KR100663713B1 - 신규한 폴리디아세틸렌 초분자체 색 전이 센서 - Google Patents

신규한 폴리디아세틸렌 초분자체 색 전이 센서 Download PDF

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supramolecular
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thiol
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안동준
양두호
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성균관대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 티올기를 가진 리셉터 분자를 고정화할 수 있는, 디아세틸렌 분자들로 구성된 폴리디아세틸렌 초분자체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리디아세틸렌 초분자체는 항체와 같이 티올기를 갖는 리셉터가 고정화되어 있어, 시료와 반응시키는 경우 색전이를 나타내므로, 이를 리셉터-리간드 반응 예를 들어, 항체-항원 반응에 이용하는 경우 폴리디아세틸렌 특유의 색전이를 통해 항원을 검출할 수 있다.
초분자체, 폴리디아세틸렌

Description

신규한 폴리디아세틸렌 초분자체 색 전이 센서 {Novel colorimetric sensor using polydiacetylene supramolecule}
도 1은 화학식 1의 구조를 나타낸다.
도 2는 화학식 2의 구조를 나타낸다.
도 3은 화학식 3의 디아세틸렌 단량체 10, 12-펜타코사디이노익산 (pentacosadiynoic acid) (PCDA)의 구조를 나타낸다.
도 4는 티올기와 반응할 수 있는 지질분자의 몇가지 예를 나타낸다.
도 5는 폴리디아세틸렌 리포좀에 크립토스포리듐 파르붐 ( Cryptosporidium parvum)에 대한 단클론 항체를 결합시킨 바이오센서를 나타낸다.
도 6은 크립토스포리듐 파르붐 ( Cryptosporidium parvum)에 대한 단클론 항체를 결합시킨 바이오센서의 색 변화를 백분율로 수치화한 그래프를 나타내고 있다.
기술분야
본 발명은 폴리디아세틸렌 (polydiacetylene) 초분자체에 리셉터를 고정화한 색전이 센서 및 이를 이용한 생화학적 분석 방법에 관한 것이다.
종래기술
일반적으로, 항체를 이용한 정량분석 방법은 효소면역측정법 (Enzyme Immunoassay, EI), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 및 방사면역측정법 (Radioimmunoassay, RIA) 등이 있다. 이들 방법 중, ELISA 법은 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로서, 비교적 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하여 현재 가장 널리 이용되는 방법 중의 하나이다. 특히, ELISA는 방사능면역시험법 (RIA, Radio ImmunoAssay)에 필적하는 수준의 민감도 (sensitivity)를 가지면서도, 방사능을 사용하지 않는다는 점에서 커다란 장점을 가지고 있어 그 이용이 증가되고 있다. 그러나, ELISA 방법은 분석에 많은 양의 시료를 요구하며, 시간이 오래 걸리고, 여러 단계의 과정을 거쳐야 한다는 단점이 있다. 또한, 가장 민감도가 높은 방법인 방사면역측정법은 방사능 물질에 의한 위험이 문제가 된다.
최근 이러한 종래기술의 문제점을 해결하기 위해, 동위원소, 형광, 효소 반응을 이용하고 신호 변환이 가능한 분석방법이 제안된 바 있다. 그러나, 이들 방법 중, 동위원소측정법은 안전성에 문제가 있고, 효소반응측정법은 분석범위가 좁아 다양한 농도로 존재하는 시료를 분석하기에 적합하지 않으며, 형광측정법은 고가의 형광물질을 검출 단백질에 다시 결합시켜 사용해야 한다는 문제점이 있다. 이러한 문제점들을 해결하기 위해, 폴리디아세틸렌을 이용하는 것과 같은 비표지 (Label-free) 검출 방식이 제안되었다.
폴리디아세틸렌은 3중 결합이 번갈아 있는 디아세틸렌 (diacetylene) 단량체의 고분자를 의미한다. 디아세틸렌은 이것의 양쪽성 성질로 인하여 수용액 상에서 리포좀, Langmuir-Blodgett (LB) 또는 Langmuir-Schaeffer (LS) 단분자막과 같은 초분자체를 형성하는 것으로 알려졌다. 초분자체를 이룬 디아세틸렌은 254 nm의 UV 광에 노출되는 경우, 인접 디아세틸렌간에 고분자화 반응이 일어나면서 파란색을 띠게 된다. 또한, 고분자화된 폴리디아세틸렌 초분자체는 온도, pH, 마찰, 계면활성제 또는 용매 등의 자극을 받으면 빨간색으로 색전이 되는 특성을 갖는다. 폴리디아세틸렌 색전이는 고분자 결합의 π-축합 (conjugation)의 길이, 이에 따른 분자들이 취하는 구조에 따른다. 따라서, 폴리디아세틸렌 고분자 결합의 변화를 이용한 다양한 형태의 센서 제조가 가능하다. 예를 들어, 세포 또는 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 디아세틸렌 또는 다른 지질 분자의 말단기에 화학 합성으로 도입한 후, 이를 다른 디아세틸렌과 혼합하여 리포좀을 제조하여, 인플루엔자 바이러스, 콜레라 독소, 대장균 등을 검출할 수 있는 바이오센서를 제작할 수 있다. 그러나, 상기 폴리디아세틸렌 바이오센서는 분석 대상에 따라 리셉터 기능을 하는 지질 분자를 새롭게 합성해야 한다는 번거로움이 있다.
이에 본 발명자들은 티올 (-thiol)과 신속하고 선택적으로 반응할 수 있는 디아세틸렌-말레이미드 분자를 이용하여 폴리디아세틸렌 초분자체를 제작하고, 분석 대상에 따라 적합한 항체 또는 다른 리셉터를 선택하여 폴리디아세틸렌에 고정화한 후, 항원 또는 리간드가 포함된 시료와 반응시켜 폴리디아세틸렌 초분자체의 색전이를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 티올기를 갖는 리셉터 분자를 고정화 할 수 있는 폴리디아세틸렌 초분자체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폴리디아세틸렌 초분자체에 검출하고자 하는 목적물질 (리간드)에 따라 적합한 티올계 리셉터를 고정화한 풀리디아세틸렌 초분자체에 기초한 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폴리디아세틸렌 초분자체에 기초한 센서와 검출하고자 하는 목적물질 (리간드)을 포함하는 시료를 반응시켜, 목적물질을 검출하는 생화학적 분석방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 말단기에 말레이미드와 같은 티올과 반응할 수 있는 지질분자를 가진 디아세틸렌을 화학적으로 합성하여 이용한다.
양쪽성 디아세틸렌은 양쪽성 성질에 의해 수용액과 계면을 형성하므로, 리포좀, 마이셀, Langmuir Blodgett 또는 Langmuir Schaeffer 필름과 같은 초분자체로 자기 조립의 유도가 가능하다. 초분자체를 형성할 때, 디아세틸렌 단량체들 사이의 거리가 충분히 좁으면 254 nm의 UV 빛으로 고분자화될 수 있는데, 이때 새로 형성된 고분자 결합에 의해 파란색을 띠게 된다. 여기서 고분자 결합의 색은 결합에 참여하는 π-축합 (conjugation)과 밀접한 관련이 있으며, 외부 자극에 의해 고분자의 단량체들의 재배열이 일어나 π-축합이 짧아지면서 자극의 정도에 따라 점차 붉은 색으로의 색전이현상을 보인다. 색 전이를 일으킬 수 있는 일반적인 자극은 온도, pH, 표면 마찰, 유기 용매 또는 계면 활성제와의 상호 작용이 있으며, 그 외 초분자체의 단량체들을 화학적으로 변형하여 리셉터가 초분자체 계면에 도출되도록 설계할 경우 리셉터가 리간드와 반응하여 색전이가 유도되는 바이오센서, 또는 생화학적 분석 기술로 이용될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 -COOH 말단을 갖는 디아세틸렌 단량체와 하기 화학식 2로 표시되는 티올과 반응할 수 있는 지질 분자를 갖는 디아세틸렌 단량체로 구성된 폴리디아세틸렌 초분자체 (예를 들어, 리포좀, 마이셀, LB 필름, LS 필름)를 제공한다:
화학식 1
Figure 112005073650910-pat00001
화학식 2
Figure 112005073650910-pat00002
상기 식에서, R1은 C1 내지 C10 알킬이고, R2는 C1 내지 C10 알킬기이며,
R3는
Figure 112005073650910-pat00003
이며 (여기서, n은 1 내지 10의 정수이다),
R4는
Figure 112005073650910-pat00004
또는
Figure 112005073650910-pat00005
이다.
이와 같이, 본 발명에서 디아세틸렌 단량체는, 10, 12-펜타코사디이노익산 (pentacosadiynoic acid), 5, 7-에이코사디이노익산 (eicosadiynoic acid), 2, 4-헵타코사디이노익산 (heptacosadiynoic acid) 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 말단기가 -COOH로 국한되지 않는다. 또한, 본 발명에서 지질분자 말단기는 말레이미드, 요오드아세틸 (Iodoacetyl), 아지리딘 (aziridine), 아크릴로일 (acryloyl), 플루오르벤젠 (fluorobenzene), TNB-티올, 디티오피리딘 (dithiopyridine)을 포함한다.
본 발명에서, 폴리디아세틸렌 초분자체 내 티올과 반응하는 분자의 스페이서 길이 (상기 화학식에서 R3)를 조절함으로써, 센서의 민감도를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 티올기를 지닌 리셉터가 티오에스터 또는 disulfide 결합에 의해 표면에 고정화된 폴리디아세틸렌 초분자체를 제공한다. 본 발명에서 리셉터는 항체, 단클론 항체, F(ab), F(ab)'2, 압타머 (aptamer), 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 항원 또는 이들 중 하나 이상의 혼합물을 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 화학식 1로 표시되는 -COOH 말단을 갖는 디아세틸렌 단량체와 화학식 2로 표시되는 티올과 반응할 수 있는 지질 분자를 갖는 디아세틸렌 단량체를 특정 비율로 혼합한 초분자체 (예를 들어, 리포좀, 마이셀, LB, LS 필름)을 제작하는 단계, (b) 리셉터 예를 들어, 항체를 환원제와 반응시켜 이황화물 (disulfide)을 산화시켜 리셉터에 티올기를 표출시키거나 화학반응으로 티올기를 도입시키는 단계, (c) 환원된 리셉터 예를 들어, 항체와 상기 초분자체를 반응시켜 리셉터의 티올과 초분자체의 지질분자간에 티오에스터 결합 생성을 유도하여 리셉터를 고정화하는 단계 (d) 상기 초분자체를 254 nm UV 광으로 고분자화 하는 단계 (e) 상기 초분자체를 시료와 접촉시키고 색전이를 관찰하여 시료 내 리간드의 존재를 정성 및 정량적으로 분석하는 단계를 포함하는 생화학적 바이오센서 및 분석 기술을 제공한다.
본 발명에서, 리간드는 박테리아, 병원성 미생물, 바이러스, 단백질, 독소, 펩타이드, 호르몬, 효소, 독성 화합물 또는 이들의 하나 이상의 혼합물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 폴리디아세틸렌 바이오센서, 즉 티올과 화학적 결합이 가능한 디아세틸렌 또는 지질 분자를 이용하여 리셉터를 고정화한 바이오센서, 및 이를 이용한 생화학적 분석 또는 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 폴리디아세틸렌 초분자체를 이용한 시료분석은 마이크로웰 플레이트 (micro-well plate)에서 수행될 수 있음은 물론이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예: 액상에서 폴리디아세틸렌 리포좀과 항체를 이용한 병원성 세균 검출법
실시예: 1 리포좀 제작
유리병내 클로로포름에 PCDA와 PCDA-말레이미드 디아세틸렌 단량체를 1:9, 2:8 또는 3:7로 혼합한 후, 클로로포름을 질소 가스 또는 회전 증발 (rotary evaporation)로 증발시켜 상기 2성분으로 구성된 얇은 필름을 형성시켰다. 다음, 10 mM HEPES 완충액 (pH=7.4)을 넣고 80℃ 이상 고온에서 15분간 서서히 흔들면서 필름을 부유시킨 후, 프로브 소니케이션 (probe sonication)으로 30 W에서 20분 처리하였다. 제작된 리포좀을 약 4 시간 냉장 보관한 후 다음 실험에 사용하였다.
실시예 2: 항체 환원 및 항체 고정화
0.3 mg/mL 농도의 크립토스포리듐 파르붐 (Cryptosporidium parvum)에 대한 단클론 항체 (Waterborne Inc., USA)를 20 mM TCEP (Tris 2-carboxyethyl phosphine)과 1:1로 혼합한 후, 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 아미콘 (Amicon)의 30 kDa MWCO (분획분자량) 필터를 이용하여 0.02 mM TCEP이 포함된 HEPES 완충액으로 완충 교환 (buffer exchange)하였다. 상기 방법으로 처리한 항체를 최종 농도가 0.1 mg/mL가 되도록 상기 실시예 1의 리포좀 용액과 혼합하고 실 온에서 3시간 반응시켰다. 다음, L-시스테인 (L-cysteine)을 1 mM 최종 농도로 첨가하여 리포좀의 잔여 말레이미드 작용기를 캡핑 (capping)하였다.
실시예 3: 항체가 고정화된 리포좀을 이용한 병원성 세균 감지
항체-폴리디아세틸렌 리포좀을 254 nm UV 광에 노출시키는 경우, 파란색을 띠는 용액이 생성됨을 확인하였다. 이 용액 50 μL와 C. parvum이 포함된 HEPES 완충액 100μL을 혼합하고 37℃에서 2시간 30분 이상 반응시키면, C. parvum의 농도에 따라 항체-폴리디아세틸렌 리포좀의 색이 파란색에서 보라 또는 붉은 색으로 변화함이 관찰되었다 (도 5 참조). 도 5에서 제 1 내지 제 3행은 리포좀에 각각 10, 20 및 30 mol% PCDA-말레이미드로 구성된 리포좀 센서들을 나타낸다. 제 1열은 완충액, 2 내지 4열은 각각 105, 106 및 107 /mL 농도의 크립토스포리듐 파르붐 (C. parvum)이 포함된 완충액, 그리고 제 6열은 107 /mL 농도의 바실러스 (Bacillus) 포자가 포함된 완충액에 대한 리포좀의 색반응을 나타낸다.
사진에 나온 용액을 수치화하여 리간드의 농도에 대한 표준 곡선을 나타내고 있다. UV-Vis 흡광도계로 400 내지 700 nm 의 영역을 스캐닝한 다음 550 nm 와 650 nm 부근의 흡수 피크의 상대치를 계산하여 다음과 같이 색 전이도를 (colorimetric response, CR) 수치화할 수 있다.
Figure 112005073650910-pat00006
이때 B는 용액의 색 지수로써 B 0 와 B A 는 각각 분석대상 (analyte)을 넣기 전과 후의 색지수를 나타낸다. 색지수를 산출함에 있어, A 650 과 A 550 은 각각 650과 550 nm 근처 흡수 피크의 최대 흡광도를 의미한다.
도 6에 나타낸 것과 같이, PCDA-말레이미드의 함량 (mol%)가 높아질수록 바이오센서의 민감도가 향상되는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명의 폴리디아세틸렌 초분자체를 이용한 센서의 민감도가 폴리디아세틸렌 초분자체내의 티올과 반응할 수 있는 지질분자의 몰비율에 용량의존적으로 비례함을 의미한다. 도 6에서 가로축은 C. parvum ooyst의 농도를 나타내고, 세로축은 상기 수식에 따라 수치화한 색 전이도를 나타낸다. 도 6에서, (▲)는 30mol% PCDA-말레이미드로 구성된 리포좀 센서, (■)는 20mol% PCDA-말레이미드로 구성된 리포좀 센서, (●)는 10mol% PCDA-말레이미드로 구성된 리포좀 센서를 각각 의미한다.
이와 같이, 본 발명의 티올기를 가진 리셉터 분자를 고장화시킬 수 있는 폴리디아세틸렌 초분자체는, 적합한 리셉터를 용이하게 폴리디아세틸렌 초분자체 표면에 고정화시켜 리간드 검출에 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 리간드에 따라 적합한 리셉터를 용이하게 선택하여 시료 분석에 이용할 수 있다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 티올과 반응성이 없는 -COOH 말단을 갖는 디아세틸렌 단량체와 하기 화학식 2로 표시되는 티올과 반응할 수 있는 지질 분자를 갖는 디아세틸렌 단량체를 혼합하여 제조한, 티올기를 가진 리셉터 분자를 고정화 할 수 있는 폴리아세틸렌 초분자체:
    화학식 1
    Figure 112005073650910-pat00007
    화학식 2
    Figure 112005073650910-pat00008
    상기 식에서, R1은 C1 내지 C10 알킬이고, R2는 C1 내지 C10 알킬기이며,
    R3는
    Figure 112005073650910-pat00009
    (여기서, n은 1 내지 10의 정수를 나타낸다) 이고,
    R4는
    Figure 112005073650910-pat00010
    , 또는
    Figure 112005073650910-pat00011
    이다.
  2. 제 1항에 있어서, 티올에 대해 반응성이 없는 -COOH 말단을 갖는 디아세틸렌 단량체가 화학식 3의 10, 12-펜타코사디이노익산 (pentacosadiynoic acid) (PCDA)이고, 티올과 반응할 수 있는 지질분자를 갖는 디아세틸렌 단량체가 화학식 4의 PCDA-말레이미드 (maleimide)임을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 초분자체.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 리셉터 (receptor)가 티오에스터 (thioester) 결합 또는 이황 (disulfide) 결합에 의해 표면에 고정화된, 폴리디아세틸렌 초분자체.
  4. 제 3항에 있어서, 리셉터가 항체, 단클론 항체, F(ab), F(ab)'2, 압타머, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 항원 또는 이들 중 하나 이상의 혼합물임을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 초분자체.
  5. i) 하기 화학식 1로 표시되는 -COOH 말단을 갖는 디아세틸렌 단량체와 하기 화학식 2로 표시되는 티올과 반응할 수 있는 지질 분자를 갖는 디아세틸렌 단량체를 혼합하여 리포좀, 마이셀, Langmuir Blodgett 필름 또는 Langmuir Schaeffer 필름의 폴리디아세틸렌 초분자체를 형성하는 단계;
    ii) 리셉터의 티올 작용기를 이용하여 초분자체에 리셉터를 고정화시키는 단계;
    iii) 단계 ii)의 초분자체에 UV 광을 조사하여 초분자체를 고분자화 시키는 단계;
    iv) 고분자화 된 초분자체와 시료를 반응시켜 색전이를 확인하는 단계를 포함하여, 시료로부터 폴리디아세틸렌에 고정화된 리셉터와 반응하는 리간드를 검출하기 위한 방법:
    화학식 1
    Figure 112005073650910-pat00012
    화학식 2
    Figure 112005073650910-pat00013
    상기 식에서, R1은 C1 내지 C10 알킬이고, R2는 C1 내지 C10 알킬기이며,
    R3는
    Figure 112005073650910-pat00014
    (여기서, n은 1 내지 10의 정수를 나타낸다) 이고,
    R4는
    Figure 112005073650910-pat00015
    또는
    Figure 112005073650910-pat00016
    이다.
  6. 제 5항에 있어서, 리셉터가 항체, 단클론 항체, F(ab), F(ab)'2, 압타머, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 항원 또는 이들 중 하나 이상의 혼합물임을 특징으로, 시료로부터 폴리디아세틸렌에 고정화된 리셉터와 반응하는 리간드를 검출하기 위한 방법.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 리간드가 박테리아, 병원성 미생물, 바이러스, 단백질, 독소, 펩타이드, 호르몬, 효소, 독성 화합물 또는 이들의 하나 이상의 혼합물임을 특징으로 하는, 시료로부터 폴리디아세틸렌에 고정화된 리셉터와 반응하는 리간드를 검출하기 위한 방법.
  8. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 고분자화 된 초분자체와 시료의 반응이 마이크로 웰 플레이트 (micro-well plate)에서 수행됨을 특징으로 하는, 시료로부터 폴리디아세틸렌에 고정화된 리셉터와 반응하는 리간드를 검출하기 위한 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 티올에 대한 반응성이 없는 디아세틸렌 단량체가 10, 12-펜타코사디이노익산, 5, 7-에이코사디이노익산 (eicosadiynoic acid), 2, 4-헵타코사디이노익산 (heptacosadiynoic acid) 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 초분자체.
  10. 제 1항에 있어서, 티올과 반응할 수 있는 지질 분자는, 디아세틸렌 또는 다른 지질 분자 말단기에 말레이미드, Iodoacetyl, aziridine, acryloyl, fluorobenzene, TNB-thiol, 디티오피리딘 (dithiopyridine) 작용기를 갖는 분자임을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 초분자체.
  11. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 색 전이가 폴리디아세틸렌 초분자체중의 티올과 반응할 수 있는 지질분자의 몰비율에 용량 의존적으로 비례함을 특징으로 하는, 시료로부터 폴리디아세틸렌에 고정화된 리셉터와 반응하는 리간드를 검출하기 위한 방법.
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