CN110118759B - 一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境监测技术领域，涉及一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法。二维MOF纳米片表面与DNA的共价偶联有效地利用MOF纳米片表面有限的吸附位点，增强纳米片吸附DNA分子的能力，降低背景荧光信号。同时，采用短链DNA分子作为信号报告分子有效地提高荧光恢复效率，而反应体系中表面钝化剂聚苯乙烯磺酸钠的加入进一步削弱了纳米片对信号报告分子的吸附能力，使MOF纳米片传感器提高了对低浓度OTC的线性响应，增强了对OTC的检测性能。本发明的检测方法可以有效地降低荧光背景值，提高目标物诱导的信号响应值，有效地提升基于物理吸附原理构建的荧光传感平台对土霉素的检测性能。
Description
技术领域
本发明属于环境监测技术领域，涉及一种基于表面钝化和DNA共价偶联修饰金属有机骨架(MOFs)纳米片的土霉素荧光传感检测方法。
背景技术
抗生素是一类预防和治疗细菌感染的重要药物，广泛地应用于人类医疗以及家禽家畜、水产品养殖等领域。其中，土霉素(OTC)作为一种广谱抗菌的四环素类抗生素，广泛地应用于多种细菌感染疾病的防治中。由于抗生素在人体或动物体内只能部分代谢，大部分的抗生素是以其母体结构形式通过尿液或粪便排出体外，进入到水体或土壤中。进入到环境介质中的抗生素，除了会对生态环境造成危害，还可以通过生物富集作用进入到人体或动植物体内，引发一系列健康风险。此外，由于滥用抗生素使得越来越多的细菌产生了耐药性，耐药细菌的产生将会对人类的生存产生巨大的威胁。因此，亟需加大抗生素污染的监测和控制力度。
目前抗生素的主要检测方法包括微生物测定法、理化检测法(波谱法、色谱法及其联用技术等)以及免疫分析法(放射免疫测定法、酶联免疫测定法、荧光免疫测定法等)。这些方法各自存在不同的优缺点，例如微生物检测法操作简单、价格低廉，但检测灵敏度较低，耗时长；理化检测法准确度高、灵敏度高，但操作程序复杂，检测费用昂贵，不能进行快速检测分析；免疫分析法则存在假阳性率高的缺陷。因此发展简单、快速、高灵敏度、高准确率、易推广的抗生素残留检测技术具有重要意义。
近些年来，基于纳米材料构建的传感方法作为一种新型的分析方法，同时具有操作简便、灵敏度高、特异性好、响应速度快等优点，在分析领域展现出广阔的应用前景。研究者已经成功利用纳米材料构建了一系列针对抗生素检测的传感平台(AnalyticalChemistry,2013,85(4):2010-2014；Sensors and Actuators B-Chemical,2018,273:1495-1500；Sensors and Actuators B-Chemical,2018,269:238-256)，信号响应方式包括电化学、光电、比色、荧光等。其中，基于荧光信号的传感方法具有操作方便、分析速度快、灵敏度高等优点，广泛地应用于土霉素的检测中(Microchimica Acta,2013,180(9-10):829-835；Microchimica Acta,2017,184(7):2365-2373)。荧光传感方法的基本原理是利用荧光基团和淬灭剂两者之间随距离变化的荧光共振能量转移(FRET)作用，进而通过荧光信号的变化来实现目标物的检测(Angewandte Chemie-International Edition,2009,48(26):4785-4787)。但这些基于物理吸附原理构建的荧光传感方法存在着非特异性置换、解吸效率低等固有缺陷，在一定程度上影响了抗生素的检测灵敏度。
金属有机骨架材料(MOFs)是一类由金属离子或金属团簇与多面体有机配体通过配位作用形成的多孔晶体材料，具有很多优异的特性，例如可调控的结构和功能、优异的比表面积和高度有序的孔结构等。相对于块状的MOFs纳米颗粒来说，MOFs纳米片表面具有更薄的纵向厚度、增加的比表面积、高度暴露的活性位点以及高效的电子传递速率，在传感领域表现出巨大的应用潜力(Advanced Materials,2015,27(45):7372-7378.)。本发明为了避免物理吸附型荧光传感方法的固有缺陷，利用新兴的MOFs纳米片材料，设计了基于共价偶联和表面钝化技术的二维MOFs纳米荧光传感方法，有效地避免传统物理吸附型荧光传感方法背景信号高、解吸效率低等缺陷，强化了目标物诱导的信号响应程度，提高了目标物的检测性能，该方法操作简单，实用性强，应用前景非常广泛。
发明内容
本发明解决了现有土霉素荧光传感检测方法背景信号过高、荧光恢复效率低以及检测性能较差等不足，提供了一种简便、快捷、高灵敏度的检测水体中土霉素的方法。
本发明中，我们通过表面活性剂(PVP)辅助法合成了MOFs纳米片(Cu(HBTC)-1)，利用氨基与羧基之间的酰胺反应，将部分杂交的DNA探针共价偶联在MOFs纳米片上，可以有效地避免传感检测过程中的非特异性置换等问题，降低物理吸附型荧光传感方法的背景信号。利用聚苯乙烯磺酸钠(PSS)作为表面钝化剂，实现了MOFs纳米片的表面钝化，提高了OTC诱导的信号响应效率。而利用荧光标记的短链DNA作为信号报告分子又进一步增强了OTC诱导的荧光恢复效率。通过共价偶联和表面钝化技术，可以有效避免物理吸附型传感原理的固有缺陷，实现传感界面反应的强化，提高目标物的检测性能。反应体系的荧光强度在一定范围内与土霉素的浓度正相关，从而为土霉素的定量分析提供依据。而适配体固有的特异性识别能力，可以保证基于表面钝化和共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片应用于OTC检测的特异性。
本发明的技术方案：
一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法，步骤如下：
(1)金属有机骨架纳米片(Cu(HBTC)-1)的制备：按照质量比为17:100配制氯化铜和聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K17-K30)的水溶液；混合物搅拌5-10min后，逐滴缓慢加入氢氧化钠，再搅拌5-10min后，逐滴缓慢加入抗坏血酸，其中，氯化铜、氢氧化钠与抗坏血酸三者的摩尔比4:2:1，继续搅拌5-10min，此时得到的产物为黄色的立方氧化亚铜(Cu2O)纳米颗粒；随后，通过离心(8000-10000r/min)分离收集固体，用乙醇清洗清洗3-5次后，将固体再次分散到乙醇中，得到Cu2O乙醇分散液；
先配制H3BTC的乙醇溶液，再配制PVP和均苯三甲酸的水溶液，混合搅拌5-10min后，加入Cu2O乙醇分散液，其中Cu、PVP和均苯三甲酸三者的质量比为64:4000:2000，1-2min内混合液变为透明颜色；继续搅拌2-5h后，混合液变为淡蓝色浑浊的分散液，说明形成Cu(HBTC)-1纳米片，混合液继续在室温下搅拌12-24h后，通过离心分离(8000-10000r/min)收集固体产物，然后分别依次用乙醇和高纯水离心(8000-10000r/min)清洗3-5次；将收集的固体粉末在25-50℃下真空干燥12-24h，得到浅蓝色粉末即为金属有机骨架纳米片，置于干燥条件下保存；
(2)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的合成：取氨基修饰的OTC适配体(序列1)与等物质的量的FAM标记的短链ssDNA(序列2)在25-35℃下混合均匀，放入水浴锅中，加热至90-95℃，并保持5-10min，形成部分杂交的双链DNA(dsDNA)探针；将金属有机骨架纳米片分散在MES缓冲溶液(10-25mM，pH＝5-6)中，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其中金属有机骨架纳米片、EDC和NHS三者的最终质量比25:10:10，在25-35℃下磁力搅拌10-30min后，加入部分杂交的双链DNA探针，其中，双链DNA探针的摩尔量与金属有机骨架纳米片的质量比为1mol:106g，混合物在25-35℃下搅拌12-24h后，用高纯水离心(8000-10000r/min)清洗清洗2-3次，收集固体产物，冷冻干燥12-24h得到DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片；
(3)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的表面钝化：将步骤(2)制备的DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片分散在HEPES溶液(10-25mM，pH＝7-8)中，再加入PSS(其在体系中的终质量浓度0.001％-0.5％wt)，混合液在25-35℃下孵化1-2h；
(4)土霉素的定量检测：向步骤(3)制备的基于表面钝化和DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片中，缓慢加入0-25μg/L的土霉素的HEPES溶液(10-25mM，pH＝7-8)。在25-35℃下，孵化0.5-2h，测定反应体系荧光强度。
所述的DNA序列如下：
序列1：5'-NH2-C6-CGT ACG GAA TTC GCT AGC CGA GGC ACA GTC GCT GGT GCCTAC CTG GTT GCC GTT GTG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3'
序列2：5'-FAM-CAC GTG GAG CTC GG-3'。
本发明的有益效果：
(1)当反应体系中PSS的质量浓度在0.2％wt时，MOFs纳米片的质量浓度在156.25μg/mL时，该石墨烯基复合水凝胶体系的检测下限可达0.50μg/L，检测范围在0.50-5.00μg/L。
(2)基于表面钝化和DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片是在室温和常压的条件下，经简单的物理搅拌或孵化合成的，不需要高压、高温等复杂的合成条件。
(3)本发明中基于表面钝化和DNA共价偶联修饰金属有机骨架纳米片构建的荧光传感器可以通过更换适配体的种类，实现其他目标物的检测，即具有通用性检测的功能。
附图说明
图1是本发明所述的基于表面钝化和共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的土霉素荧光检测方法的制备过程与检测机理示意图。
图2是图1所示过程中各物质的示意图。
图3是本发明的方法获得的金属有机骨架纳米片体系(PSS的质量浓度为0.2％wt，MOFs纳米片的质量浓度为156.25μg/mL时)应用于土霉素检测的标准工作曲线。
图4是本发明的方法获得的基于表面钝化和DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片体系(PSS的质量浓度为0.2％wt，MOFs纳米片的质量浓度为156.25μg/mL时)应用于土霉素检测的标准线性曲线。
具体实施方式
以下结合技术方案具体说明本发明的具体实施方式。
实施例1
配置水样中土霉素含量的测定：
(1)金属有机骨架纳米片(Cu(HBTC)-1)的制备：
向40mL的高纯水中加入氯化铜(CuCl2)(2.5M)中加入0.1g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30)。混合物搅拌5min后，逐滴缓慢加入2.5mL的氢氧化钠(0.2M)，再搅拌10min后，逐滴缓慢加入2.5mL的新鲜配置的抗坏血酸(0.1M)，继续搅拌10min，此时得到的产物为黄色的立方氧化亚铜(Cu2O)纳米颗粒。随后，在8000r/min的条件下离心分离收集固体，用乙醇清洗清洗3次后，将固体再次分散到10mL的乙醇溶液中。再称取0.4gPVP溶于60mL高纯水中，并加入4mL均苯三甲酸乙醇溶液(0.24M)。混合物搅拌10min后，加入上述制备的Cu2O乙醇分散液，2min内混合物变为透明颜色。继续搅拌2h后，混合液变为淡蓝色浑浊的分散液，说明形成了Cu(HBTC)-1纳米片，混合液继续在室温下搅拌16h后，在8000r/min的条件下离心分离收集固体产物，然后分别用乙醇和高纯水离心(8000r/min)清洗3次。将收集的固体粉末在35℃下真空干燥24h，得到浅蓝色粉末，置于干燥条件下保存。
(2)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的合成：
取氨基修饰的OTC适配体0.025μmol(序列1)与等物质的量的FAM标记的短链ssDNA(序列2)在25℃下混合均匀，放入水浴锅中，加热至95℃，并保持5min，形成部分杂交的双链(dsDNA)探针。称取25mg的MOFs纳米片分散在1mL的MES缓冲液(10mM，pH＝5.50)中，并分别加入10mg/mL的EDC和NHS溶液，在25℃下磁力搅拌30min后，加入上述部分杂交的dsDNA探针，25℃下搅拌12h后，用高纯水离心(8000r/min)清洗清洗3次，收集固体产物，冷冻干燥24h得到DNA共价偶联的MOFs纳米片。
(3)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的表面钝化：
向步骤(2)制备的金属有机骨架纳米片中(156.25μg/mL)，加入PSS的溶液(质量浓度0.2％wt)，在35℃下孵化2h。
(4)检测方法：
向步骤(3)制备的基于表面钝化和DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片中，缓慢加入0-25μg/L的土霉素的HEPES溶液(25mM，pH＝7.5)。经过1h的孵化后，测定反应体系荧光强度随抗生素浓度变化情况。激发波长为486nm，发射波长为518nm。
(4)标准工作曲线的绘制:
步骤(4)中随着样品中土霉素浓度的增加，上清液的荧光强度不断增加，在0.50-5.00μg/L范围内，体系荧光强度与土霉素浓度有良好的线性关系，线性相关系数R2＝0.97(图4)。
(5)配置水样中土霉素含量的测定：
用HEPES缓冲溶液配置土霉素浓度为2.50μg/L的水样。将样品用于步骤(3)方法进行检测，检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比，计算出土霉素的浓度。实验结果测出土霉素含量2.80μg/L，回收率为112％。相对标准偏差RSD为1.50％(n＝5)。
实施例2
自来水样品中土霉素含量的测定：
(1)金属有机骨架纳米片(Cu(HBTC)-1)的制备：
向40mL的高纯水中加入氯化铜(CuCl2)(2.5M)中加入0.1g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30)。混合物搅拌5min后，逐滴缓慢加入2.5mL的氢氧化钠(0.2M)，再搅拌10min后，逐滴缓慢加入2.5mL的新鲜配置的抗坏血酸(0.1M)，继续搅拌10min，此时得到的产物为黄色的立方氧化亚铜(Cu2O)纳米颗粒。随后，在8000r/min的条件下离心分离收集固体，用乙醇清洗清洗3次后，将固体再次分散到10mL的乙醇溶液中。再称取0.4gPVP溶于60mL高纯水中，并加入4mL均苯三甲酸乙醇溶液(0.24M)。混合物搅拌10min后，加入上述制备的Cu2O乙醇分散液，2min内混合物变为透明颜色。继续搅拌2h后，混合液变为淡蓝色浑浊的分散液，说明形成了Cu(HBTC)-1纳米片，混合液继续在室温下搅拌16h后，在8000r/min的条件下离心分离收集固体产物，然后分别用乙醇和高纯水离心(8000r/min)清洗3次。将收集的固体粉末在25℃下真空干燥24h，得到浅蓝色粉末，置于干燥条件下保存。
(2)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的合成：
取氨基修饰的OTC适配体0.025μmol(序列1)与等物质的量的FAM标记的短链ssDNA(序列2)在25℃下混合均匀，放入水浴锅中，加热至95℃，并保持5min，形成部分杂交的双链(dsDNA)探针。称取25mg的MOFs纳米片分散在1mL的MES缓冲液(10mM，pH＝5.50)中，并分别加入10mg/mL的EDC和NHS溶液，在25℃下磁力搅拌20min后，加入上述部分杂交的dsDNA探针，25℃下搅拌12h后，用高纯水离心(8000r/min)清洗清洗3次，收集固体产物，冷冻干燥12h得到DNA共价偶联的MOFs纳米片。
(3)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的表面钝化：
向步骤(2)制备的金属有机骨架纳米片中(156.25μg/mL)，加入PSS的溶液(质量浓度0.2％wt)，在25℃下孵化2h。
(4)检测方法：
向步骤(3)制备的基于表面钝化和DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片中，缓慢加入0-25μg/L的土霉素的HEPES溶液(25mM，pH＝8.0)。经过1h的孵化后，测定反应体系荧光强度随抗生素浓度变化情况。激发波长为486nm，发射波长为518nm。
(4)标准工作曲线的绘制：
步骤(4)中随着样品中土霉素浓度的增加，上清液的荧光强度不断增加，在0.50-5.00μg/L范围内，体系荧光强度与土霉素浓度有良好的线性关系，线性相关系数R2＝0.97(图4)。
(5)自来水样品中土霉素含量的测定：
由于自来水样品中未检出土霉素，故采用加标回收实验。用自来水样品配制土霉素溶液，浓度为5μg/L。将样品用于步骤(3)方法进行检测，检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比，计算出土霉素的浓度。实验结果测出土霉素含量4.75μg/L，回收率为95％。相对标准偏差RSD为2.35％(n＝5)。
Claims (2)
1.一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法，其特征在于，步骤如下：
(1)金属有机骨架纳米片的制备：按照质量比为17:100配制氯化铜和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液，搅拌5-10min后，逐滴缓慢加入氢氧化钠，再搅拌5-10min后，逐滴缓慢加入抗坏血酸，其中，氯化铜、氢氧化钠与抗坏血酸三者的摩尔比4:2:1，继续搅拌5-10min，此时得到的产物为黄色的立方氧化亚铜纳米颗粒；随后，通过离心分离收集固体，用乙醇清洗清洗3-5次后，将固体再次分散到乙醇中，得到Cu2O乙醇分散液；
先配制H3BTC的乙醇溶液，再配制PVP和均苯三甲酸的水溶液，混合搅拌5-10min后，加入Cu2O乙醇分散液，其中Cu、PVP和均苯三甲酸三者的质量比为64:4000:2000，1-2min内混合液变为透明颜色；继续搅拌2-5h后，混合液变为淡蓝色浑浊的分散液，说明形成金属有机骨架纳米片，混合液继续在室温下搅拌12-24h后，通过离心分离收集固体产物，然后分别依次用乙醇和高纯水离心清洗3-5次；将收集的固体粉末在25-50℃下真空干燥12-24h，得到浅蓝色粉末即为金属有机骨架纳米片，置于干燥条件下保存；
(2)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的合成：取序列1氨基修饰的OTC适配体与等物质的量的序列2FAM标记的短链ssDNA在25-35℃下混合均匀，放入水浴锅中，加热至90-95℃，并保持5-10min，形成部分杂交的双链DNA探针；将金属有机骨架纳米片分散在MES缓冲溶液中，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，其中金属有机骨架纳米片、EDC和NHS三者的最终质量比25:10:10，MES缓冲溶液的浓度为10-25mM，pH＝5-6；上述混合体系在25-35℃下磁力搅拌10-30min后，加入部分杂交的双链DNA探针，其中，双链DNA探针的摩尔量与金属有机骨架纳米片的质量比为1mol:106g，混合物在25-35℃下搅拌12-24h后，用高纯水离心清洗清洗2-3次，收集固体产物，冷冻干燥12-24h得到DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片；
(3)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的表面钝化：将步骤(2)制备的DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片分散在HEPES溶液中，再加入PSS，混合液在25-35℃下孵化1-2h；其中，HEPES溶液的浓度为10-25mM，pH＝7-8；PSS在体系中的终质量浓度0.001％-0.5％wt；
(4)土霉素的定量检测：向步骤(3)制备的基于表面钝化和DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片中，缓慢加入0-25μg/L的土霉素的HEPES溶液；在25-35℃下，孵化0.5-2h，测定反应体系荧光强度；其中，HEPES溶液的浓度为10-25mM，pH＝7-8；
所述的DNA序列如下：
序列1：5'-NH2-C6-CGT ACG GAA TTC GCT AGC CGA GGC ACA GTC GCT GGT GCC TACCTG GTT GCC GTT GTG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3'
序列2：5'-FAM-CAC GTG GAG CTC GG-3'。
2.根据权利要求1所述的一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法，其特征在于，离心的条件为8000-10000r/min。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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