液；然后取Apt-MMPs溶液与过量cDNA进行杂交，磁分离后得到cDNA-Apt-MMPs，重悬于PBS缓冲液；然后，将不同浓度的FB1标准品分别与cDNA-Apt-MMPs溶液于37℃反应；随后进行磁分离得到上清液，得到富集的cDNA，与发夹H1、发夹H2混合进行杂交，得到dsDNA；
步骤（2）：氨基化的ssDNA偶联在UCNPs表面，得到ssDNA-UCNPs；
步骤（3）：ssDNA-UCNPs与步骤（1）中得到的H1-H2的dsDNA扩增产物进行结合；
步骤（4）：向体系中加入氧化石墨烯溶液，结合了扩增产物的UCNPs不会被氧化石墨烯淬灭荧光，通过荧光响应实现对目标物FB1的灵敏检测；具体操作为：立即加入GO，然后在980 nm激发光下测量体系的荧光强度值，选择546 nm处的发射峰作为定量标准。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）具体操作为：将PEI-UCNPs与戊二醛溶液于室温下震荡反应，离心，用PBS缓冲液洗涤两次后重悬于PBS缓冲液中；加入氨基化的ssDNA，缓慢震荡，离心，洗涤，重悬于PBS缓冲液中得到ssDNA-UCNPs；步骤（3）具体操作为：将ssDNA-UCNPs与dsDNA在37℃下杂交结合。
3. 用于检测伏马毒素B1的生物传感器，采用权利要求1所述的检测方法，由上转换纳米材料（UCNPs）和氧化石墨烯（GO）组成；所述上转换纳米材料选自纳米颗粒；所述上转换纳米材料粒径为25-30 nm。
4.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器制成或包装成试剂盒。
5.用于检测伏马毒素B1的试剂盒，由权利要求3所述的生物传感器和FB1标准品组成。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品为一系列浓度梯度的标准品溶液；所述标准品浓度为0.032-500 ng/mL；所述标准品浓度为0.032、0.16、0.8、4、20、100、500 ng/mL。
7.权利要求3或4所述生物传感器或权利要求5或6所述的试剂盒的制备方法：
步骤一，合成磁性微球（MMPs）并对其进行表面修饰；
步骤二，合成上转换纳米材料并对其进行表面修饰；
步骤三，进行分装、包装和/或保存。
8.权利要求3或4所述的生物传感器或权利要求5或6所述的试剂盒在食品中FB1的检测的应用；所述食品包括玉米、燕麦及其制品。
CN202111636718.6A 2021-12-29 2021-12-29 伏马毒素b1的检测方法及生物传感器、试剂盒的制备方法及其应用 Active CN114324279B (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116908154B (zh) * 2023-06-26 2024-02-20 江苏大学 一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103901000A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 江南大学 一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素b1的方法
CN106066316A (zh) * 2016-05-25 2016-11-02 江南大学 一种基于核壳型上转换发光标记与氧化石墨烯发光共振能量转移检测赭曲霉毒素a的方法
WO2017010854A1 (ko) * 2015-07-13 2017-01-19 국립암센터 나노입자를 이용한 핵산 검출용 키트 및 핵산 검출 방법
WO2020010133A1 (en) * 2018-07-03 2020-01-09 Rutgers, The State University Of New Jersey A luminescent layered composition and a method for using the composition
CN111175266A (zh) * 2020-01-19 2020-05-19 厦门大学 一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法
CN111607388A (zh) * 2020-06-23 2020-09-01 江苏省特种设备安全监督检验研究院 一种石墨烯量子点-稀土上转换复合物的制备方法及应用
CN112444510A (zh) * 2020-11-13 2021-03-05 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法和试剂盒
CN113092766A (zh) * 2021-03-30 2021-07-09 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用
CN113237868A (zh) * 2021-06-29 2021-08-10 江南大学 一种基于氧化石墨烯基的表面增强拉曼传感器对真菌毒素的比率型检测法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3069927B1 (fr) * 2017-08-04 2021-06-04 Ecole Polytech Procede de detection ultra-sensible a l'aide de particules photoluminescentes
US20190119731A1 (en) * 2017-10-24 2019-04-25 The Hong Kong Polytechnic University Nanoprobe sandwich assay for nucleotide sequence detection
US20200318168A1 (en) * 2019-04-05 2020-10-08 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Upconversion nanoparticle-based molecular probes and methods of use

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103901000A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 江南大学 一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素b1的方法
WO2017010854A1 (ko) * 2015-07-13 2017-01-19 국립암센터 나노입자를 이용한 핵산 검출용 키트 및 핵산 검출 방법
CN106066316A (zh) * 2016-05-25 2016-11-02 江南大学 一种基于核壳型上转换发光标记与氧化石墨烯发光共振能量转移检测赭曲霉毒素a的方法
WO2020010133A1 (en) * 2018-07-03 2020-01-09 Rutgers, The State University Of New Jersey A luminescent layered composition and a method for using the composition
CN111175266A (zh) * 2020-01-19 2020-05-19 厦门大学 一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法
CN111607388A (zh) * 2020-06-23 2020-09-01 江苏省特种设备安全监督检验研究院 一种石墨烯量子点-稀土上转换复合物的制备方法及应用
CN112444510A (zh) * 2020-11-13 2021-03-05 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法和试剂盒
CN113092766A (zh) * 2021-03-30 2021-07-09 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用
CN113237868A (zh) * 2021-06-29 2021-08-10 江南大学 一种基于氧化石墨烯基的表面增强拉曼传感器对真菌毒素的比率型检测法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A highly sensitive fluorometric biosensor for Fumonisin B1 detection based on upconversion nanoparticles-graphene oxide and catalytic hairpin assembly;Yingkai Qin 等;《Analytica Chimica Acta》(第1207期);第1-9页 *
功能化核酸适配子传感器的研究进展;王昆;陶占辉;徐蕾;刘亚青;;分析化学(第02期);第298 -304页 *

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