JP5188706B2

JP5188706B2 - ポリジアセチレン超分子体とリガンド検出方法。

Info

Publication number: JP5188706B2
Application number: JP2006340562A
Authority: JP
Inventors: サン−ジュン，シム; サン−ウー，リー; ジュン，アンドン; ホ，ヤンドゥ
Original assignee: ソンキュンクァンユニバーシティファウンデーションフォーコーポレイトコラボレーション
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2026-12-18
Also published as: US20070275371A1; JP2007161717A; KR100663713B1; US7776554B2

Description

本発明は、ポリジアセチレン（ｐｏｌｙｄｉａｃｅｔｙｌｅｎｅ)超分子体にレセプターを固定化した色転移センサ、及びこれを利用した生化学的分析方法に関する。｛ＣＯＬＯＲＩＭＥＴＲＩＣＳＥＮＳＯＲＵＳＩＮＧＰＯＬＹＤＩＡＣＥＴＹＬＥＮＥＳＵＰＲＡＭＯＬＥＣＵＬＥ｝

一般に、抗体を利用した定量分析方法は、酵素免疫測定法(ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＥＩ)、ＥＬＩＳＡ(Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ)及び放射免疫測定法(ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ)などがある。これら方法のうち、ＥＬＩＳＡ法は抗体に酵素を結合させて抗原−抗体反応を確認する方法であって、比較的に簡単であり、多くの費用がかからず、多量分析が可能であるため、現在、最も広く利用される方法の一つである。特に、ＥＬＩＳＡ法は、放射免疫測定法(ＲＩＡ、ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ)に匹敵する水準の敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を有しながらも、放射能を用いないという点で大きな長所を有していて、その利用が増加している。しかし、ＥＬＩＳＡ法は、分析に多量の試料を要求し、時間が長くかかり、いろいろな段階の過程を経なければならないという短所がある。また、最も敏感度が高い方法である放射免疫測定法は、放射能物質による危険が問題となる。

最近、このような従来の技術の問題点を解決するために、同位元素、蛍光、酵素反応を利用して信号変換が可能な分析方法が提案された。しかし、これら方法のうち、同位元素測定法は安全性に問題があり、酵素反応測定法は分析範囲が狭くて多様な濃度で存在する試料を分析することに適合せず、蛍光測定法は高価の蛍光物質を検出蛋白質に再び結合させて用いなければならないという問題点がある。このような問題点を解決するために、ポリジアセチレンを利用するような非標識（Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ）検出方式が提案された。

ポリジアセチレンは、３重結合が交互にあるジアセチレン（ｄｉａｃｅｔｙｌｅｎｅ）単量体の高分子を意味する。ジアセチレンは、これの両性性質によって水溶液上でリポソーム、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ（ＬＢ）またはＬａｎｇｍｕｉｒ−Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ（ＬＳ）単分子膜のような超分子体を形成することと知られた。超分子体を構成したジアセチレンは２５４ｎｍのＵＶ光に露出する場合、隣接ジアセチレン間に高分子化反応が起こりながら青色を帯びるようになる。また、高分子化されたポリジアセチレン超分子体は温度、ｐＨ、摩擦、界面活性剤または溶媒などの刺激を受ければ、赤色に色転移する特性を有する。ポリジアセチレンの色転移は、高分子結合のπ−縮合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の長さ、これによる分子がとる構造に従う。したがって、ポリジアセチレン高分子結合の変化を利用した多様な形態のセンサ製造が可能である。例えば、細胞または蛋白質と特異的に結合できる分子をジアセチレンまたは他の脂質分子の末端基に化学合成によって導入した後、これを他のジアセチレンと混合してリポソームを製造して、インフルエンザウイルス、コレラ毒素、大腸菌などを検出することができるバイオセンサを製作することができる。しかし、前記ポリジアセチレンバイオセンサは、分析対象によってレセプターの機能をする脂質分子を新しく合成しなければならないという面倒さがある。

そのため、本発明者は、チオール(-ｔｈｉｏｌ)と迅速で選択的に反応できるジアセチレン−マレイミド分子を利用してポリジアセチレン超分子体を製作し、分析対象によって適合した抗体または他のレセプターを選択してポリジアセチレンに固定化した後、抗原またはリガンドが含まれた試料と反応させてポリジアセチレン超分子体の色転移を確認することによって本発明を完成した。

本発明の目的は、チオール基を有するレセプター分子を固定化することができるポリジアセチレン超分子体を提供することにある。

また、本発明の他の目的は、ポリジアセチレン超分子体に検出しようとする目的物質（リガンド）に応じて適合したチオール系レセプターを固定化したポリジアセチレン超分子体に基づいたセンサを提供することにある。

さらに、本発明の他の目的は、ポリジアセチレン超分子体に基づいたセンサと、検出しようとする目的物質（リガンド）を含む試料とを反応させて目的物質を検出する生化学的分析方法を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明のポリジアセチレン超分子体は、
下記の化学式１

で表される、チオールと反応性がない−ＣＯＯＨ末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式２

で表される、チオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体とを混合して製造した、チオール基を有するレセプター分子を固定化することができる。

また、チオールに対して反応性がない−ＣＯＯＨ末端を有するジアセチレン単量体が、

１０、１２−ペンタコサジイン酸（ｐｅｎｔａｃｏｓａｄｉｙｎｏｉｃａｃｉｄ；ＰＣＤＡ）であり、チオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体が

ＰＣＤＡ−マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）であることを特徴とする。

また、レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）がチオエステル（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ）結合または二黄(ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ)結合によって表面に固定化されたことを特徴とする。

また、レセプターは、抗体、単クローン抗体、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ´）_２、アプタマー、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物であることを特徴とする。

また、ｉ）下記の化学式１

で表される、−ＣＯＯＨ末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式２

で表される、チオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体とを混合して、リポソーム、ミセル、ＬａｎｇｍｕｉｒＢｌｏｄｇｅｔｔフィルムまたはＬａｎｇｍｕｉｒＳｃｈａｅｆｆｅｒフィルムのポリジアセチレン超分子体を形成する段階と、
ｉｉ）レセプターのチオール作用基を利用して超分子体にレセプターを固定化する段階と、
ｉｉｉ）段階ｉｉ）の超分子体にＵＶ光を照射して超分子体を高分子化する段階と、
ｉｖ）高分子化された超分子体と試料を反応させて色転移を確認する段階とを含んで、試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。

また、レセプターは、抗体、単クローン抗体、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ´）_２、アプタマー、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項５に記載の試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。

また、リガンドは、バクテリア、病原性微生物、ウイルス、蛋白質、毒素、ペプチド、ホルモン、酵素、毒性化合物またはこれらの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項５または６に記載の試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。

また、高分子化された超分子体と試料の反応が、マイクロウェルプレート(ｍｉｃｒｏ−ｗｅｌｌｐｌａｔｅ)で行われることを特徴とする請求項５または６に記載の試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。

また、チオールに対する反応性がないジアセチレン単量体が、１０、１２−ペンタコサジイン酸、５、７−エイコサジエン酸(ｅｉｃｏｓａｄｉｙｎｏｉｃａｃｉｄ)、２、４−ヘプタコサジエン酸(ｈｅｐｔａｃｏｓａｄｉｙｎｏｉｃａｃｉｄ)またはこれらの混合物であることを特徴とする。

また、チオールと反応できる脂質分子は、ジアセチレンまたは他の脂質分子の末端基にマレイミド、ヨードアセチル(Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ)、アジリジン(ａｚｉｒｉｄｉｎｅ)、アクリロイル(ａｃｒｙｌｏｙｌ)、フロロベンゼン(ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ)、ＴＮＢ−チオール、ジチオピリジン(ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ)作用基を有する分子である。

例えば、チオールと反応できる脂質分子は、ジアセチレンまたは他の脂質分子の末端に、（Ａ）アクリロイル(ａｃｒｙｌｏｙｌ)基、並びに、（Ｂ）マレイミド、ヨードアセチル(Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ)、アジリジン(ａｚｉｒｉｄｉｎｅ)、フロロベンゼン(ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ)、ＴＮＢ−チオール、及び、ジチオピリジン(ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ)からなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物の末端の水素原子が除かれた基（作用基）を有する分子であることを特徴とする。

また、色転移が、ポリジアセチレン超分子体のうちのチオールと反応できる脂質分子のモル比に容量依存的に比例することを特徴とする請求項５または６に記載の試料からポリジアセチレンに固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するための方法である。

本発明のチオール基を有するレセプター分子を固定化させることができるポリジアセチレン超分子体は、適合したレセプターを容易にポリジアセチレン超分子体の表面に固定化させてリガンド検出に利用できる。したがって、本発明によれば、リガンドに応じて適合したレセプターを容易に選択して試料分析に利用することができる。

本発明においては、末端にマレイミドのようなチオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレンを化学的に合成して利用する。

両性ジアセチレンは、両性性質によって水溶液と界面を形成するので、リポソーム、ミセル、ＬａｎｇｍｕｉｒＢｌｏｄｇｅｔｔまたはＬａｎｇｍｕｉｒＳｃｈａｅｆｆｅｒフィルムのような超分子体によって自己組み立ての誘導が可能である。超分子体を形成する時、ジアセチレン単量体の間の距離が十分に狭ければ、２５４ｎｍのＵＶ光によって高分子化でき、この時、新しく形成された高分子結合によって青色を帯びるようになる。ここで、高分子結合の色は、結合に参加するπ−縮合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）と密接な関連があり、外部刺激によって高分子の単量体の再配列が起き、π−縮合が短くなりながら刺激の程度によって順次に赤色への色転移現象を見せる。色転移を起こせる一般的な刺激は、温度、ｐＨ、表面摩擦、有機溶媒または界面活性剤との相互作用があり、その他の超分子体の単量体を化学的に変形してレセプターが超分子体界面に導出されるように設計する場合、レセプターがリガンドと反応して色転移が誘導されるバイオセンサ、または生化学的分析技術として利用できる。

一つの具体的な例として、本発明は下記の化学式１

で表される−ＣＯＯＨ末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式２

で表されるチオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体とで構成されたポリジアセチレン超分子体（例えば、リポソーム、ミセル、ＬＢフィルム、ＬＳフィルム）を提供する。

なお、上記化学式２のＲ_３は、ジアセチレン単量体１０、１２−ペンタコサジイン酸(ＰＣＤＡ）の構造を示し、上記化学式２のＲ_４は、チオール基と反応できる脂質分子のいくつかの例を示す。

このように、本発明において、ジアセチレン単量体は、１０、１２−ペンタコサジイン酸(ｐｅｎｔａｃｏｓａｄｉｙｎｏｉｃａｃｉｄ)、５、７−エイコサジエン酸(ｅｉｃｏｓａｄｉｙｎｏｉｃａｃｉｄ)、２、４−ヘプタコサジエン酸(ｈｅｐｔａｃｏｓａｄｉｙｎｏｉｃａｃｉｄ)またはこれらの混合物を含むが、末端基が−ＣＯＯＨに限定されない。また、本発明において、脂質分子の末端基は、マレイミド、ヨードアセチル(Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ)、アジリジン(ａｚｉｒｉｄｉｎｅ)、アクリロイル(ａｃｒｙｌｏｙｌ)、フロロベンゼン(ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ)、ＴＮＢ−チオール、及びジチオピリジン(ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ)に由来する基を含む。

本発明において、ポリジアセチレン超分子体内のチオールと反応する分子のスペーサの長さ（上記化学式でＲ_３）を調節することによって、センサの敏感度を調節することができる。

また、本発明は、チオール基を有するレセプターがチオエステルまたは二黄結合によって表面に固定化されたポリジアセチレン超分子体を提供する。本発明でレセプターは、抗体、単クローン抗体、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ´）_２、アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物を含む。

また、本発明は、（ａ）化学式１で表される−ＣＯＯＨ末端を有するジアセチレン単量体と、化学式２で表されるチオールと反応できる脂質分子を有するジアセチレン単量体とを特定比率で混合した超分子体（例えば、リポソーム、ミセル、ＬＢ、ＬＳフィルム）を製作する段階、（ｂ）レセプター、例えば、抗体を還元剤と反応させて二硫化物(ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ)を酸化させてレセプターにチオール基を表出させたり、化学反応によってチオール基を導入させる段階、（ｃ）還元されたレセプター、例えば、抗体と前記超分子体を反応させてレセプターのチオールと超分子体の脂質分子間にチオエステル結合生成を誘導してレセプターを固定化する段階、（ｄ）前記超分子体を２５４ｎｍのＵＶ光で高分子化する段階、及び（ｅ）前記超分子体を試料と接触させて色転移を観察し、試料内のリガンドの存在を定性及び定量的に分析する段階を含む生化学的バイオセンサ及び分析技術を提供する。

本発明において、リガンドは、バクテリア、病原性微生物、ウイルス、蛋白質、毒素、ペプチド、ホルモン、酵素、毒性化合物またはこれらの一つ以上の混合物を含む。したがって、本発明はポリジアセチレンバイオセンサ、つまり、チオールと化学的結合が可能なジアセチレンまたは脂質分子を利用してレセプターを固定化したバイオセンサ、及びこれを利用した生化学的分析または診断方法を提供する。

また、本発明のポリジアセチレン超分子体を利用した試料分析は、マイクロウェルプレート(ｍｉｃｒｏ−ｗｅｌｌｐｌａｔｅ)で行われることができるのはもちろんである。

以下、本発明の理解のために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施形態は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明が下記の実施形態に限られるわけではない。

［実施例：液状でポリジアセチレンリポソームと抗体を利用した病原性細菌の検出法］
〔実施例１〕
リポソームの製作
ガラス瓶内のクロロホルムにＰＣＤＡとＰＣＤＡ−マレイミドジアセチレン単量体を１：９、２：８または３：７に混合した後、クロロホルムを窒素ガスまたは回転蒸発(ｒｏｔａｒｙｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ)によって蒸発させ、前記２成分で構成された薄いフィルムを形成した。次に、１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４)を入れて８０℃以上の高温で１５分間徐々に振りながらフィルムを浮遊させた後、プローブソニケーション(ｐｒｏｂｅｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ)によって３０Ｗで２０分間処理した。製作されたリポソームを約４時間冷蔵保管した後、次の実験に用いた。

〔実施例２〕
抗体還元及び抗体固定化
０．３ｍｇ／ｍＬ濃度のクリプトスポリジウムパルブム(Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ)に対する単クローン抗体(ＷａｔｅｒｂｏｒｎｅＩｎｃ．，ＵＳＡ)を２０ｍＭＴＣＥＰ(Ｔｒｉｓ２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ)と１：１に混合した後、１時間室温で反応させた。アミコーン(Ａｍｉｃｏｎ)の３０ｋＤａＭＷＣＯ（分画分子量）フィルターを利用して０．０２ｍＭＴＣＥＰが含まれたＨＥＰＥＳ緩衝液で緩衝交換（ｂｕｆｆｅｒｅｘｃｈａｎｇｅ）を行った。前記方法によって処理した抗体を最終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬになるように前記実施例１のリポソーム溶液と混合し、室温で３時間反応させた。次に、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を１ｍＭ最終濃度で添加してリポソームの残余マレイミド作用基をキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）した。

〔実施例３〕
抗体が固定化されたリポソームを利用した病原性細菌の感知
抗体−ポリジアセチレンリポソームを２５４ｎｍのＵＶ光に露出させる場合、青色を帯びる溶液が生成することを確認した。この溶液５０μLとクリプトスポリジウムパルブム（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）が含まれたＨＥＰＥＳ緩衝液１００μLを混合し、３７℃で２時間３０分以上反応させれば、クリプトスポリジウムパルブムの濃度によって抗体−ポリジアセチレンリポソームの色が青色から紫色または赤色に変化することが観察された（図１参照）。図１において、第１〜第３行はリポソームに各々１０、２０及び３０ｍｏｌ％ＰＣＤＡ−マレイミドで構成されたリポソームセンサを示す。第１列は緩衝液、２〜４列は各々１０^５、１０^６及び１０^７／ｍL濃度のクリプトスポリジウムパルブムが含まれた緩衝液、そして第６列は１０^７／ｍL濃度のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子が含まれた緩衝液に対するリポソームの色反応を示す。

写真に現れた溶液を数値化してリガンドの濃度に対する標準曲線を示している。ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度計で４００〜７００ｎｍの領域をスキャニングした後、５５０ｎｍと６５０ｎｍ付近の吸収ピークの相対値を計算することで、次のように色転移度（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＣＲ）を数値化することができる。

この時、Ｂは溶液の色指数であって、Ｂ_ＯとＢ_Ａはそれぞれ分析対象（ａｎａｌｙｔｅ)を入れる前と後の色指数を示す。色指数の算出に当たって、Ａ_６５０とＡ_５５０は各々６５０と５５０ｎｍ近くの吸収ピークの最大吸光度を意味する。

図２に示したように、ＰＣＤＡ−マレイミドの含量（ｍｏｌ％）が高くなるほど、バイオセンサの敏感度が向上することを確認した。これは、本発明のポリジアセチレン超分子体を利用したセンサの敏感度がポリジアセチレン超分子体内のチオールと反応できる脂質分子のモル比に容量依存的に比例することを意味する。図２において、横軸はＣ．ｐａｒｖｕｍｏｏｙｓｔの濃度を示し、縦軸は上記数式１によって数値化した色転移度を示す。図２において、(▲）は３０ｍｏｌ％のＰＣＤＡ−マレイミドで構成されたリポソームセンサ、(■）は２０ｍｏｌ％のＰＣＤＡ−マレイミドで構成されたリポソームセンサ、(●）は１０ｍｏｌ％のＰＣＤＡ−マレイミドで構成されたリポソームセンサをそれぞれ意味する。

色転移センサに使用できる。

ポリジアセチレンリポソームにクリプトスポリジウムパルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ）に対する単クローン抗体を結合させたバイオセンサを示す。クリプトスポリジウムパルブムに対する単クローン抗体を結合させたバイオセンサの色変化を百分率で数値化したグラフを示す。

Claims

下記の化学式１

で表される、チオールと反応性がない−ＣＯＯＨ末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式２

で表される、チオールと反応できる作用基を有するジアセチレン単量体とを混合して製造した、チオール基を有するレセプター分子を固定化することができるポリジアセチレン超分子体。
チオールに対して反応性がない−ＣＯＯＨ末端を有するジアセチレン単量体が、１０，１２−ペンタコサジイン酸（ｐｅｎｔａｃｏｓａｄｉｙｎｏｉｃａｃｉｄ；ＰＣＤＡ）であり、チオールと反応できる作用基を有するジアセチレン単量体がＰＣＤＡ−マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）であることを特徴とする請求項１に記載のポリジアセチレン超分子体。
上記チオールに対する反応性がないジアセチレン単量体が、１０，１２−ペンタコサジイン酸、５，７−エイコサジエン酸(ｅｉｃｏｓａｄｉｙｎｏｉｃａｃｉｄ)、２，４−ヘプタコサジエン酸(ｈｅｐｔａｃｏｓａｄｉｙｎｏｉｃａｃｉｄ)またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１に記載のポリジアセチレン超分子体。
上記チオールと反応できるジアセチレン単量体は、ジアセチレンの末端基にマレイミド、ヨードアセチル(Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ)、アジリジン(ａｚｉｒｉｄｉｎｅ)、アクリロイル(ａｃｒｙｌｏｙｌ)、フロロベンゼン(ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ)、ＴＮＢ−チオール（2-nitro-5-thiolbenzoic acid-thiol）、またはジチオピリジン(ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ)作用基を有する分子であることを特徴とする請求項１に記載のポリジアセチレン超分子体。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリジアセチレン超分子体の表面に、レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）がチオエステル（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ）結合または二黄(ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ)結合によって固定化されたものであることを特徴とするバイオセンサ。
上記レセプターは、抗体、単クローン抗体、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ´） _２、アプタマー、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項５に記載のバイオセンサ。
試料からポリジアセチレン超分子体に固定化されたレセプターと反応するリガンドを検出するためのリガンド検出方法であって、
ｉ）下記の化学式１

で表される、チオールと反応性がない−ＣＯＯＨ末端を有するジアセチレン単量体と、下記の化学式２

で表される、チオールと反応できる作用基を有するジアセチレン単量体とを混合して、リポソーム、ミセル、ラングミュアプロジェット（ＬａｎｇｍｕｉｒＢｌｏｄｇｅｔｔ）フィルムまたはラングミュアシェーファー（ＬａｎｇｍｕｉｒＳｃｈａｅｆｆｅｒ）フィルムのポリジアセチレン超分子体を形成する工程と、
ｉｉ）レセプターのチオール作用基を利用して超分子体にレセプターを固定化する工程と、
ｉｉｉ）段階ｉｉ）の超分子体にＵＶ光を照射して超分子体を高分子化する工程と、
ｉｖ）高分子化された超分子体と試料を反応させて色転移を確認する工程とを含むことを特徴とするリガンド検出方法。
レセプターは、抗体、単クローン抗体、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ´）_２、アプタマー、蛋白質、ペプチド、炭水化物、抗原またはこれらのうちの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項７に記載のリガンド検出方法。
リガンドは、バクテリア、病原性微生物、ウイルス、蛋白質、毒素、ペプチド、ホルモン、酵素、毒性化合物またはこれらの一つ以上の混合物であることを特徴とする請求項７または８に記載のリガンド検出方法。
高分子化された超分子体と試料の反応が、マイクロウェルプレート(ｍｉｃｒｏ−ｗｅｌｌｐｌａｔｅ)で行われることを特徴とする請求項７または８に記載のリガンド検出方法。
色転移が、ポリジアセチレン超分子体のうちのチオールと反応できる脂質分子のモル比に容量依存的に比例することを特徴とする請求項７または８に記載のリガンド検出方法。