CN112763472B - 一种用于检测t-2毒素残留的检测系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于检测t-2毒素残留的检测系统及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测T‑2毒素残留的检测系统及其制备方法和应用，该检测系统包括二维片状金属有机骨架和双末端标记荧光素的适配体，所述二维片状金属有机骨架为铜基‑金属有机骨架作为猝灭剂，所述双末端标记荧光素的适配体作为荧光探针。本发明制备工艺简单、原料易得、成本低，易于规模化生产。本发明制备的用于检测T‑2毒素残留的检测系统灵敏度高，同时具有高选择性和特异性，仅对T‑2有荧光响应，对其他真菌毒素和干扰物质均无反应。采用本发明制备的用于检测T‑2毒素残留的检测系统可有效定量检测T‑2毒素残留，并且更加高效、节约成本、更加精确，对控制食品安全、保护人体健康具有重要的意义。

Description

一种用于检测T-2毒素残留的检测系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品分析，具体涉及一种用于检测T-2毒素残留的铜基-金属有机骨架及双末端修饰荧光素的适配体检测系统及其制备方法和应用。
背景技术
T-2毒素是镰刀菌属物种产生的一种与倍半萜类结构有关的毒素。它被认为是毒性最高的A型单丝孢霉菌真菌毒素。T-2毒素常见于谷物中，例如小麦，燕麦，大麦，玉米和大米。动物摄入受T-2毒素污染的饲料，可能导致呕吐，发育迟缓，生殖系统疾病，血液疾病和皮炎，特别是对于猪和家禽。因此建立简单、快速、灵敏和廉价的T-2毒素检测方法对控制谷物及农副产品中毒素含量具有重要的现实应用和社会意义。近年来，相继发展了薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、液质联用法以及酶联免疫法等，这些方法往往存在灵敏度低，或操作复杂，或仪器昂贵的缺点。随着时代的发展，寻求一种更加便捷高效、灵敏度高、成本低的检测产品和方法来满足更加严格的检测要求，对控制食品安全、保护人体健康具有重要的意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明一种用于检测T-2毒素残留的检测系统，本发明的检测系统可以有效解决现有T-2毒素检测操作复杂，或仪器昂贵或检测时受环境干扰较大的缺点。
本发明还提供用于检测T-2毒素残留的检测系统的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种用于检测T-2毒素残留的检测系统，包括二维片状金属有机骨架和双末端标记荧光素的适配体，所述二维片状金属有机骨架为铜基-金属有机骨架作为猝灭剂，所述双末端标记荧光素的适配体作为信号探针和识别平台。
其中，所述铜基-金属有机骨架由二硫代草酰胺、硫酸铜形成。
其中，所述双末端标记荧光素的适配体为5’-FAM-GTA TAT CAA GCA TCG CGT GTTTAC ACA TGC GAG AGG TGA A-FAM-3’。
本发明所述的用于检测T-2毒素残留的检测系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)将二硫代草酰胺、硫酸铜在乙醇水溶液中反应，得到铜基-金属有机骨架；
(2)将双末端标记荧光素的适配体溶于Tris-HCl缓冲液中得到适配体溶液，与步骤(1)得到的得到铜基-金属有机骨架组成检测系统。
其中，步骤(1)所述反应是在乙醇水环境中室温下搅拌反应30-40min，洗涤纯化后真空干燥后得到的粉末为二维片状材料。
作为优选，步骤(1)所述搅拌反应为在室温下搅拌0.5h。
其中，步骤(1)所述二硫代草酰胺、硫酸铜在乙醇溶液中反应为在二硫代草酰胺的乙醇溶液中加入硫酸铜水溶液，二硫代草酰胺乙醇溶液中二硫代草酰胺的质量体积分数为4-5％g/mL，硫酸铜水溶液中硫酸铜浓度为1-2g/mL。
作为优选，二硫代草酰胺乙醇溶液中二硫代草酰胺的质量体积分数为 5％g/mL，硫酸铜水溶液中硫酸铜浓度为1g/mL；二硫代草酰胺乙醇溶液为10mL 硫酸铜水溶液为20mL。
其中，步骤(2)所述适配体溶液的浓度为12.5-60nM。所述步骤(2)中所用双末端标记荧光素的适配体是由上海生工生物工程公司合成并经HPLC纯化，所得的干粉置于-20℃冰箱保存，其分子量为13926g/mol，Tm值为65.8℃。
作为优选，步骤(2)所述适配体溶液的浓度为50nM。结合缓冲液为10mM Tris-HCl，50mM NaCl，50mM MgCl2。
本发明所述的用于检测T-2毒素残留的检测系统在定量检测对T-2毒素浓度中的应用。
其中，所述应用的具体过程为向双末端标记的荧光适配体溶液中加入T-2毒素溶液，低温孵育，随后加入铜基-金属有机骨架水溶液，再孵育，最终将所得溶液在离心取上清测定荧光强度。
作为优选，所述铜基-金属有机骨架在振荡超声下分散在水溶液中，制备0.8 mg/mL的水分散液备用。检测时所使用的铜基有机骨架的浓度为0.125mg/mL。
本发明的检测系统是一种铜基-金属有机骨架及双末端修饰荧光素的适配体的检测系统可以用于检测T-2毒素，实现T-2特异性、快速、高灵敏荧光检测。其中适配体单标记荧光团兼具适配体特异性识别以及荧光团信号输出的能力，所以被广泛用于分析测定，生物成像等领域，但在实际应用，其检测灵敏度受限于荧光信号输出单一。因此，为了克服这种缺陷，本发明以双末端标记荧光素的适配体作为信号探针和识别平台进行荧光扩增，同时采用二维片状铜基-金属有机骨架作为猝灭剂，可有效降低适配体结合的空间位阻，提高材料的猝灭能力，由此可以显著增强检测的灵敏度。选取最佳的适配体以及猝灭剂浓度等必需条件，建立T-2毒素浓度与荧光强度之比的线性关系，从而实现T-2毒素特异性、高灵敏、快速荧光定量检测。结果表明，此荧光检测系统检测，T-2毒素的线性范围为0-100ng/mL，检测时间约75min完成。通过对赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素 M1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等T-2毒素干扰物的分析，以及玉米和面粉中可能存在的干扰分析物如葡萄糖，维生素B1，常见金属离子的测定，这些物质均不干扰T-2毒素的检测，具有较高的特异性。本检测系统不需要复杂的合成步骤，不需要苛刻的合成条件，且检测系统的荧光稳定利于长期保存，检测时间短(75 min)，同时本发明的检测系统的制备原料易得、工艺简单、成本低，易于规模化生产。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提出了一种全新的用于检测T-2毒素残留的铜基-金属有机骨架及双末端修饰荧光素的适配体的检测系统，该检测系统制备工艺简单、原料易得、成本低，易于规模化生产。
本发明制备的用于检测T-2毒素残留的铜基-金属有机骨架及双末端修饰荧光素的适配体的检测系统选择性好、灵敏度高，检测速度快，仅对T-2毒素有荧光响应，对其他毒素包括赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮均无反应，另外对玉米粉/面粉基质中可能存在的葡萄糖，维生素B1以及常见的金属离子均无反应，具有很好的选择性和特异性，检测时间短，检测方法简便快速。
采用本发明制备的用于检测T-2毒素残留的铜基-金属有机骨架及双末端修饰荧光素的适配体的检测系统可有效定量检测T-2毒素残留，并且更加便捷高效、灵敏度高、节约成本，对控制食品安全、保护人体健康具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明的铜基-金属有机骨架透射电镜和红外测试如图；
图2为本发明的铜基-金属有机骨架的荧光猝灭图；
图3为本发明的铜基-金属有机骨架及双末端修饰荧光素的适配体的检测系统与T-2毒素反应的荧光响应图；
图4为本发明用于T-2毒素残留的铜基-金属有机骨架及双末端修饰荧光素的适配体的检测系统与T-2毒素反应的荧光强度线性关系图；
图5为本发明用于T-2毒素残留的铜基-金属有机骨架及双末端修饰荧光素的适配体的检测系统与其他毒素和干扰离子的荧光响应分析示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中的原料均市售可得。其中3nmol的T-2毒素适配体(5’-FAM-GTA TAT CAAGCA TCG CGT GTT TAC ACA TGC GAG AGG TGA A-FAM-3’)购于上海生工生物工程有限公司；T-2毒素以及其他毒素购于Sigma-Aladdin，其他市售均可。
实施例1
检测T-2毒素的铜基-金属有机骨架及双末端标记荧光素的适配体检测系统的制备，包括以下步骤：
(1)铜基-金属有机骨架的制备：将的10mL二硫代草酰胺(5％g/mL)乙醇溶液中添加到20mL CuSO4水溶液(1mg/mL)中25℃搅拌30min形成黑色沉淀物，通过在室温下以8000rpm/min的速度离心10min将沉淀与上清液分离，将黑色沉淀物依次用水和乙醇洗涤3次，纯化后将凝胶状沉淀物在25℃真空干燥中12h，最后将所得产物粉末(H2dtoaCu)即为得到铜基-金属有机骨架，将2 mg H2dtoaCu振荡和超声分散在2.5mL的超纯水中，以形成0.8mg/mL的 H2dtoaCu水溶液，将其保存在4℃下备用。
(2)双末端标记荧光素适配体溶液：将合成的双末端标记荧光素的适配体溶于Tris-HCl缓冲液中(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，50mM MgCl2，10mM， pH 8.0)，配制成浓度为50nM的适配体溶液；与步骤(1)得到的得到铜基-金属有机骨架组成检测系统。
实施例2
实施例1中制得的铜金属有机骨架的透射电镜和红外测试，如图1所示结果表明合成的铜基-金属有机骨架为二维片状材料，相对于多孔三维结构有机金属骨架受限于空间位阻，片状可以有效降低这种位阻从而提高猝灭能力。该材料和双末端标记荧光素的适配体具有更好的接触面积，提高其猝灭能力，结果如图2 所示，在1分钟可以快速猝灭荧光探针的荧光，在15分钟后达到最大值(过程同时实施例3的检测过程，不加入T-2毒素)。从而为实现T-2毒素的高灵敏快速检测提供可能。
实施例3
实施例1中制得的铜基-金属有机骨架作为猝灭剂的双末端标记的荧光适配体检测系统与T-2毒素的荧光光谱测试：取40μL双末端标记的荧光适配体溶液(50nM)，然后加入40μL不同浓度(0，5，10，20，25，40，100，125， 200，400，500ng/mL)的T-2毒素溶液，4℃孵育60min，随后加入H2dtoaCu 水溶液，使其浓度为125μg/mL，再4℃孵育15min，最终将所得溶液在12000 rpm离心10min，取上清测定荧光强度；在荧光探针中加入不同浓度T-2毒素荧光光谱图见图3。该实验结果表明，随着T-2浓度的增加，荧光探针在520nm 处的荧光强度被连续恢复。以520nm处荧光强度为测试波长，荧光强度与0-100 ng/mL范围内的T-2浓度呈线性关系，线性关系曲线见图4。线性曲线拟合方程为得到的相应的线性回归方程为：Y＝119.6+26.6×CT-2(R2＝0.9982)其中，Y 是在T-2存在下荧光探针(FAM-apt-FAM)的荧光强度，CT-2是以纳克浓度(ng/ mL)表示的T-2浓度，说明本发明制备的探针可以用于T-2含量的定量分析检测。
实施例4
将实施例1制得的制得的基于铜金属有机骨架作为猝灭剂的双末端标记的荧光适配体检测系统与其他真菌毒素和常见干扰物质的反应状况分析。实施例1 制得双末端标记的荧光适配体，配成终浓度为200nM的Tris-HCl缓冲溶液(10 mM，pH 8.0)，作为母液。荧光光谱测试：将40μL上述母液加入到一定量的 Tris-HCl缓冲溶液(10mM,pH 8.0)使得适配体终浓度为50nM，然后分别加入不同真菌毒素和常见干扰物质的溶液，T-2为100ng/mL、黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A为1μg/mL，呕吐毒素为500ng/mL，Ca2+、Cu2+、K+的最终浓度1μg/mL； 4℃孵育60min，随后加入H2dtoaCu水溶液，使其浓度为125μg/mL，再4℃孵育15min，最终将所得溶液在12000rpm离心10min，取上清测定荧光强度；荧光发射光谱测定以470nm激发：激发与发射的狭缝宽度为10nm/10nm。所得荧光增量图见图5。以上结果表明：实施例1制得的检测系统对T-2毒素具有高度的选择性和特异性，并且在上述条件下，能够从黄曲霉毒素、呕吐毒素等常见的真菌毒素中区分出T-2毒素，而且其他干扰物质维生素B1、葡萄糖，以及常见离子如K+、Ca2+、Cu2+不干扰T-2毒素的测定；
将实施例1制得的检测系统加标回收实验分析：
将不同浓度的T-2标准溶液添加到25mL含5g小麦或玉米的甲醇-水(70:30, v/v)溶液中(T-2终浓度10、50、100ng/mL)，涡旋振荡50分钟。然后将混合物在室温下以12000rpm离心10分钟。用Tris-HCl(10mM,pH 8.0)缓冲液将上清液按体积比稀释至五倍待用；
实施例1制得双末端标记荧光素的适配体荧光探针溶液，配成浓度为200nM 的Tris-HCl缓冲溶液(10mM，pH 8.0)，作为母液。荧光光谱测试：将40μL上述母液加入到上述T-2上清液的稀释液中使适配体的终浓度为50nM，4℃孵育 60min，随后加入H2dtoaCu水溶液，使其浓度为125μg/mL，再4℃孵育15min，最终将所得溶液在12000rpm离心10min，取上清测定荧光强度，荧光发射光谱测定以470nm激发：激发与发射的狭缝宽度为10nm/10nm。检测结果如表1 所示。该实验结果表明该荧光探针用于玉米面粉中T-2毒素的检测，回收率为89.27％-116.52％，此方法准确性高。
表1玉米面粉中T-2毒素浓度检测及其加标回收测定
Figure BDA0002868848700000061
以上结果表1和图4和图5表明：实施例1制得的检测系统能够实现T-2毒素快速荧光定量检测，检测范围为0-100ng/mL，检出限为0.39ng/mL，回收率为89.27％-115.62％。且可以实现T-2毒素的定量测定，快速简便，检测线性范围宽，检出限低，灵敏度高，对T-2毒素具有高度的选择性和特异性，并且在上述条件下，能够从赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮中，区分出T-2毒素，而且玉米面粉中可能存在的其他物质如葡萄糖，维生素B1，其他金属离子不干扰T-2毒素的测定。
此外，本发明的检测方法只需要75min即可(反应时间)，而采用普通高效液相色谱法检测T-2毒素，检测方法步骤复杂，测试时间长至3h以上。本发明所需原料都易得，价格低廉，单个样品分析速度与液相，液质相比，速度更快，回收率实验表明，此方法能够准确用于T-2毒素的定量检测。
实施例5
实施例5与实施例1制备方法相同，不同之处在于：步骤(1)二硫代草酰胺乙醇溶液中二硫代草酰胺的质量体积分数为4％g/mL，硫酸铜水溶液中硫酸铜浓度为2g/mL；室温下搅拌反应40min，步骤(2)适配体溶液的浓度为12.5nM。
实施例6
实施例6与实施例1制备方法相同，不同之处在于：步骤(2)适配体溶液的浓度为60nM。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种用于检测T-2毒素残留的检测系统及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtatatcaag catcgcgtgt ttacacatgc gagaggtgaa 40

Claims (7)

1.一种用于检测T-2毒素残留的检测系统，其特征在于，包括二维片状金属有机骨架和双末端标记荧光素的适配体，所述二维片状金属有机骨架为铜基-金属有机骨架，其作为猝灭剂，所述双末端标记荧光素的适配体作为信号探针和识别平台；
所述铜基-金属有机骨架由二硫代草酰胺、硫酸铜形成；所述双末端标记荧光素的适配体为5’-FAM- GTA TAT CAA GCA TCG CGT GTT TAC ACA TGC GAG AGG TGA A-FAM-3’。
2.一种权利要求1所述的用于检测T-2毒素残留的检测系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将二硫代草酰胺、硫酸铜在乙醇溶液中反应，得到铜基-金属有机骨架；
（2）将双末端标记荧光素的适配体溶于Tris-HCl 缓冲液中得到适配体溶液，与步骤（1）得到的得到铜基-金属有机骨架组成检测系统。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述反应为室温下搅拌反应30-40 min，洗涤纯化后真空干燥后得到的粉末为二维片状材料。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述二硫代草酰胺、硫酸铜在乙醇溶液中反应为在二硫代草酰胺的乙醇溶液中加入硫酸铜水溶液，二硫代草酰胺乙醇溶液中二硫代草酰胺的质量体积分数为4-5%g/mL，硫酸铜水溶液中硫酸铜浓度为1-2 g/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述适配体溶液的浓度为12.5-60 nM。
6.一种权利要求1所述的用于检测T-2毒素残留的检测系统在定量检测对T-2毒素浓度中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的具体过程为向双末端标记的荧光适配体溶液加入T-2毒素溶液，低温孵育，随后加入铜基-金属有机骨架水溶液，再孵育，最终将所得溶液在离心取上清测定荧光强度。
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