JP3138442B2 - ポリジアセチレン膜を用いる発色センサー - Google Patents
ポリジアセチレン膜を用いる発色センサーInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体試料中の各種
リガンド（アナライト）を分析する技術に関し、詳述す
れば、ポリジアセチレン膜から成る新規な発色センサー
および該センサーを用いる分析法に関する。
リガンド（アナライト）を分析する技術に関し、詳述す
れば、ポリジアセチレン膜から成る新規な発色センサー
および該センサーを用いる分析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】両親媒性のジアセチレン分子の自己凝集
によって形成された膜は、ＵＶ（紫外線）照射すること
によりポリマー化されて青色を呈し、このポリジアセチ
レン膜は、ｐＨ、温度の上昇、力学的ストレス等の作用
により色調の変化を生じ赤色になることが知られている
（例えば、Lipowsky, R. (1991) Nature 349, 475-481;
Bloor, D. およびChance, R. R. (1985) Polydiacetyl
enes : NATO ASI Series E, Applied Science等参
照）。
によって形成された膜は、ＵＶ（紫外線）照射すること
によりポリマー化されて青色を呈し、このポリジアセチ
レン膜は、ｐＨ、温度の上昇、力学的ストレス等の作用
により色調の変化を生じ赤色になることが知られている
（例えば、Lipowsky, R. (1991) Nature 349, 475-481;
Bloor, D. およびChance, R. R. (1985) Polydiacetyl
enes : NATO ASI Series E, Applied Science等参
照）。
【０００３】最近、この性質を利用してポリジアセチレ
ン膜をバイオセンサーに応用する試みが提案されている
（Charych, D. H.他、(1993) Science 261, 585-588 ;
Reichert, A.他、(1995) J. Am. Chem. Soc. 115, 1146
-1147 (1995) ; Charych D.H.他、(1996) Chemistry &
Biology 3, 113-120 (1996)) 。すなわち、生体試料中
に存在する病原菌、ウイルス、毒素等に特異的に反応す
る受容体をポリジアセチレン膜に取り込ませておき、各
受容体が特異的なリガンド（病原菌、ウイルス、毒素
等）と結合したときに生じる色調変化（青色→赤色）を
利用してリガンドを高感度に検出できるバイオセンサー
を構築しようとする試みである。ここで、これまで提案
されていた方法では受容体として専ら糖質や脂質が用い
られていた。
ン膜をバイオセンサーに応用する試みが提案されている
（Charych, D. H.他、(1993) Science 261, 585-588 ;
Reichert, A.他、(1995) J. Am. Chem. Soc. 115, 1146
-1147 (1995) ; Charych D.H.他、(1996) Chemistry &
Biology 3, 113-120 (1996)) 。すなわち、生体試料中
に存在する病原菌、ウイルス、毒素等に特異的に反応す
る受容体をポリジアセチレン膜に取り込ませておき、各
受容体が特異的なリガンド（病原菌、ウイルス、毒素
等）と結合したときに生じる色調変化（青色→赤色）を
利用してリガンドを高感度に検出できるバイオセンサー
を構築しようとする試みである。ここで、これまで提案
されていた方法では受容体として専ら糖質や脂質が用い
られていた。
【０００４】しかしながら、このような方法は、受容体
とリガンドとの結合構造が明らかにされて受容体が同定
されたリガンドの検出にしか適用できず、したがって、
検出しようとするリガンドの種類の数と同じ数の受容体
を合成して、そのたびにポリジアセチレン膜の調製条件
を検討しなければならないという克服不可能と思われる
難点を有する。糖質や脂質から成る受容体には、合成が
非常に複雑で困難を伴うものが多く、さらに、リガンド
の検出に当たって色調変化が不充分なものが多い。例え
ば、上記のCharych らによる方法（Chemistry & Biolog
y 3, 113-119 (1996))においては、インフルエンザウイ
ルスを検出するための受容体としてガングリオシドを取
り込ませているが、ポリジアセチレン膜とインフルエン
ザウイルスの結合に起因するポリジアセチレン膜の色調
変化が不充分であるため、構造変化の促進剤としてシア
ル酸ポリジアセチレンを数％導入しなけらばならず、セ
ンサーとしての膜の調製に煩雑な操作を必要とする。ま
た、当然のことながら、検出しようとするリガンドが異
なれば、構造変化促進剤も再検討する必要がある。
とリガンドとの結合構造が明らかにされて受容体が同定
されたリガンドの検出にしか適用できず、したがって、
検出しようとするリガンドの種類の数と同じ数の受容体
を合成して、そのたびにポリジアセチレン膜の調製条件
を検討しなければならないという克服不可能と思われる
難点を有する。糖質や脂質から成る受容体には、合成が
非常に複雑で困難を伴うものが多く、さらに、リガンド
の検出に当たって色調変化が不充分なものが多い。例え
ば、上記のCharych らによる方法（Chemistry & Biolog
y 3, 113-119 (1996))においては、インフルエンザウイ
ルスを検出するための受容体としてガングリオシドを取
り込ませているが、ポリジアセチレン膜とインフルエン
ザウイルスの結合に起因するポリジアセチレン膜の色調
変化が不充分であるため、構造変化の促進剤としてシア
ル酸ポリジアセチレンを数％導入しなけらばならず、セ
ンサーとしての膜の調製に煩雑な操作を必要とする。ま
た、当然のことながら、検出しようとするリガンドが異
なれば、構造変化促進剤も再検討する必要がある。
【０００５】さらに、従来の方法は、一般に分子量千以
下程度の受容体をもつリガンドのみに有効であり、巨大
分子を受容体とするリガンドを検出するのには不向きで
ある。なぜなら、巨大分子の受容体がポリジアセチレン
膜に取り込まれるとそれだけで膜に色調変化が生じるか
らである。
下程度の受容体をもつリガンドのみに有効であり、巨大
分子を受容体とするリガンドを検出するのには不向きで
ある。なぜなら、巨大分子の受容体がポリジアセチレン
膜に取り込まれるとそれだけで膜に色調変化が生じるか
らである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ポリ
ジアセチレン膜を利用して、汎用性があり簡便で高感度
に各種生体試料を分析することができ、膜の製造も容易
な新しいタイプの分析システムを提供することにある。
ジアセチレン膜を利用して、汎用性があり簡便で高感度
に各種生体試料を分析することができ、膜の製造も容易
な新しいタイプの分析システムを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、生体試料中
のリガンド（アナライト：被検成分）と反応または相互
作用し得る比較的低分子の蛋白類をポリジアセチレン膜
を取り込むことにより上記の目的が達成されることを見
出し、本発明を導き出した。かくして、本発明は、ポリ
ジアセチレン膜リポソーム、ポリジアセチレン膜フィル
ムまたはポリジアセチレン膜が被覆された微粒子から成
り、ポリジアセチレン膜に該膜に色調変化を引き起こさ
ないように低分子化した蛋白類が取り込まれていること
を特徴とする発色センサーを提供する。
のリガンド（アナライト：被検成分）と反応または相互
作用し得る比較的低分子の蛋白類をポリジアセチレン膜
を取り込むことにより上記の目的が達成されることを見
出し、本発明を導き出した。かくして、本発明は、ポリ
ジアセチレン膜リポソーム、ポリジアセチレン膜フィル
ムまたはポリジアセチレン膜が被覆された微粒子から成
り、ポリジアセチレン膜に該膜に色調変化を引き起こさ
ないように低分子化した蛋白類が取り込まれていること
を特徴とする発色センサーを提供する。
【０００８】好ましい態様として、本発明の発色センサ
ーにおいては、低分子化した蛋白類が、抗体のＦａｂ´
フラグメントであり、検体中に含まれる抗原と抗原・抗
体反応するものである。別の好ましい態様として、本発
明の発色センサーにおいては、低分子化した蛋白類が、
分子量10万以下の抗原蛋白であり、検体中に含まれる抗
体と抗原・抗体反応するものである。さらに別の好まし
い態様として、本発明の発色センサーにおいては、低分
子化した蛋白類が、３〜20個のアミノ酸残基から成るペ
プチドであり、検体中に含まれる抗体と抗原・抗体反応
するものである。また、別の好ましい態様として、本発
明の発色センサーにおいては、低分子化された蛋白類
が、検体中の１本鎖ＤＮＡとハイブリダイゼーションし
て２本鎖ＤＮＡを形成する100 塩基以下の１本鎖ＤＮＡ
と、該２本鎖ＤＮＡに反応するが１本鎖ＤＮＡには反応
しない抗体とを組み合わせたものである。さらに、本発
明は、上記の発色センサーを検体溶液と接触させて、ポ
リジアセチレン膜の色調変化を吸光度測定または目視観
察することを特徴とする生体試料の分析法を提供する。
ーにおいては、低分子化した蛋白類が、抗体のＦａｂ´
フラグメントであり、検体中に含まれる抗原と抗原・抗
体反応するものである。別の好ましい態様として、本発
明の発色センサーにおいては、低分子化した蛋白類が、
分子量10万以下の抗原蛋白であり、検体中に含まれる抗
体と抗原・抗体反応するものである。さらに別の好まし
い態様として、本発明の発色センサーにおいては、低分
子化した蛋白類が、３〜20個のアミノ酸残基から成るペ
プチドであり、検体中に含まれる抗体と抗原・抗体反応
するものである。また、別の好ましい態様として、本発
明の発色センサーにおいては、低分子化された蛋白類
が、検体中の１本鎖ＤＮＡとハイブリダイゼーションし
て２本鎖ＤＮＡを形成する100 塩基以下の１本鎖ＤＮＡ
と、該２本鎖ＤＮＡに反応するが１本鎖ＤＮＡには反応
しない抗体とを組み合わせたものである。さらに、本発
明は、上記の発色センサーを検体溶液と接触させて、ポ
リジアセチレン膜の色調変化を吸光度測定または目視観
察することを特徴とする生体試料の分析法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明のセンサーは、ポリジアセ
チレン膜に低分子化された蛋白類（抗体蛋白、抗原蛋
白、ペプチド、または核酸と抗体蛋白）を取り込ませる
ことにより、各種アナライト（リガンド）の高感度検出
を可能にしたものである。すなわち、本発明は、ポリジ
アセチレン膜に比較的低分子量の蛋白類を取り込ませて
ポリジアセチレン膜に色調変化を起こさない程度の構造
変化を与えておくことにより、該蛋白類がアナライトと
反応したときの抗原・抗体反応に由来する複合体蛋白の
構造変化が非常に大きくなり、構造変化促進剤を導入す
ることなく、ポリジアセチレン膜の構造の破壊とそれに
伴う色調変化を高感度に捉えることができるという発見
に基づくものである。
チレン膜に低分子化された蛋白類（抗体蛋白、抗原蛋
白、ペプチド、または核酸と抗体蛋白）を取り込ませる
ことにより、各種アナライト（リガンド）の高感度検出
を可能にしたものである。すなわち、本発明は、ポリジ
アセチレン膜に比較的低分子量の蛋白類を取り込ませて
ポリジアセチレン膜に色調変化を起こさない程度の構造
変化を与えておくことにより、該蛋白類がアナライトと
反応したときの抗原・抗体反応に由来する複合体蛋白の
構造変化が非常に大きくなり、構造変化促進剤を導入す
ることなく、ポリジアセチレン膜の構造の破壊とそれに
伴う色調変化を高感度に捉えることができるという発見
に基づくものである。
【００１０】本発明のセンサーは、抗原・抗体反応に基
づく任意の系の分析に適用することができる。例えば、
従来の技術では受容体が同定されていないために検出で
きないリガンドを含む全てのリガンドの検出が、その抗
体を作製することにより可能である（どのようなリガン
ドに対する抗体も作製可能である）。また、抗体につい
ても、該抗体とその受容体との間の結合構造の詳細が明
らかにされていない場合でも、その抗体と抗原・抗体反
応を起こすことが知られている抗原蛋白または抗原ペプ
チドをポリジアセチレン膜に取り込ませることにより検
出することができる。さらに、本発明のセンサーは、後
述するように抗体蛋白と組み合わせることにより、核酸
の検出にも適用することができる。
づく任意の系の分析に適用することができる。例えば、
従来の技術では受容体が同定されていないために検出で
きないリガンドを含む全てのリガンドの検出が、その抗
体を作製することにより可能である（どのようなリガン
ドに対する抗体も作製可能である）。また、抗体につい
ても、該抗体とその受容体との間の結合構造の詳細が明
らかにされていない場合でも、その抗体と抗原・抗体反
応を起こすことが知られている抗原蛋白または抗原ペプ
チドをポリジアセチレン膜に取り込ませることにより検
出することができる。さらに、本発明のセンサーは、後
述するように抗体蛋白と組み合わせることにより、核酸
の検出にも適用することができる。
【００１１】抗原・抗体反応に基づく本発明のセンサー
は、対象となるアナライトが異なっていてもほぼ同一の
条件で簡単且つ安定に、蛋白類をポリジアセチレン膜の
リポソームもしくはフィルム、または微粒子上に被覆さ
れたポリジアセチレン膜に取り込ませ、しかも定量的に
取り込ませることにより製造することができる。例え
ば、本発明に従うリポソーム型のセンサーを製造するに
は、いずれの場合においても、適当な有機溶媒中でジア
セチレン膜を形成した後、有機溶媒を除去し、得られた
ジアセチレン膜と所定量の蛋白類とを適当な緩衝液中で
撹拌、次いで超音波処理した後、ＵＶ照射をすることに
より、該蛋白類が取り込まれたポリジアセチレン膜が得
られる。微粒子上に被覆されたポリジアセチレン膜に蛋
白類が取り込まれたタイプのセンサーを得るには、緩衝
液中に適当な微粒子を添加して同様の操作を行えばよ
い。また、ポリジアセチレン膜フィルムから成るセンサ
ーを調製するには、常法に従いＬＢ膜（ラングミュアー
・ブロジェット膜）累積法により形成したフィルムを適
当な支持体に移した後、所定量の蛋白類を含む溶液（緩
衝液）に浸漬し、ＵＶ照射を行えばよい。このように、
本発明のセンサーは、いずれの分析系においても、基本
的に上述の操作によって製造することができ、目的のリ
ガンド（アナライト）が変わるたびにポリジアセチレン
膜の調製条件を検討しなければならないという煩雑さは
回避される。
は、対象となるアナライトが異なっていてもほぼ同一の
条件で簡単且つ安定に、蛋白類をポリジアセチレン膜の
リポソームもしくはフィルム、または微粒子上に被覆さ
れたポリジアセチレン膜に取り込ませ、しかも定量的に
取り込ませることにより製造することができる。例え
ば、本発明に従うリポソーム型のセンサーを製造するに
は、いずれの場合においても、適当な有機溶媒中でジア
セチレン膜を形成した後、有機溶媒を除去し、得られた
ジアセチレン膜と所定量の蛋白類とを適当な緩衝液中で
撹拌、次いで超音波処理した後、ＵＶ照射をすることに
より、該蛋白類が取り込まれたポリジアセチレン膜が得
られる。微粒子上に被覆されたポリジアセチレン膜に蛋
白類が取り込まれたタイプのセンサーを得るには、緩衝
液中に適当な微粒子を添加して同様の操作を行えばよ
い。また、ポリジアセチレン膜フィルムから成るセンサ
ーを調製するには、常法に従いＬＢ膜（ラングミュアー
・ブロジェット膜）累積法により形成したフィルムを適
当な支持体に移した後、所定量の蛋白類を含む溶液（緩
衝液）に浸漬し、ＵＶ照射を行えばよい。このように、
本発明のセンサーは、いずれの分析系においても、基本
的に上述の操作によって製造することができ、目的のリ
ガンド（アナライト）が変わるたびにポリジアセチレン
膜の調製条件を検討しなければならないという煩雑さは
回避される。
【００１２】本発明のセンサーの大きな利点の１つは、
ポリジアセチレン膜に抗体を取り込ませたことにより、
基本的には自然界に存在する全てのリガンドの検出を可
能にしたことにある。被検対象となるリガンド（アナラ
イト）を抗原として常法に従い動物に免疫することによ
って、該リガンドに対する抗体が簡単に得られるからで
ある。抗体は、目的に応じてポリクローナル抗体および
モノクローナル抗体のいずれも使用可能である。このよ
うな抗体は、ポリジアセチレン膜に取り込まれたときに
該膜に色調変化を起こさないように低分子化されている
ことが必要である。この点、本発明のセンサーに全抗体
を使用できる場合もあるが、一般的には、インタクトＩ
ｇＧ、Ｆ（ａｂ´）2 、Ｆａｂ´などのような抗体フラ
グメントを使用することが好ましい。特に，より低分子
量という理由からＦａｂ´フラグメントが好ましい。
ポリジアセチレン膜に抗体を取り込ませたことにより、
基本的には自然界に存在する全てのリガンドの検出を可
能にしたことにある。被検対象となるリガンド（アナラ
イト）を抗原として常法に従い動物に免疫することによ
って、該リガンドに対する抗体が簡単に得られるからで
ある。抗体は、目的に応じてポリクローナル抗体および
モノクローナル抗体のいずれも使用可能である。このよ
うな抗体は、ポリジアセチレン膜に取り込まれたときに
該膜に色調変化を起こさないように低分子化されている
ことが必要である。この点、本発明のセンサーに全抗体
を使用できる場合もあるが、一般的には、インタクトＩ
ｇＧ、Ｆ（ａｂ´）2 、Ｆａｂ´などのような抗体フラ
グメントを使用することが好ましい。特に，より低分子
量という理由からＦａｂ´フラグメントが好ましい。
【００１３】本発明のセンサーには、特定の抗体と抗原
・抗体反応することが明らかな各種の蛋白またはペプチ
ドをポリジアセチレン膜に取り込ませることもでき、こ
れによって該抗体の検出が可能となる。この場合、ポリ
ジアセチレン膜に取り込まれたときに該膜に色調変化を
起こさせないようにするためには、一般に、蛋白は分子
量10万以下、また、ペプチドは３〜20個のアミノ酸から
成るものが好ましい。本発明のセンサーに使用できる蛋
白またはペプチドとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイ
ルス）抗体の検出に用いられるエンベロウプ蛋白（gp12
0)断片254-274や、ＨＣＶ（ヒト型ウイルス）抗体の検
出に用いられるエンベロウプ蛋白（GP90）などを挙げる
ことができる。
・抗体反応することが明らかな各種の蛋白またはペプチ
ドをポリジアセチレン膜に取り込ませることもでき、こ
れによって該抗体の検出が可能となる。この場合、ポリ
ジアセチレン膜に取り込まれたときに該膜に色調変化を
起こさせないようにするためには、一般に、蛋白は分子
量10万以下、また、ペプチドは３〜20個のアミノ酸から
成るものが好ましい。本発明のセンサーに使用できる蛋
白またはペプチドとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイ
ルス）抗体の検出に用いられるエンベロウプ蛋白（gp12
0)断片254-274や、ＨＣＶ（ヒト型ウイルス）抗体の検
出に用いられるエンベロウプ蛋白（GP90）などを挙げる
ことができる。
【００１４】本発明のセンサーは、さらに核酸の検出に
も適用することができる。例えば、検体中の１本鎖ＤＮ
Ａとハイブリダイゼーションして２本鎖ＤＮＡを形成す
る１本鎖ＤＮＡ（一般に100 塩基以下）と、該２本鎖Ｄ
ＮＡには反応するが１本鎖ＤＮＡには反応しない抗体と
をポリジアセチレン膜に取り込ませることにより、ジア
セチレン膜に取り込まれたＤＮＡと相補的なＤＮＡを高
感度に検出することができる。このセンサーは、２本鎖
ＤＮＡの形成だけではポリジアセチレン膜の色調変化を
起こすことはできない問題を２本鎖ＤＮＡと特異的に反
応する抗体を併用することにより解決したことに基づ
く。そのような２本鎖ＤＮＡ特異的抗体も、該２本鎖Ｄ
ＮＡを適当な動物に免疫することにより簡単に製造する
ことができる。
も適用することができる。例えば、検体中の１本鎖ＤＮ
Ａとハイブリダイゼーションして２本鎖ＤＮＡを形成す
る１本鎖ＤＮＡ（一般に100 塩基以下）と、該２本鎖Ｄ
ＮＡには反応するが１本鎖ＤＮＡには反応しない抗体と
をポリジアセチレン膜に取り込ませることにより、ジア
セチレン膜に取り込まれたＤＮＡと相補的なＤＮＡを高
感度に検出することができる。このセンサーは、２本鎖
ＤＮＡの形成だけではポリジアセチレン膜の色調変化を
起こすことはできない問題を２本鎖ＤＮＡと特異的に反
応する抗体を併用することにより解決したことに基づ
く。そのような２本鎖ＤＮＡ特異的抗体も、該２本鎖Ｄ
ＮＡを適当な動物に免疫することにより簡単に製造する
ことができる。
【００１５】本発明のセンサーを用いれば、叙上のよう
にポリジアセチレン膜に取り込まれた蛋白類と検体中の
リガンド（アナライト）との抗原・抗体反応に起因する
色調変化により、生体中の各種リガンド（病原菌、ウイ
ルス、毒素等またはそれらに由来する活性成分、さらに
は各種の生理活性物質等）を定性および定量分析するこ
とができる。分析は、分光光度計を用いる吸光度測定に
より行うのが一般的であるが、定性分析を主目的とする
ような場合は目視観察によってもよい。特に、フィルム
タイプのセンサーとして用いるような場合は、該フィル
ムを紙や薄いプラスチックシートのような適当な支持体
に担持させリトマス試験紙のように検体液に浸漬して、
その発色（色調変化）の程度から被検成分の存在を簡便
に知ることもできる。
にポリジアセチレン膜に取り込まれた蛋白類と検体中の
リガンド（アナライト）との抗原・抗体反応に起因する
色調変化により、生体中の各種リガンド（病原菌、ウイ
ルス、毒素等またはそれらに由来する活性成分、さらに
は各種の生理活性物質等）を定性および定量分析するこ
とができる。分析は、分光光度計を用いる吸光度測定に
より行うのが一般的であるが、定性分析を主目的とする
ような場合は目視観察によってもよい。特に、フィルム
タイプのセンサーとして用いるような場合は、該フィル
ムを紙や薄いプラスチックシートのような適当な支持体
に担持させリトマス試験紙のように検体液に浸漬して、
その発色（色調変化）の程度から被検成分の存在を簡便
に知ることもできる。
【００１６】本発明のセンサーを定量分析に用いる場合
には、取扱い上の容易さや感度の点から、一般に、微粒
子上にポリジアセチレン膜が被覆された形態で用いられ
る。この場合、微粒子として好ましい例は、ポリスチレ
ン、ポリフッ素樹脂、などが挙げられる。また、微粒子
の粒径は、一般に、0.01〜1.0 μｍとするのが好まし
い。
には、取扱い上の容易さや感度の点から、一般に、微粒
子上にポリジアセチレン膜が被覆された形態で用いられ
る。この場合、微粒子として好ましい例は、ポリスチレ
ン、ポリフッ素樹脂、などが挙げられる。また、微粒子
の粒径は、一般に、0.01〜1.0 μｍとするのが好まし
い。
【００１７】
【実施例】以下に本発明の特徴をさらに明らかにするた
め実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制
限されるものではない。実施例１：低分子化した抗ヒトα−フェトプロテイン抗
体のＦａｂ´をジアセチレン膜のリポソームに取り込ま
せ、特定の抗原を高感度に検出する。 クロロホルム：メ
タノール＝２：１の有機溶媒100ml に 0.1〜２mg/ml の
濃度になるようにジアセチレンを溶かし、容量500ml ガ
ラスコルベンに入れ、ガラス表面に均一にジアセチレン
膜ができるようにコルベンを回転させながら25℃で有機
溶媒を除去した。１〜20μg/ml濃度の抗ヒトα−フェト
プロテイン抗体のＦａｂ´を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ8.0)50mlを加え、10分間激しく撹拌し、さらに超
音波処理し、溶液を均一にし目的とする抗ヒトα−フェ
トプロテイン抗体Ｆａｂ´を取り込んだポリジアセチレ
ン膜リポソーム50mlを調製した。これにＵＶ照射してジ
アセチレンをポリマー化した。この0.2mg/mlのリポソー
ム溶液１mlに種々な濃度のα−フェトプロテイン（α−
ＡＦＰ）（0.1 〜100ng/mlになるように）を加え、分光
光度計（ベックマン社製紫外可視分光解析システムＤＶ
−640 ）で640nm の吸光度の変化を測定した。結果を表
１と図１に示すが、極めて低濃度における広い範囲にわ
たって吸光度の定量的且つ顕著な吸光度変化が認められ
た。
め実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制
限されるものではない。実施例１：低分子化した抗ヒトα−フェトプロテイン抗
体のＦａｂ´をジアセチレン膜のリポソームに取り込ま
せ、特定の抗原を高感度に検出する。 クロロホルム：メ
タノール＝２：１の有機溶媒100ml に 0.1〜２mg/ml の
濃度になるようにジアセチレンを溶かし、容量500ml ガ
ラスコルベンに入れ、ガラス表面に均一にジアセチレン
膜ができるようにコルベンを回転させながら25℃で有機
溶媒を除去した。１〜20μg/ml濃度の抗ヒトα−フェト
プロテイン抗体のＦａｂ´を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ8.0)50mlを加え、10分間激しく撹拌し、さらに超
音波処理し、溶液を均一にし目的とする抗ヒトα−フェ
トプロテイン抗体Ｆａｂ´を取り込んだポリジアセチレ
ン膜リポソーム50mlを調製した。これにＵＶ照射してジ
アセチレンをポリマー化した。この0.2mg/mlのリポソー
ム溶液１mlに種々な濃度のα−フェトプロテイン（α−
ＡＦＰ）（0.1 〜100ng/mlになるように）を加え、分光
光度計（ベックマン社製紫外可視分光解析システムＤＶ
−640 ）で640nm の吸光度の変化を測定した。結果を表
１と図１に示すが、極めて低濃度における広い範囲にわ
たって吸光度の定量的且つ顕著な吸光度変化が認められ
た。
【００１８】
【表１】
【００１９】実施例２：低分子化した抗ヒトα−フェト
プロテイン抗体のＦａｂ´をジアセチレン膜を被覆した
微粒子に取り込ませ、特定の抗原を高感度に検出する。
クロロホルム：メタノール＝２：１の溶媒100ml に 0.1
〜10mg/ml の濃度になるようにジアセチレンを溶かし、
容量500ml ガラスコルベンに入れ、ガラス表面に均一に
ジアセチレン膜ができるようにコルベンを回転させなが
ら25℃で有機溶媒を除去した。10〜200 μg/ml濃度の抗
ヒトα−フェトプロテイン抗体のＦａｂ´を含むトリス
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.0)45mlと粒径0.212 μｍのポリ
スチレンラテックス（セラダイン社、アメリカ）の0.5
％ (w/w)液５mlを同時に加え、10分間激しく撹拌し、さ
らに３分間超音波処理して、懸濁液を均一に分散させ、
目的とする抗ヒトα−フェトプロテイン抗体のＦａｂ´
を取り込んだポリジアセチレン膜被覆ポリスチレンラテ
ックス50mlを調製した。これにＵＶ照射しジアセチレン
をポリマー化した。このラテックス懸濁液水で100 倍希
釈し、この希釈懸濁液１mlに種々な濃度のヒトα−フェ
トプロテイン（α−ＡＦＰ）（10〜1000pg/ml になるよ
うに）を加え、分光光度計で640nm の吸光度の変化を測
定した。結果を表２と図２に示すが、高感度の定量分析
が可能であることが確認された。
プロテイン抗体のＦａｂ´をジアセチレン膜を被覆した
微粒子に取り込ませ、特定の抗原を高感度に検出する。
クロロホルム：メタノール＝２：１の溶媒100ml に 0.1
〜10mg/ml の濃度になるようにジアセチレンを溶かし、
容量500ml ガラスコルベンに入れ、ガラス表面に均一に
ジアセチレン膜ができるようにコルベンを回転させなが
ら25℃で有機溶媒を除去した。10〜200 μg/ml濃度の抗
ヒトα−フェトプロテイン抗体のＦａｂ´を含むトリス
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.0)45mlと粒径0.212 μｍのポリ
スチレンラテックス（セラダイン社、アメリカ）の0.5
％ (w/w)液５mlを同時に加え、10分間激しく撹拌し、さ
らに３分間超音波処理して、懸濁液を均一に分散させ、
目的とする抗ヒトα−フェトプロテイン抗体のＦａｂ´
を取り込んだポリジアセチレン膜被覆ポリスチレンラテ
ックス50mlを調製した。これにＵＶ照射しジアセチレン
をポリマー化した。このラテックス懸濁液水で100 倍希
釈し、この希釈懸濁液１mlに種々な濃度のヒトα−フェ
トプロテイン（α−ＡＦＰ）（10〜1000pg/ml になるよ
うに）を加え、分光光度計で640nm の吸光度の変化を測
定した。結果を表２と図２に示すが、高感度の定量分析
が可能であることが確認された。
【００２０】
【表２】
【００２１】実施例３：低分子化した抗ヒトのフェトプ
ロテイン抗体のＦａｂ´をジアセチレン膜フィルムに取
り込ませ、特定の抗原を高感度に検出する。クロロホル
ム：メタノール＝２：１の溶媒100ml に 0.1〜10.0mg/m
l の濃度になるようにジアセチレンを溶かし、ラングミ
ュアー−プロジェット膜累積装置に広げた。形成された
フィルムは、オクチルトリクロロシランで被覆したガラ
スに移した。このポリジアセチレン（ｐＨ8.0)膜を0.7
×2.5cm のサイズのフィルムに１mg/ml の濃度の抗ヒト
α−フェトプロテイン抗体の0.1Mリン酸バッファーに浸
し、４℃で１時間反応させ、Ｆａｂ´を含む抗ヒトα−
フェトプロテイン抗体のＦａｂ´を取り込んだポリジア
セチレン膜を調製した。さらに、ＵＶ照射によってポリ
マー化した。このフィルム上に種々な濃度のヒトα−フ
ェトプロテイン（α−ＡＦＰ）（0.1 〜100 μg/mlの濃
度）を含む0.1Mリン酸バッファー20μｌ加え、色調の変
化を目視的に観察した。結果を表３に示すが、極めて低
濃度から目視観察により定性分析することが認められ
た。
ロテイン抗体のＦａｂ´をジアセチレン膜フィルムに取
り込ませ、特定の抗原を高感度に検出する。クロロホル
ム：メタノール＝２：１の溶媒100ml に 0.1〜10.0mg/m
l の濃度になるようにジアセチレンを溶かし、ラングミ
ュアー−プロジェット膜累積装置に広げた。形成された
フィルムは、オクチルトリクロロシランで被覆したガラ
スに移した。このポリジアセチレン（ｐＨ8.0)膜を0.7
×2.5cm のサイズのフィルムに１mg/ml の濃度の抗ヒト
α−フェトプロテイン抗体の0.1Mリン酸バッファーに浸
し、４℃で１時間反応させ、Ｆａｂ´を含む抗ヒトα−
フェトプロテイン抗体のＦａｂ´を取り込んだポリジア
セチレン膜を調製した。さらに、ＵＶ照射によってポリ
マー化した。このフィルム上に種々な濃度のヒトα−フ
ェトプロテイン（α−ＡＦＰ）（0.1 〜100 μg/mlの濃
度）を含む0.1Mリン酸バッファー20μｌ加え、色調の変
化を目視的に観察した。結果を表３に示すが、極めて低
濃度から目視観察により定性分析することが認められ
た。
【００２２】
【表３】
【００２３】実施例４：ＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp
120)断片254-274 （Cys-Thr-His-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-
Val-Ser-Thr-Gln-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu)をジア
セチレン膜のリポソームに取り込ませ、ＨＩＶ抗体を高
感度に検出する。クロロホルム：メタノール＝２：１の
有機溶媒100ml に0.1 〜２mg/ml の濃度になるようにジ
アセチレンを溶かし、容量500ml ガラスコルベンに入
れ、ガラス表面に均一にジアセチレン膜ができるように
コルベンを回転させながら25℃で有機溶媒を除去した。
１〜20μg/ml濃度のＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp120)
断片254-274 を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.0)50
mlを加え、10分間激しく攪拌し、さらに超音波処理し、
溶液を均一にし目的とするＨＩＶのエンベロウプ蛋白
（gp120)断片254-274 を取り込んだジアセチレン膜リポ
ソーム50mlを調製した。これにＵＶ照射してジアセチレ
ンをポリマー化した。この0.2mg/mlのリポソーム溶液１
mlに種々な濃度の不活性化ＨＩＶ(0.1〜1000pg/ml にな
るように）を加え、分光光度計（ベックマン社製紫外可
視分光解析システムＤＶ−640)で640nm の吸光度の変化
を測定した。結果は表４と図３に示す。
120)断片254-274 （Cys-Thr-His-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-
Val-Ser-Thr-Gln-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu)をジア
セチレン膜のリポソームに取り込ませ、ＨＩＶ抗体を高
感度に検出する。クロロホルム：メタノール＝２：１の
有機溶媒100ml に0.1 〜２mg/ml の濃度になるようにジ
アセチレンを溶かし、容量500ml ガラスコルベンに入
れ、ガラス表面に均一にジアセチレン膜ができるように
コルベンを回転させながら25℃で有機溶媒を除去した。
１〜20μg/ml濃度のＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp120)
断片254-274 を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.0)50
mlを加え、10分間激しく攪拌し、さらに超音波処理し、
溶液を均一にし目的とするＨＩＶのエンベロウプ蛋白
（gp120)断片254-274 を取り込んだジアセチレン膜リポ
ソーム50mlを調製した。これにＵＶ照射してジアセチレ
ンをポリマー化した。この0.2mg/mlのリポソーム溶液１
mlに種々な濃度の不活性化ＨＩＶ(0.1〜1000pg/ml にな
るように）を加え、分光光度計（ベックマン社製紫外可
視分光解析システムＤＶ−640)で640nm の吸光度の変化
を測定した。結果は表４と図３に示す。
【００２４】
【表４】
【００２５】実施例５：ＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp
120)断片254-274 （Cys-Thr-His-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-
Val-Ser-Thr-Gln-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu)をジア
セチレン膜を被覆した微粒子に取り込ませ、ＨＩＶ抗体
を高感度に検出する。クロロホルム：メタノール＝２：
１の溶媒100ml に0.1 〜10mg/ml の濃度になるようにジ
アセチレンを溶かし、容量500ml ガラスコルベンに入
れ、ガラス表面に均一にジアセチレン膜ができるように
コルベンを回転させながら25℃で有機溶媒を除去した。
１〜200 μg/ml濃度のＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp12
0)断片254-274 を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.0)
45mlと粒径0.212 μm のポリスチレンラテックス（セラ
ダイン社、アメリカ）の0.5% (w/w)液５mlを同時に加
え、10分間激しく攪拌し、さらに３分間超音波処理し
て、懸濁液を均一に分散させ、目的とするＨＩＶのエン
ベロウプ蛋白（gp120)断片254-274 を取り込んだジアセ
チレン膜ポリスチレンラテックス50mlを調製した。これ
にＵＶ照射しジアセチレンをポリマー化した。このラテ
ックス懸濁液水で100 倍希釈し、この希釈懸濁液１mlに
種々な濃度の不活性化ＨＩＶ(0.1〜10pg/ml になるよう
に）を加え、分光光度計で640nm の吸光度の変化を測定
した。結果は表５と図４に示す。
120)断片254-274 （Cys-Thr-His-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-
Val-Ser-Thr-Gln-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu)をジア
セチレン膜を被覆した微粒子に取り込ませ、ＨＩＶ抗体
を高感度に検出する。クロロホルム：メタノール＝２：
１の溶媒100ml に0.1 〜10mg/ml の濃度になるようにジ
アセチレンを溶かし、容量500ml ガラスコルベンに入
れ、ガラス表面に均一にジアセチレン膜ができるように
コルベンを回転させながら25℃で有機溶媒を除去した。
１〜200 μg/ml濃度のＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp12
0)断片254-274 を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.0)
45mlと粒径0.212 μm のポリスチレンラテックス（セラ
ダイン社、アメリカ）の0.5% (w/w)液５mlを同時に加
え、10分間激しく攪拌し、さらに３分間超音波処理し
て、懸濁液を均一に分散させ、目的とするＨＩＶのエン
ベロウプ蛋白（gp120)断片254-274 を取り込んだジアセ
チレン膜ポリスチレンラテックス50mlを調製した。これ
にＵＶ照射しジアセチレンをポリマー化した。このラテ
ックス懸濁液水で100 倍希釈し、この希釈懸濁液１mlに
種々な濃度の不活性化ＨＩＶ(0.1〜10pg/ml になるよう
に）を加え、分光光度計で640nm の吸光度の変化を測定
した。結果は表５と図４に示す。
【００２６】
【表５】
【００２７】実施例６：ＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp
120)断片254-274 （Cys-Thr-His-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-
Val-Ser-Thr-Gln-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu)をジア
セチレン膜フィルムに取り込ませ、ＨＩＶ抗体を高感度
に検出する。クロロホルム：メタノール＝２：１の溶媒
100ml に0.1 〜10.0mg/ml の濃度になるようにジアセチ
レンを溶かし、ラングミュアー−ブロジェット膜累積装
置に広げる。形成されたフィルムは、オクチルトリクロ
ロシランで被覆したガラスに移した。このジアセチレン
（ｐＨ8.0)膜を0.7 ×2.5cm のサイズのフィルムに１mg
/ml の濃度のＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp120)断片25
4-274 の0.1Mリン酸バッファーに浸し、４℃で１時間反
応させ、ＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp120)断片254-27
4 を取り込んだジアセチレン膜を調製した。さらに、Ｕ
Ｖ照射によってポリマー化した。このフィルム上に種々
な濃度のＨＩＶのエンベロウプ蛋白(gp120）断片254-27
4 （10〜10000pg/mlの濃度）を含む0.1Mリン酸バッファ
ー20μl加え、色調の変化を目視的に観察した。結果は
表６に示す。
120)断片254-274 （Cys-Thr-His-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-
Val-Ser-Thr-Gln-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu)をジア
セチレン膜フィルムに取り込ませ、ＨＩＶ抗体を高感度
に検出する。クロロホルム：メタノール＝２：１の溶媒
100ml に0.1 〜10.0mg/ml の濃度になるようにジアセチ
レンを溶かし、ラングミュアー−ブロジェット膜累積装
置に広げる。形成されたフィルムは、オクチルトリクロ
ロシランで被覆したガラスに移した。このジアセチレン
（ｐＨ8.0)膜を0.7 ×2.5cm のサイズのフィルムに１mg
/ml の濃度のＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp120)断片25
4-274 の0.1Mリン酸バッファーに浸し、４℃で１時間反
応させ、ＨＩＶのエンベロウプ蛋白（gp120)断片254-27
4 を取り込んだジアセチレン膜を調製した。さらに、Ｕ
Ｖ照射によってポリマー化した。このフィルム上に種々
な濃度のＨＩＶのエンベロウプ蛋白(gp120）断片254-27
4 （10〜10000pg/mlの濃度）を含む0.1Mリン酸バッファ
ー20μl加え、色調の変化を目視的に観察した。結果は
表６に示す。
【００２８】
【表６】
【００２９】実施例７：ポリジアセチレン膜にデオキシ
ヌクレオチド（ＤＮＡ）を取り込ませ、検体中の特定の
ＤＮＡを高感度に簡便に検出する。実施例３の方法に準
じて調製した種々な量（0.1 〜100pg)のプローブＤＮＡ
（塩基の数：20mers, TATGCTTCCGGCTCGTATGT）を取り込
んだポリジアセチレン膜フィルムに相補的に反応する検
体ＤＮＡ(ATACGAAGGCCGAGCATACA)を含む液を20μｌ加え
た。色調変化は全く見られなかった。次に２本鎖ＤＮＡ
のみに反応する抗体を（10μg/ml) 20μｌ加えて、60秒
後の色調変化を目視的に観察した。結果は表７に示す。
表７の結果は、２本鎖ＤＮＡに特異的に反応する抗体を
使用することにより、検体中ＤＮＡを高感度、簡便に、
迅速に検出できることを示している。
ヌクレオチド（ＤＮＡ）を取り込ませ、検体中の特定の
ＤＮＡを高感度に簡便に検出する。実施例３の方法に準
じて調製した種々な量（0.1 〜100pg)のプローブＤＮＡ
（塩基の数：20mers, TATGCTTCCGGCTCGTATGT）を取り込
んだポリジアセチレン膜フィルムに相補的に反応する検
体ＤＮＡ(ATACGAAGGCCGAGCATACA)を含む液を20μｌ加え
た。色調変化は全く見られなかった。次に２本鎖ＤＮＡ
のみに反応する抗体を（10μg/ml) 20μｌ加えて、60秒
後の色調変化を目視的に観察した。結果は表７に示す。
表７の結果は、２本鎖ＤＮＡに特異的に反応する抗体を
使用することにより、検体中ＤＮＡを高感度、簡便に、
迅速に検出できることを示している。
【００３０】
【表７】
【００３１】
【発明の効果】ポリジアセチレン膜から成る本発明のセ
ンサーは、汎用性があり、従来は検出できなかったよう
なリガンド（アナライト）を含む多くのリガンドを高感
度に且つ簡便に検出することができる。本発明の発色セ
ンサーは、目的のリガンドが異なっても同様の条件で容
易に製造することができる。
ンサーは、汎用性があり、従来は検出できなかったよう
なリガンド（アナライト）を含む多くのリガンドを高感
度に且つ簡便に検出することができる。本発明の発色セ
ンサーは、目的のリガンドが異なっても同様の条件で容
易に製造することができる。
【図１】本発明に従うポリジアセチレン膜リポソームを
用いたα−ＡＦＰの検出試験の結果を示すグラフであ
る。
用いたα−ＡＦＰの検出試験の結果を示すグラフであ
る。
【図２】本発明に従うポリジアセチレン膜被覆ポリスチ
レンラテックスを用いたα−ＡＦＰの検出試験の結果を
示すグラフである。
レンラテックスを用いたα−ＡＦＰの検出試験の結果を
示すグラフである。
【図３】本発明に従うポリジアセチレン膜リポソームを
用いたＨＩＶ抗体の検出試験の結果を示すグラフであ
る。
用いたＨＩＶ抗体の検出試験の結果を示すグラフであ
る。
【図４】本発明に従うポリジアセチレン膜被覆ポリスチ
レンラテックスを用いたＨＩＶ抗体の検出試験の結果を
示すグラフである。
レンラテックスを用いたＨＩＶ抗体の検出試験の結果を
示すグラフである。
フロントページの続き (56)参考文献 特表 平８−501883（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/566 G01N 33/52 G01N 33/544 G01N 33/545
Claims (6)
- 【請求項１】 ポリジアセチレン膜リポソーム、ポリジ
アセチレン膜フィルムまたはポリジアセチレン膜が被覆
された微粒子から成り、ポリジアセチレン膜に該膜に色
調変化を引き起こさないように低分子化した蛋白類が取
り込まれて、該蛋白類が検体中のリガンドと結合すると
青色から赤色に色調変化することを特徴とする発色セン
サー。 - 【請求項２】 低分子化した蛋白類が、抗体のＦａｂ’
フラグメントであり、検体中に含まれる抗原と抗原・抗
体反応するものであることを特徴とする請求項１の発色
センサー。 - 【請求項３】 低分子化した蛋白類が、分子量１０万以
下の抗原蛋白であり、検体中に含まれる抗体と抗原・抗
体反応するものであることを特徴とする請求項１の発色
センサー。 - 【請求項４】 低分子化した蛋白類が、３〜２０個のア
ミノ酸残基から成るペプチドであり、検体中に含まれる
抗体と抗原・抗体反応するものであることを特徴とする
請求項１の発色センサー。 - 【請求項５】 低分子化された蛋白類が、検体中の１本
鎖ＤＮＡとハイブリダイゼーションして２本鎖ＤＮＡを
形成する１００塩基以下の１本鎖ＤＮＡと、該２本鎖Ｄ
ＮＡに反応するが１本鎖ＤＮＡには反応しない抗体とを
組み合わせたものであることを特徴とする請求項１の発
色センサー。 - 【請求項６】 請求項１〜請求項５のいずれかの発色セ
ンサーを検体溶液と接触させて、ポリジアセチレン膜の
青色から赤色への色調変化を吸光度測定または目視観察
することを特徴とする生体試料の分析法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09369574A JP3138442B2 (ja) | 1997-12-26 | 1997-12-26 | ポリジアセチレン膜を用いる発色センサー |
| EP98310595A EP0926497A3 (en) | 1997-12-26 | 1998-12-22 | Colorimetric sensor employing polydiacetylene membrane |
| US09/220,389 US6277652B1 (en) | 1997-12-26 | 1998-12-23 | Colorimetric sensor employing polydiacetylene membrane |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09369574A JP3138442B2 (ja) | 1997-12-26 | 1997-12-26 | ポリジアセチレン膜を用いる発色センサー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11194130A JPH11194130A (ja) | 1999-07-21 |
| JP3138442B2 true JP3138442B2 (ja) | 2001-02-26 |
Family
ID=18494780
Family Applications (1)
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