JP5188706B2 - ポリジアセチレン超分子体とリガンド検出方法。 - Google Patents

ポリジアセチレン超分子体とリガンド検出方法。 Download PDF

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Description

本発明は、ポリジアセチレン(polydiacetylene)超分子体にレセプターを固定化した色転移センサ、及びこれを利用した生化学的分析方法に関する。{COLORIMETRIC SENSOR USING POLYDIACETYLENE SUPRAMOLECULE}
一般に、抗体を利用した定量分析方法は、酵素免疫測定法(Enzyme Immunoassay、EI)、 ELISA(Enzyme−Linked Immunosorbent Assay)及び放射免疫測定法(Radio Immunoassay、RIA)などがある。これら方法のうち、ELISA法は抗体に酵素を結合させて抗原−抗体反応を確認する方法であって、比較的に簡単であり、多くの費用がかからず、多量分析が可能であるため、現在、最も広く利用される方法の一つである。特に、ELISA法は、放射免疫測定法(RIA、Radio Immunoassay)に匹敵する水準の敏感度(sensitivity)を有しながらも、放射能を用いないという点で大きな長所を有していて、その利用が増加している。しかし、ELISA法は、分析に多量の試料を要求し、時間が長くかかり、いろいろな段階の過程を経なければならないという短所がある。また、最も敏感度が高い方法である放射免疫測定法は、放射能物質による危険が問題となる。
最近、このような従来の技術の問題点を解決するために、同位元素、蛍光、酵素反応を利用して信号変換が可能な分析方法が提案された。しかし、これら方法のうち、同位元素測定法は安全性に問題があり、酵素反応測定法は分析範囲が狭くて多様な濃度で存在する試料を分析することに適合せず、蛍光測定法は高価の蛍光物質を検出蛋白質に再び結合させて用いなければならないという問題点がある。このような問題点を解決するために、ポリジアセチレンを利用するような非標識(Label−free)検出方式が提案された。
ポリジアセチレンは、3重結合が交互にあるジアセチレン(diacetylene)単量体の高分子を意味する。ジアセチレンは、これの両性性質によって水溶液上でリポソーム、Langmuir−Blodgett(LB)またはLangmuir−Schaeffer(LS)単分子膜のような超分子体を形成することと知られた。超分子体を構成したジアセチレンは254nmのUV光に露出する場合、隣接ジアセチレン間に高分子化反応が起こりながら青色を帯びるようになる。また、高分子化されたポリジアセチレン超分子体は温度、pH、摩擦、界面活性剤または溶媒などの刺激を受ければ、赤色に色転移する特性を有する。ポリジアセチレンの色転移は、高分子結合のπ−縮合(conjugation)の長さ、これによる分子がとる構造に従う。したがって、ポリジアセチレン高分子結合の変化を利用した多様な形態のセンサ製造が可能である。例えば、細胞または蛋白質と特異的に結合できる分子をジアセチレンまたは他の脂質分子の末端基に化学合成によって導入した後、これを他のジアセチレンと混合してリポソームを製造して、インフルエンザウイルス、コレラ毒素、大腸菌などを検出することができるバイオセンサを製作することができる。しかし、前記ポリジアセチレンバイオセンサは、分析対象によってレセプターの機能をする脂質分子を新しく合成しなければならないという面倒さがある。
そのため、本発明者は、チオール(-thiol)と迅速で選択的に反応できるジアセチレン−マレイミド分子を利用してポリジアセチレン超分子体を製作し、分析対象によって適合した抗体または他のレセプターを選択してポリジアセチレンに固定化した後、抗原またはリガンドが含まれた試料と反応させてポリジアセチレン超分子体の色転移を確認することによって本発明を完成した。
本発明の目的は、チオール基を有するレセプター分子を固定化することができるポリジアセチレン超分子体を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、ポリジアセチレン超分子体に検出しようとする目的物質(リガンド)に応じて適合したチオール系レセプターを固定化したポリジアセチレン超分子体に基づいたセンサを提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、ポリジアセチレン超分子体に基づいたセンサと、検出しようとする目的物質(リガンド)を含む試料とを反応させて目的物質を検出する生化学的分析方法を提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明のポリジアセチレン超分子体は、
下記の化学式1
Figure 0005188706
で表される、チオールと反応性がない−COOH末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式2
Figure 0005188706
で表される、チオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体とを混合して製造した、チオール基を有するレセプター分子を固定化することができる。
また、チオールに対して反応性がない−COOH末端を有するジアセチレン単量体が
0、12−ペンタコサジイン酸(pentacosadiynoic acid;PCDA)であり、チオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体
CDA−マレイミド(maleimide)であることを特徴とする。
また、レセプター(receptor)がチオエステル(thioester)結合または二黄(disulfide)結合によって表面に固定化されたことを特徴とする。
また、レセプターは、抗体、単クローン抗体、F(ab)、F(ab´)、アプタマー、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物であることを特徴とする。
また、i)下記の化学式1
Figure 0005188706
で表される、−COOH末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式2
Figure 0005188706
で表される、チオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体とを混合して、リポソーム、ミセル、Langmuir BlodgettフィルムまたはLangmuir Schaefferフィルムのポリジアセチレン超分子体を形成する段階と、
ii)レセプターのチオール作用基を利用して超分子体にレセプターを固定化する段階と、
iii)段階ii)の超分子体にUV光を照射して超分子体を高分子化する段階と、
iv)高分子化された超分子体と試料を反応させて色転移を確認する段階とを含んで、試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。
また、レセプターは、抗体、単クローン抗体、F(ab)、F(ab´)、アプタマー、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項5に記載の試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。
また、リガンドは、バクテリア、病原性微生物、ウイルス、蛋白質、毒素、ペプチド、ホルモン、酵素、毒性化合物またはこれらの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項5または6に記載の試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。
また、高分子化された超分子体と試料の反応が、マイクロウェルプレート(micro−well plate)で行われることを特徴とする請求項5または6に記載の試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。
また、チオールに対する反応性がないジアセチレン単量体が、10、12−ペンタコサジイン酸、5、7−エイコサジエン酸(eicosadiynoic acid)、2、4−ヘプタコサジエン酸(heptacosadiynoic acid)またはこれらの混合物であることを特徴とする。
また、チオールと反応できる脂質分子は、ジアセチレンまたは他の脂質分子の末端基にマレイミド、ヨードアセチル(Iodoacetyl)、アジリジン(aziridine)、アクリロイル(acryloyl)、フロロベンゼン(fluorobenzene)、 TNB−チオール、ジチオピリジン(dithiopyridine)作用基を有する分子である。
例えば、チオールと反応できる脂質分子は、ジアセチレンまたは他の脂質分子の末端に、(A)アクリロイル(acryloyl)基、並びに、(B)マレイミド、ヨードアセチル(Iodoacetyl)、アジリジン(aziridine)、フロロベンゼン(fluorobenzene)、TNB−チオール、及び、ジチオピリジン(dithiopyridine)からなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物の末端の水素原子が除かれた基(作用基)を有する分子であることを特徴とする。
また、色転移が、ポリジアセチレン超分子体のうちのチオールと反応できる脂質分子のモル比に容量依存的に比例することを特徴とする請求項5または6に記載の試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。
本発明のチオール基を有するレセプター分子を固定化させることができるポリジアセチレン超分子体は、適合したレセプターを容易にポリジアセチレン超分子体の表面に固定化させてリガンド検出に利用できる。したがって、本発明によれば、リガンドに応じて適合したレセプターを容易に選択して試料分析に利用することができる。
本発明においては、末端にマレイミドのようなチオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレンを化学的に合成して利用する。
両性ジアセチレンは、両性性質によって水溶液と界面を形成するので、リポソーム、ミセル、Langmuir BlodgettまたはLangmuir Schaefferフィルムのような超分子体によって自己組み立ての誘導が可能である。超分子体を形成する時、ジアセチレン単量体の間の距離が十分に狭ければ、254nmのUV光によって高分子化でき、この時、新しく形成された高分子結合によって青色を帯びるようになる。ここで、高分子結合の色は、結合に参加するπ−縮合(conjugation)と密接な関連があり、外部刺激によって高分子の単量体の再配列が起き、π−縮合が短くなりながら刺激の程度によって順次に赤色への色転移現象を見せる。色転移を起こせる一般的な刺激は、温度、pH、表面摩擦、有機溶媒または界面活性剤との相互作用があり、その他の超分子体の単量体を化学的に変形してレセプターが超分子体界面に導出されるように設計する場合、レセプターがリガンドと反応して色転移が誘導されるバイオセンサ、または生化学的分析技術として利用できる。
一つの具体的な例として、本発明は下記の化学式1
Figure 0005188706
で表される−COOH末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式2
Figure 0005188706
で表されるチオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体とで構成されたポリジアセチレン超分子体(例えば、リポソーム、ミセル、LBフィルム、LSフィルム)を提供する。
なお、上記化学式2のRは、ジアセチレン単量体10、12−ペンタコサジイン酸(PCDA)の構造を示し、上記化学式2のRは、チオール基と反応できる脂質分子のいくつかの例を示す。
このように、本発明において、ジアセチレン単量体は、10、12−ペンタコサジイン酸(pentacosadiynoic acid)、5、7−エイコサジエン酸(eicosadiynoic acid)、2、4−ヘプタコサジエン酸(heptacosadiynoic acid)またはこれらの混合物を含むが、末端基が−COOHに限定されない。また、本発明において、脂質分子の末端基は、マレイミド、ヨードアセチル(Iodoacetyl)、アジリジン(aziridine)、アクリロイル(acryloyl)、フロロベンゼン(fluorobenzene)、TNB−チオール、及びジチオピリジン(dithiopyridine)に由来する基を含む。
本発明において、ポリジアセチレン超分子体内のチオールと反応する分子のスペーサの長さ(上記化学式でR)を調節することによって、センサの敏感度を調節することができる。
また、本発明は、チオール基を有するレセプターがチオエステルまたは二黄結合によって表面に固定化されたポリジアセチレン超分子体を提供する。本発明でレセプターは、抗体、単クローン抗体、F(ab)、F(ab´)、アプタマー(aptamer)、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物を含む。
また、本発明は、(a)化学式1で表される−COOH末端を有するジアセチレン単量体と、化学式2で表されるチオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体とを特定比率で混合した超分子体(例えば、リポソーム、ミセル、LB、LSフィルム)を製作する段階、(b)レセプター、例えば、抗体を還元剤と反応させて二硫化物(disulfide)を酸化させてレセプターにチオール基を表出させたり、化学反応によってチオール基を導入させる段階、(c)還元されたレセプター、例えば、抗体と前記超分子体を反応させてレセプターのチオールと超分子体の脂質分子間にチオエステル結合生成を誘導してレセプターを固定化する段階、(d)前記超分子体を254nmのUV光で高分子化する段階、及び(e)前記超分子体を試料と接触させて色転移を観察し、試料内のリガンドの存在を定性及び定量的に分析する段階を含む生化学的バイオセンサ及び分析技術を提供する。
本発明において、リガンドは、バクテリア、病原性微生物、ウイルス、蛋白質、毒素、ペプチド、ホルモン、酵素、毒性化合物またはこれらの一つ以上の混合物を含む。したがって、本発明はポリジアセチレンバイオセンサ、つまり、チオールと化学的結合が可能なジアセチレンまたは脂質分子を利用してレセプターを固定化したバイオセンサ、及びこれを利用した生化学的分析または診断方法を提供する。
また、本発明のポリジアセチレン超分子体を利用した試料分析は、マイクロウェルプレート(micro−well plate)で行われることができるのはもちろんである。
以下、本発明の理解のために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施形態は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明が下記の実施形態に限られるわけではない。
[実施例:液状でポリジアセチレンリポソームと抗体を利用した病原性細菌の検出法]
〔実施例1〕
リポソームの製作
ガラス瓶内のクロロホルムにPCDAとPCDA−マレイミドジアセチレン単量体を1:9、2:8または3:7に混合した後、クロロホルムを窒素ガスまたは回転蒸発(rotary evaporation)によって蒸発させ、前記2成分で構成された薄いフィルムを形成した。次に、10mM HEPES緩衝液(pH=7.4)を入れて80℃以上の高温で15分間徐々に振りながらフィルムを浮遊させた後、プローブソニケーション(probe sonication)によって30Wで20分間処理した。製作されたリポソームを約4時間冷蔵保管した後、次の実験に用いた。
〔実施例2〕
抗体還元及び抗体固定化
0.3mg/mL濃度のクリプトスポリジウムパルブム(Cryptosporidium parvum)に対する単クローン抗体(Waterborne Inc.,USA)を20mM TCEP(Tris2−carboxyethyl phosphine)と1:1に混合した後、1時間室温で反応させた。アミコーン(Amicon)の30kDa MWCO(分画分子量)フィルターを利用して0.02mM TCEPが含まれたHEPES緩衝液で緩衝交換(buffer exchange)を行った。前記方法によって処理した抗体を最終濃度が0.1mg/mLになるように前記実施例1のリポソーム溶液と混合し、室温で3時間反応させた。次に、L−システイン(L−cysteine)を1mM最終濃度で添加してリポソームの残余マレイミド作用基をキャッピング(capping)した。
〔実施例3〕
抗体が固定化されたリポソームを利用した病原性細菌の感知
抗体−ポリジアセチレンリポソームを254nmのUV光に露出させる場合、青色を帯びる溶液が生成することを確認した。この溶液50μLとクリプトスポリジウムパルブム(C.parvum)が含まれたHEPES緩衝液100μLを混合し、37℃で2時間30分以上反応させれば、クリプトスポリジウムパルブムの濃度によって抗体−ポリジアセチレンリポソームの色が青色から紫色または赤色に変化することが観察された(図1参照)。図1において、第1〜第3行はリポソームに各々10、20及び30mol%PCDA−マレイミドで構成されたリポソームセンサを示す。第1列は緩衝液、2〜4列は各々10、10及び10/mL濃度のクリプトスポリジウムパルブムが含まれた緩衝液、そして第6列は10/mL濃度のバシラス(Bacillus)胞子が含まれた緩衝液に対するリポソームの色反応を示す。
写真に現れた溶液を数値化してリガンドの濃度に対する標準曲線を示している。UV−Vis吸光度計で400〜700nmの領域をスキャニングした後、550nmと650nm付近の吸収ピークの相対値を計算することで、次のように色転移度(colorimetric response、CR)を数値化することができる。
Figure 0005188706
この時、Bは溶液の色指数であって、BとBはそれぞれ分析対象(analyte)を入れる前と後の色指数を示す。色指数の算出に当たって、A650とA550は各々650と550nm近くの吸収ピークの最大吸光度を意味する。
図2に示したように、PCDA−マレイミドの含量(mol%)が高くなるほど、バイオセンサの敏感度が向上することを確認した。これは、本発明のポリジアセチレン超分子体を利用したセンサの敏感度がポリジアセチレン超分子体内のチオールと反応できる脂質分子のモル比に容量依存的に比例することを意味する。図2において、横軸はC.parvum ooystの濃度を示し、縦軸は上記数式1によって数値化した色転移度を示す。図2において、(▲)は30mol%のPCDA−マレイミドで構成されたリポソームセンサ、(■)は20mol%のPCDA−マレイミドで構成されたリポソームセンサ、(●)は10mol%のPCDA−マレイミドで構成されたリポソームセンサをそれぞれ意味する。
色転移センサに使用できる。
ポリジアセチレンリポソームにクリプトスポリジウムパルブム(Cryptosporidium parvum)に対する単クローン抗体を結合させたバイオセンサを示す。 クリプトスポリジウムパルブムに対する単クローン抗体を結合させたバイオセンサの色変化を百分率で数値化したグラフを示す。

Claims (11)

  1. 下記の化学式1
    Figure 0005188706
    で表される、チオールと反応性がない−COOH末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式2
    Figure 0005188706
    で表される、チオールと反応できる作用基を有するジアセチレン単量体とを混合して製造した、チオール基を有するレセプター分子を固定化することができるポリジアセチレン超分子体。
  2. チオールに対して反応性がない−COOH末端を有するジアセチレン単量体が、10,12−ペンタコサジイン酸(pentacosadiynoic acid;PCDA)であり、チオールと反応できる作用基を有するジアセチレン単量体がPCDA−マレイミド(maleimide)であることを特徴とする請求項1に記載のポリジアセチレン超分子体。
  3. 上記チオールに対する反応性がないジアセチレン単量体が、10,12−ペンタコサジイン酸、5,7−エイコサジエン酸(eicosadiynoic acid)、2,4−ヘプタコサジエン酸(heptacosadiynoic acid)またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項1に記載のポリジアセチレン超分子体。
  4. 上記チオールと反応できるジアセチレン単量体は、ジアセチレンの末端基にマレイミド、ヨードアセチル(Iodoacetyl)、アジリジン(aziridine)、アクリロイル(acryloyl)、フロロベンゼン(fluorobenzene)、TNB−チオール(2-nitro-5-thiolbenzoic acid-thiol)、またはジチオピリジン(dithiopyridine)作用基を有する分子であることを特徴とする請求項1に記載のポリジアセチレン超分子体。
  5. 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリジアセチレン超分子体の表面に、レセプター(receptor)がチオエステル(thioester)結合または二黄(disulfide)結合によって固定化されたものであることを特徴とするバイオセンサ
  6. 上記レセプターは、抗体、単クローン抗体、F(ab)、F(ab´) 、アプタマー、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項5に記載のバイオセンサ
  7. 試料からポリジアセチレン超分子体に固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するためのリガンド検出方法であって、
    i)下記の化学式1
    Figure 0005188706
    で表される、チオールと反応性がない−COOH末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式2
    Figure 0005188706
    で表される、チオールと反応できる作用基を有するジアセチレン単量体とを混合して、リポソーム、ミセル、ラングミュア プロジェット(Langmuir Blodgett)フィルムまたはラングミュア シェーファー(Langmuir Schaeffer)フィルムのポリジアセチレン超分子体を形成する工程と、
    ii)レセプターのチオール作用基を利用して超分子体にレセプターを固定化する工程と、
    iii)段階ii)の超分子体にUV光を照射して超分子体を高分子化する工程と、
    iv)高分子化された超分子体と試料を反応させて色転移を確認する工程とを含むことを特徴とするリガンド検出方法。
  8. レセプターは、抗体、単クローン抗体、F(ab)、F(ab´)、アプタマー、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項7に記載のリガンド検出方法。
  9. リガンドは、バクテリア、病原性微生物、ウイルス、蛋白質、毒素、ペプチド、ホルモン、酵素、毒性化合物またはこれらの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項7または8に記載のリガンド検出方法。
  10. 高分子化された超分子体と試料の反応が、マイクロウェルプレート(micro−well plate)で行われることを特徴とする請求項7または8に記載のリガンド検出方法。
  11. 色転移が、ポリジアセチレン超分子体のうちのチオールと反応できる脂質分子のモル比に容量依存的に比例することを特徴とする請求項7または8に記載のリガンド検出方法。
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