CN109061187A - 一种基于功能化纳米二氧化硅的临床药物分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于人血清白蛋白功能化纳米二氧化硅(nano‑SiO2)的临床药物分析方法。该方法基于配体竞争原理，通过药物和辣根过氧化物酶标记的药物竞争性地与人血清白蛋白功能化的纳米二氧化硅(HSA‑SiO2)结合，经离心、洗涤、底物显色后实现对临床样本中药物的定量分析。该方法具有高准确度、廉价、快速、不需要昂贵仪器等特点，为临床样品中药物的检测提供了一个新的方法。

Description

一种基于功能化纳米二氧化硅的临床药物分析方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体而言，涉及一种基于功能化纳米二氧化硅(nano-SiO2)的临床药物分析方法。
背景技术
目前，临床药物的含量测定，主要是色谱法(及色谱质谱联用法)和免疫分析法。这些方法都具有实际应用上的限制，比如色谱法需要昂贵的仪器，复杂的样品前处理步骤、费时、检测限高；而免疫分析法由于需要其相应的抗体，导致批次重现性差、检测成本很高。因此，急需一个相对前处理简单、选择性高、检测成本低且费时短的方法实现对临床药物的含量测定。
人血清白蛋白(HSA)是人血清中的一个优秀的运输蛋白，它与某些小分子药物之间有很高的亲和作用，而且专属性和选择性也很高。因此，利用便宜、易得的HSA代替昂贵的抗体，建立对临床药物的酶联配体分析法。与常规免疫分析法相比，由于HSA代替了昂贵的抗体，因此，大大降低了检测费用。
纳米材料拥有巨大的比表面积，可显著提高分析效率。由于纳米二氧化的生物相容性好，因此，我们采用纳米二氧化硅作为HSA的固相载体。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种人血清白蛋白功能化纳米二氧化硅新材料(HSA-SiO2)，该材料处于纳米级，以其为固定相建立的酶联分析方法，比传统的96孔板为固定相的方法具有更高的反应传质系数和稳定性。
本发明的第二目的在于提供一种HSA-SiO2的制备方法，这种制备方法在水相体系中反应，一步缩合而成，步骤简单、反应条件不苛刻，容易实现，适合工业大生产。
本发明的第三目的在于提供一种临床药物分析的新方法，即用HSA-SiO2通过配体竞争，来检测待测样品中药物的含量。该方法具有高准确度、廉价、快速、不需要昂贵仪器等特点，为临床样品中药物的检测提供了一个新的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种人血清白蛋白功能化纳米二氧化硅(HSA-SiO2)的制备方法，具体为：将1g氨基修饰的纳米SiO2分散于10mL PBS中，50mg HSA溶于40mL PBS中，然后将二者混合，室温下搅拌4h。400mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和250mg N-羟基琥珀亚胺溶液2mL PBS，然后逐滴加入到上述混合液中，室温下搅拌12h。随后离心除去上清液，沉淀分散于100mL 5％的脱脂奶粉中，室温下温和搅拌4h。然后离心，沉淀用PBS洗涤三次，冻干即得。放于4℃下保存备用。
临床药物的分析新方法过程，其包括：
步骤a：制备辣根过氧化物酶标记的药物(HRP-drug)：0.1mM待测药物溶于4mL DMF中，在冰浴下加入0.11mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐并搅拌15min，随后向中加入0.11mM N-羟基琥珀亚胺，于冰浴下搅拌过夜。然后将反应液在4000rpm下离心5min，在冰浴条件下，将上清液逐滴加入到10mL 1mg/mL的辣根过氧化物酶溶液中，随后室温下搅拌12h。然后将反应液在4℃下用PBS透析24h，即得到辣根过氧化物酶标记的药物(HRP-drug)，放于4℃下保存备用。
步骤b：将待测药物(drug)样品与所述辣根过氧化物酶标记的药物(HRP-drug)混合，震荡反应5-10min；随后，再与所述人血清白蛋白功能化的纳米二氧化硅(HSA-SiO2)，震荡反应5-10min，离心，沉淀用PBS(20mM，pH7.4)离心洗涤三次。
步骤c：最后将沉淀分散于1mL底物溶液中，室温下显色15min，随即加入0.5mL的终止液，经离心后，检测上清液在450nm处的吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中药物的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
a.较之色谱法(及色谱质谱联用法)，不需要昂贵的仪器(仅需紫外分光光度计)、样品前处理步骤简单、分析检测过程迅速、检测限低。
b.较之免疫分析法，用便宜、易得的HAS代替药物的抗体，从而大大降低了检测成分。
c.纳米材料的引入，大大提高了检测过程的传质系数，从而显著提高了分析效率和分析的均匀性与重现性。
用人血清白蛋白功能化纳米二氧化硅(HSA-SiO2)来检测临床药物的原理是：由于药物(drug)与人血清白蛋白(HSA)具有强烈的配体——受体相互作用，待测样品中的药物(drug)与加入的定量HRP-drug竞争性地与HSA-SiO2结合，分别形成drug-HSA-SiO2复合物和drug-HRP-HSA-SiO2复合物；离心、洗涤后，在所得到的drug-HRP-HSA-SiO2中加入HRP的底物(3,3′5,5′-四甲基联苯胺，TMB)，形成的产物呈蓝色，随后用H2SO4终止反应，TMB的产物由蓝色变为黄色。采用比色法测反应液在450nm处的吸光度，将其数值带入由系列标准溶液采用同样检测方法所得的标准曲线中，即可得出待测样品中药物的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为HSA-SiO2的透射电镜图；
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施方式提供一种人血清白蛋白功能化的纳米二氧化硅(HSA-SiO2)的制备方法：
将1g氨基修饰的纳米SiO2(NH2-SiO2)分散于10mL PBS中，50mg HSA溶于40mL PBS中，然后将二者混合，室温下搅拌4h。400mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和250mg N-羟基琥珀亚胺溶液2mL PBS，然后逐滴加入到上述混合液中，室温下搅拌12h。随后离心除去上清液，沉淀分散于100mL 5％的脱脂奶粉中，室温下温和搅拌4h。然后离心，沉淀用PBS洗涤三次，冻干即得。放于4℃下保存备用。
利用透射电镜对HSA-SiO2材料进行了表征，如图1所示，可知其粒径在100nm左右，表面上具有很多的凸起，是由于HSA键合在了nano-SiO2的表面。利用热重分析仪对HSA-SiO2材料进行了表征，通过对NH2-SiO2与HSA-SiO2的热重分析，二者的失重曲线是有明显的不同的，HSA-SiO2的失重情况明显重于NH2-SiO2，这是由于二者表面的有机物含量的不同。由此，可以表明HAS成功偶联在了nano-SiO2的表面。
实施例2
本实施方式提供一种辣根过氧化物酶标记的萘普生(HRP-Naproxen)的制备方法：
为测定萘普生(Naproxen)含量，以萘普生为被标记药物。取0.1mM萘普生溶于4mLDMF中，在冰浴下加入0.11mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐并搅拌15min，随后向中加入0.11mM N-羟基琥珀亚胺，于冰浴下搅拌过夜。然后将反应液在4000rpm下离心5min，在冰浴条件下，将上清液逐滴加入到10mL 1mg/mL的辣根过氧化物酶溶液中，随后室温下搅拌12h。然后将反应液在4℃下用PBS透析24h，即得到辣根过氧化物酶标记的萘普生(HRP-Naproxen)，放于4℃下保存备用。
用MALDI/TOF/MS对HRP和HRP-Naproxen的分子量分别进行了分析，其分子离子峰分别为43291.9809和44198.9537。HRP-Naproxen较HRP的分子离子峰增大了906.9728，说明萘普生小分子成功偶联到HRP上，其偶联比为906.9728÷230.26＝3.94，即HRP上偶联了约4个萘普生分子。
实施例3
本实施方式提供一种辣根过氧化物酶标记的吲哚美辛(HRP-Indomethacin)的制备方法：
与实施例2不同的是：被标记药物为吲哚美辛(Indomethacin)。
实施例4
本实施方式提供一种辣根过氧化物酶标记的双氯芬酸(HRP-Diclofenac)的制备方法：
与实施例2不同的是：被标记药物为双氯芬酸(Diclofenac)。
实施例5
本实施方式提供一种辣根过氧化物酶标记的舒林酸(HRP-Sulindac)的制备方法：
与实施例2不同的是：被标记药物为舒林酸(Sulindac)。
实施例6
本实施方式提供一种辣根过氧化物酶标记的吉非罗齐(HRP-Gemfibrozil)的制备方法：
与实施例2不同的是：被标记药物为吉非罗齐(Gemfibrozil)。
实施例7
本实施方式提供一种辣根过氧化物酶标记的非布索坦(HRP-Febuxostat)的制备方法：
与实施例2不同的是：被标记药物为非布索坦(Febuxostat)。
实施例8
本实施方式提供一种尿液中萘普生(Naproxen)的检测方法：
步骤a：样品测定
将向1mL尿液中加入0.5mL HRP-Naproxen液，震荡反应8min；随后，加入，震荡反应5-10min，离心，沉淀用PBS(20mM，pH 7.4)离心洗涤三次后，将沉淀分散于1mL底物溶液中，室温下显色15min，随即加入0.5mL的终止液，经离心后，检测上清液在450nm处的吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中萘普生的含量为53.22ng/mL。
步骤b：建立标准曲线
类似样品测定的操作，以萘普生的浓度做横坐标，用结合率B/B0(B0为萘普生浓度为0ng/mL时的吸光度值，B为不同萘普生浓度对应的吸光度值)为纵坐标，二元一次线性回归得到y＝-0.013x+0.988(R2＝0.998)，线性检测范围为5-70ng/mL，在该范围内线性关系良好。
步骤c：方法的验证考察
精密度的验证是通过日内试验和日间试验的变异系数加以验证，其结果如表1所示：日内试验是通过在12h内重复测定三种不同浓度(15ng/mL、30ng/mL、60ng/mL)的萘普生标准液9次完成，其CV分别为2.3％、3.9％及2.0％。日间试验是通过在七天内分别测定这三种完成，其CV分别为3.4％、3.5％及2.5％。二者的CV均小于5％，说明该方法具有较好的精密度。
表1精密度的考察结果
准确度通过添加回收率加以验证。首先将样品重复测定六次，其检测结果为187.23±3.41ng/mL，向样品中加入该浓度80％、100％及120％的萘普生标准溶液，即150ng/mL、190ng/mL及225ng/mL，然后按照建立的方法进行测定。其检测结果如表2所示：其回收率在94.49％-97.95％之间，因此该方法具有较好的准确度，可以用于尿液中萘普生的检测。
表2准确度的考察结果
实施例9
本实施方式提供一种尿液中吲哚美辛(Indomethacin)的检测方法：
与实施例8不同的是：用HRP-Indomethacin替代HRP-Naproxen。
实施例10
本实施方式提供一种尿液中双氯芬酸(Diclofenac)的检测方法：
与实施例8不同的是：用HRP-Diclofenac替代HRP-Naproxen。
实施例11
本实施方式提供一种尿液中舒林酸(Sulindac)的检测方法：
与实施例8不同的是：用HRP-Sulindac替代HRP-Naproxen。
实施例12
本实施方式提供一种尿液中吉非罗齐(Gemfibrozil)的检测方法：
与实施例8不同的是：用HRP-Gemfibrozil替代HRP-Naproxen。
实施例13
本实施方式提供一种尿液中非布索坦(Febuxostat)的检测方法：
与实施例8不同的是：用HRP-Febuxostat替代HRP-Naproxen。

Claims (7)

1.一种基于功能化纳米二氧化硅的临床药物分析方法，其特征在于，基于配体竞争原理，通过药物和辣根过氧化物酶(HRP)标记的药物竞争性地与功能化的纳米二氧化硅结合，经离心、洗涤、底物显色后实现对临床样本中药物的定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于功能化纳米二氧化硅的临床药物分析方法，其特征在于，所述功能化的纳米二氧化硅为人血清白蛋白(HSA)功能化的纳米二氧化硅(HSA-SiO2)。
3.根据权利要求2所述的人血清白蛋白(HSA)功能化的纳米二氧化硅(HSA-SiO2)制备方法，其特征在于，将HAS与预先氨基修饰的纳米二氧化硅化学偶联而得。
4.根据权利要求1所述的一种基于功能化纳米二氧化硅的临床药物分析方法，其特征在于，所述临床药物为血浆蛋白结合率大于90％的、且带有游离羧酸基团的药物。
5.根据权利要求4所述的一种基于功能化纳米二氧化硅的临床药物分析方法，其特征在于，所述临床药物为萘普生、吲哚美辛、双氯芬酸、舒林酸、吉非罗齐或非布索坦。
6.根据权利要求1所述的辣根过氧化物酶(HRP)标记的药物，其特征在于，将药物分子中的游离羧酸基与HRP分子中的游离氨基，通过缩合脱水的方式，偶联所得。
7.根据权利要求1所述的一种基于功能化纳米二氧化硅的临床药物分析方法，其特征在于，其包括：
步骤a：制备人血清白蛋白功能化的纳米二氧化硅(HSA-SiO2)
步骤b：制备辣根过氧化物酶标记的药物(HRP-drug)；
步骤c：将待测药物(drug)样品与所述辣根过氧化物酶标记的药物(HRP-drug)混合，震荡反应5-10min；随后，再与所述人血清白蛋白功能化的纳米二氧化硅(HSA-SiO2)，震荡反应5-10min，离心，沉淀用PBS(20mM，pH 7.4)离心洗涤三次。
步骤d：最后将沉淀分散于1mL底物溶液中，室温下显色15min，随即加入0.5mL的终止液，经离心后，检测上清液在450nm处的吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中药物的含量。
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