CN109342732A - 一种结合诱导dna组装荧光检测器件及利用其检测小分子含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于结合诱导DNA组装荧光检测器件及检测小分子含量的方法。一种结合诱导DNA组装荧光检测器件，包括识别元件和信号元件，所述的识别元件包括胶体金、胶体金表面修饰的与待检测小分子对应的特异性抗体和一段DNA序列即辅助探针AO；所述的信号元件包括DNA序列，DNA序列一端标记有荧光基团，另一端连接有待检测小分子抗原，标记有荧光基团一端处的一段DNA序列C1*和辅助探针AO自由端处的一段序列C1互补，信号元件的中部可自由弯曲。本发明方法为均质检测，简单便捷，采用不同抗体可应用于不同小分子检测。

Description

一种结合诱导DNA组装荧光检测器件及利用其检测小分子含 量的方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种基于结合诱导DNA组装荧光检测器件及检测小分子含量的方法。
背景技术
结合诱导DNA组装技术是指当含有核苷酸的识别探针，特异性结合目标分子时，引发DNA组装反应，产生荧光检测信号。即只有当特定的目标分子引起特异性结合反应时，才可以实现DNA的组装。该技术需要两个亲和配基来识别同一个目标分子，多用于蛋白质和核酸等大分子检测。现有结合诱导DNA组装技术不适用于小分子检测，因为小分子无法同时提供两个亲和配基用于特异性结合反应。
抗原抗体特异性结合反应是免疫检测的基本原理。免疫竞争反应是利用目标物与抗原竞争性结合抗体的反应，实现目标物的定性或定量检测。免疫荧光检测技术主要是将检测元件与荧光基团通过化学反应进行标记，然后利用目标物含量与荧光强度之间的关系，实现目标物的定量检测。然而该方法存在荧光背景值高的弊端。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足而提供一种结合诱导DNA组装荧光检测器件及检测小分子的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种结合诱导DNA组装荧光检测器件，包括识别元件和信号元件，所述的识别元件包括胶体金、胶体金表面修饰的与待检测小分子对应的特异性抗体和一段DNA序列即辅助探针AO；所述的信号元件包括DNA序列，DNA序列一端标记有荧光基团，另一端连接有待检测小分子抗原，标记有荧光基团一端处的一段DNA序列C1*和辅助探针AO自由端处的一段序列C1互补，信号元件的中部可自由弯曲。
进一步地，所述的信号元件包含抗原和两个DNA序列探针：连接探针和信号探针；连接探针LO上连接有待检测小分子抗原；信号探针SO含有三部分，信号探针的一端标记有荧光基团，标记有荧光基团一端处的一段DNA序列C1*和信号探针另一端处的一段DNA序列C2*分别与辅助探针AO自由端处的一段序列C1和连接探针LO自由端处的一段序列C2互补，信号探针的中部可自由弯曲。
按上述方案，所述信号探针的中部为由多个T碱基形成的可自由弯曲的臂。
按上述方案，所述的待检测小分子为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等真菌毒素，与待检测小分子对应的特异性抗体可分别为抗黄曲霉毒素抗体、抗赭曲霉毒素抗体、抗玉米赤霉烯酮抗体和抗T-2毒素抗体，具体可为抗黄曲霉毒素单克隆抗体、抗赭曲霉毒素单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体和抗T-2毒素单克隆抗体。
按上述方案，待检测小分子抗原与连接探针通过共价结合连接。
按上述方案，所述的荧光基团为Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素等荧光基团。
进一步的，所述的辅助探针AO的DNA序列为：5’-巯基-TTTTTAGCAGTGT-3’。
所述连接探针的DNA序列和信号探针的DNA序列分别为：
连接DNA:5’-GGTCGTGACAGGATTTTT-巯基-3’；
信号DNA:5’-TCCTGTCACGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACTGCT-荧光基团-3’
本发明提供如上所述的检测器件的制备方法，包括以下步骤：
(1)识别元件的制备：
在胶体金上修饰抗体和辅助探针。
(2)信号元件的制备：
在连接探针上结合抗原，得到抗原-连接DNA偶联物；
信号探针DNA上修饰荧光基团，具体可将荧光基团通过共价结合与信号探针连接，实现信号探针的荧光修饰，然后将荧光基团修饰的信号探针加入到上述抗原-连接探针偶联物，使连接探针和信号探针进行杂交，后处理获得纯化的抗原-连接探针-信号探针偶联物，即信号元件。抗原-连接探针偶联物与信号探针混合时，连接探针的C2与信号探针的C2*互补，即可实现连接探针与信号探针的结合，完成抗原的荧光标记。
按上述方案，荧光基团修饰的信号探针和上述抗原-连接探针偶联物的摩尔比1：1。
胶体金与抗体的偶联主要可通过物理吸附、静电相互作用等作用力实现。胶体金与辅助DNA之间的偶联，主要可通过金硫键实现，具体可采用以下步骤：所述步骤(1)为；将胶体金先加碱用调节pH值至6.0-9.0，加入抗体，室温反应一段时间，反应时间可为20-60min；抗体和胶体金的摩尔比为50：1至110：1；然后加入辅助探针DNA，室温孵育一段时间，可为5-30min，辅助DNA和胶体金的摩尔比例为200：1至1000：1，加入PEG20000(终浓度为2％)，室温孵育一段时间，可为20-60min；加入NaCl(终浓度为500mM)，室温避光孵育，可为2-4h；离心得到的沉淀物重新溶解在含有0.1％BSA的10mM PBS缓冲液中，保存在4℃冰箱中备用。
按上述方案，所述胶体金的粒径10-30nm。
按上述方案，所述的抗原结合方法为：将抗原用6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯偶联剂进行活化，连接DNA用三(2-羧乙基)膦进行活化，将活化后的抗原和连接DNA混合，通过共价结合实现抗原-连接DNA偶联物的制备。
具体可为：用6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯处理抗原，室温反应2h后，用30kDa的超滤膜处理上述反应液，除去未反应的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯。
连接DNA用现配的三(2-羧乙基)膦处理，室温反应30min后，用蛋白凝胶分离柱处理，除去未反应的三(2-羧乙基)膦；
按摩尔比例6：1的比例混合上述两种偶联物，室温反应2h后，用30kDa的超滤膜处理上述反应液，除去未反应的连接DNA，得到抗原-连接DNA偶联物。
一种基于结合诱导DNA组装荧光检测器件检测小分子的方法，包括以下步骤：
将识别元件和信号元件加入到样品提取液中，室温反应；
测试反应体系的荧光强度，基于荧光强度-小分子浓度关系曲线，获得待测样品提取液中的小分子的含量。
按上述方案，室温反应时间1h。
按上述方案，所述荧光强度-小分子浓度关系曲线的获得方法：用空白样品提取液加标配制一系列待测小分子的标准品溶液，在上述加标样品提取液中加入识别元件和信号元件，反应一段时间后，读取荧光强度，以标准品浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制荧光强度-小分子物质浓度信号响应曲线。
按上述方案，一系列待测小分子的标准品溶液的终浓度分别为5，10，20，30，40，50nM。
本发明提供的检测器件中识别元件用于识别抗原和目标物，以及提供可与信号DNA组装的辅助DNA。信号元件通过一对互补DNA链，信号DNA和连接DNA的杂交实现荧光信号的标记，进而实现抗原的荧光标记。识别元件中的抗体特异性结合信号元件中的抗原，增加了识别元件中辅助DNA和信号元件中信号DNA的局部有效浓度，并结合诱导辅助DNA和信号DNA组装，缩短了荧光基团和猝灭集团之间的距离，提高荧光猝灭效率，荧光背景值降低，由此基于抗原抗体特异性结合反应与结合诱导DNA组装结合，达到将结合诱导DNA组装应用于小分子的灵敏检测的目的。
以AFB1为例，当样品提取液中不含AFB1时，胶体金表面的AFB1单克隆抗体特异性识别荧光标记的抗原，发生抗原抗体特异性结合反应。该结合反应大大提高了互补DNA链C1和C1*的局部有效浓度，导致互补DNA链杂交。杂交后的DNA链大大缩短了荧光基团与猝灭基团胶体金表面的距离，进而由于胶体金可以猝灭荧光的特性而导致荧光猝灭。
当样品中含有AFB1时，AFB1与荧光标记的AFB1抗原竞争结合胶体金表面的抗体，使荧光标记的抗原从胶体金上解离下来，荧光恢复。且AFB1含量越高，荧光强度越强。由此可通过荧光值的大小实现AFB1的定量检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明将结合诱导DNA自组装、胶体金荧光猝灭特性和免疫竞争反应结合，获得了基于结合诱导DNA组装荧光检测的小分子器件。
(2)本发明提供的检测器件包括识别元件和信号元件，所述的识别元件包括胶体金、胶体金表面修饰的与待检测小分子对应的特异性抗体和一段DNA序列即辅助探针AO；用于识别抗原和目标物，以及提供可与信号DNA组装的辅助DNA，所述的信号元件由连接DNA序列探针和信号DNA序列探针，基于DNA链互补获得，由此实现抗原的荧光标记，结构巧妙合理，便于合成。
(3)本发明结合抗原抗体特异性结合反应和结合诱导DNA组装，可大大降低荧光基团和猝灭基团之间的距离，提高了猝灭效率，降低了荧光背景值。
(4)本发明通过对应抗原抗体的选取，可实现不同小分子目标物的检测的切换。
(5)本发明为均质检测，无需任何分离步骤，操作简单，适用于现场检测。
附图说明
图1为本发明一种基于结合诱导DNA组装荧光检测小分子方法的原理图，以黄曲霉毒素B1为例；
图2传统免疫荧光检测法的原理图；
图3荧光基团和猝灭基团胶体金之间距离的估算，图示非实际比例；
图4常用免疫荧光检测法和结合诱导DNA组装荧光检测小分子法猝灭效率的比较；
图5结合诱导DNA组装荧光检测小分子方法中，黄曲霉毒素B1的线性范围。
具体实施方式
现结合附图与具体实施案例对本发明作进一步说明。
本发明提供一种基于结合诱导DNA组装荧光检测器件及检测小分子的方法，原理图如图1所示，通过抗原抗体特异性结合诱导DNA组装，大大降低荧光基团和猝灭基团之间的距离，提高荧光猝灭效率降，降低荧光背景值。本发明为均质反应，无需任何分离步骤，因此本方法具有均质、操作检测等优点。
本发明的技术方案主要包括以下内容：
DNA和抗体修饰的识别元件的制备；荧光标记抗原的信号元件的制备，以获得检测器件；
以及将上述得到的检测器件用于样品小分子含量的检测。
下面通过具体实施例以及附图对本发明做进一步阐释，但本发明的技术方案不以具体实例为限。
实施例
基于结合诱导DNA组装荧光检测黄曲霉毒素B1的检测器件及检测方法：
制备识别元件：
用抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体和辅助DNA修饰的胶体金，粒径20nm；
辅助DNA的序列为：
5’-巯基-TTTTTAGCAGTGT-3’；
胶体金先用碳酸钾溶液调节pH至8.8，加入抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，室温反应30min。单克隆抗体和胶体金的摩尔比为110：1。加入辅助DNA，室温孵育10min，辅助DNA和胶体金的摩尔比例为500：1。加入终浓度为2％的聚乙二醇20000，室温孵育30min；加入终浓度为500mM的氯化钠，室温避光孵育3h；将上述反应液以13500rpm的转速离心15min，重复3次，得到的沉淀物重新溶解在含有0.1％BSA的10mM磷酸缓冲液中，保存在4℃冰箱中备用。
制备信号元件：
用6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯处理AFB1抗原AFB1-BSA，室温反应2h后，用30kDa的超滤膜处理上述反应液，除去未反应的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯。连接DNA用现配的三(2-羧乙基)膦处理，室温反应30min后，用蛋白凝胶分离柱处理，除去未反应的三三(2-羧乙基)膦。按摩尔比例6：1的比例混合上述两种偶联物，室温反应2h后，用30kDa的超滤膜处理上述反应液，除去未反应的连接DNA，得到抗原-连接DNA偶联物。
将荧光基团(羧基荧光素)与双官能团连接链(6个碳的氨基己醇)混合，反应后获得具有氨基醇连接链的新型荧光素，再将新型荧光素与DNA链共价结合，实现DNA链的荧光修饰，即获得信号DNA。
将信号DNA按摩尔比1：1的比例加入到上述抗原-连接DNA偶联物，使连接DNA和信号DNA进行杂交，室温反应1h后，反应液用30kDa的超滤膜处理，获得纯化的抗原-连接DNA-信号DNA偶联物，即信号元件。
连接探针DNA和信号探针DNA的序列分别为：
连接DNA:5’-GGTCGTGACAGGATTTTT-巯基-3’
信号DNA:5’-TCCTGTCACGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACTGCT-荧光基团-3’
具体应用
荧光强度-小分子浓度关系曲线的获得方法：用空白样品提取液加标配制一系列待测小分子的标准品溶液，在上述加标样品提取液中加入识别元件和信号元件，识别元件和信号元件按照2.5：1的摩尔比例，反应1h后，读取荧光强度，以标准品浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制荧光强度-小分子浓度关系曲线；一系列待测小分子的标准品溶液的终浓度分别为5，10，20，30，40，50nM。
将识别元件和信号元件按照2.5：1的摩尔比例，加入到样品提取液中，室温反应1h，检测荧光强度，基于上述荧光强度-小分子浓度关系曲线分析得到AFB1的含量。
荧光测定及分析：
结果如图2，3，4，5所示。图2所示为传统的免疫荧光检测法的原理，本发明与传统免疫荧光检测法相比，引入了结合诱导DNA组装的技术。如图3，4所示，本发明与传统的免疫荧光检测法相比，大大缩短了荧光基团和猝灭基团之间的距离，提高了荧光猝灭的效率，降低了荧光背景值。又如图5所示，本发明在黄曲霉毒素B1检测中，其线性良好且线性范围为5-50nM，检测限以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差进行计算为2.3nM。

Claims (10)

1.一种结合诱导DNA组装荧光检测器件，其特征在于：包括识别元件和信号元件，所述的识别元件包括胶体金、胶体金表面修饰的与待检测小分子对应的特异性抗体和一段DNA序列即辅助探针AO；所述的信号元件包括DNA序列，DNA序列一端标记有荧光基团，另一端连接有待检测小分子抗原，标记有荧光基团一端处的一段DNA序列C1*和辅助探针AO自由端处的一段序列C1互补，信号元件的中部可自由弯曲。
2.根据权利要求1所述的检测器件，其特征在于：所述的信号元件包含抗原和两个DNA序列探针：连接探针LO和信号探针SO；连接探针LO上连接有待检测小分子抗原；信号探针SO含有三部分，信号探针的一端标记有荧光基团，标记有荧光基团一端处的一段DNA序列C1*和信号探针另一端处的一段DNA序列C2*分别与AO自由端处的一段序列C1和连接探针LO自由端处的一段序列C2互补，信号探针的中部可自由弯曲。
3.根据权利要求1或2所述的检测器件，其特征在于：所述信号探针的中部为由多个T碱基形成的可自由弯曲的臂。
4.根据权利要求1所述的检测器件，其特征在于：所述的待检测小分子为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素真菌毒素，与待检测小分子对应的特异性抗体分别为抗黄曲霉毒素抗体、抗赭曲霉毒素抗体、抗玉米赤霉烯酮抗体和抗T-2毒素抗体。
5.根据权利要求1所述的检测器件，其特征在于：待检测小分子抗原与连接探针通过共价结合连接；所述的荧光基团为Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素荧光基团。
6.根据权利要求1所述的检测器件，其特征在于：
所述的辅助探针AO的DNA序列为：5’-巯基-TTTTTAGCAGTGT-3’；
所述连接探针的DNA序列和信号探针的DNA序列分别为：
连接DNA:5’-GGTCGTGACAGGATTTTT-巯基-3’；
信号DNA:5’-TCCTGTCACGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACTGCT-荧光基团-3’。
7.权利要求1所述的检测器件的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)识别元件的制备：
胶体金修饰抗体和辅助探针。
(2)信号元件的制备：
在连接探针DNA上结合抗原，得到抗原-连接DNA偶联物；
信号探针DNA上修饰荧光基团，然后将荧光基团修饰的信号探针DNA加入到上述抗原-连接探针DNA偶联物，使连接DNA和信号DNA进行杂交，后处理获得纯化的抗原-连接DNA-信号DNA偶联物，即信号元件。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)为；将胶体金先加碱用调节pH值至6.0-9.0，加入抗体，室温反应一段时间，反应时间为20min-60min；抗体和胶体金的摩尔比为50：1至110：1；然后加入辅助探针DNA，室温孵育一段时间，辅助DNA和胶体金的摩尔比例为200：1至1000：1，加入PEG 20000，室温孵育一段时间，；加入NaCl，室温避光孵育；离心得到的沉淀物重新溶解在含有0.1％BSA的10mM PBS缓冲液中，保存在4℃冰箱中备用；
所述荧光基团修饰的信号探针DNA和上述抗原-连接探针DNA偶联物的摩尔比1：1；
所述的抗原结合方法为：将抗原用6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯偶联剂进行活化，连接DNA用三(2-羧乙基)膦进行活化，将活化后的抗原和连接DNA混合，通过共价结合实现抗原-连接DNA偶联物的制备。
9.一种基于权利要求1所述的结合诱导DNA组装荧光检测器件检测小分子的方法，其特征在于：包括以下步骤：
将识别元件和信号元件加入到待测样品提取液中，室温反应；
测试反应体系的荧光强度，基于荧光强度-小分子浓度关系曲线，获得待测样品提取液中小分子的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述荧光强度-小分子浓度关系曲线的获得方法：用空白样品提取液加标配制一系列待测小分子的标准品溶液，在上述加标样品提取液中加入识别元件和信号元件，反应一段时间后，读取荧光强度，以标准品浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制荧光强度-小分子物质浓度信号响应曲线；所述一系列待测小分子的标准品溶液的终浓度分别为5，10，20，30，40，50nM。
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