JPH06160389A

JPH06160389A - 抗原、抗体およびハプテン検出用のリポソーム免疫検定法

Info

Publication number: JPH06160389A
Application number: JP4195826A
Authority: JP
Inventors: Gitler Carlos; ギットラーカルロス
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1991-06-12
Filing date: 1992-06-12
Publication date: 1994-06-07
Also published as: IL98473A0; EP0518319B1; EP0518319A3; EP0518319A2; DE69228720D1; IL98473A

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は試料中の抗体、抗原またはハプテン
のリポソーム直接免疫検定法に関するものである。【構成】本発明の方法は、ポリマー網にからませられ
ており、それらの内部容積内に閉じ込められたマーカー
を含有するリポソームに試料を加え、この懸濁液を補体
または細胞溶解剤とともにインキュベートして、リポソ
ームを溶解させ、これにより引続いてマーカーを放出さ
せ、この懸濁液を正常重力の下に沈降させた後に、この
放出されたマーカーを測定することからなる。ポリマー
は好ましくは、架橋ポリアクリルアミドである。この検
定法は非常に迅速であり、かつまた敏感である。リポソ
ームをからませるポリマーの網状構造はリポソームの貯
蔵寿命を増長させ、かつまたリポソーム表面に対する分
子量の異なる分子の拡散に対する選択的障壁として作用
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、改良されたリポソーム
免疫検定法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】抗原、抗体およびハプテンの検出用のリ
ポソーム免疫検定法は敏感で、かつまた迅速であり、免
疫学的研究および臨床分折における正確な診断にとっ
て、非常に重要な手段である〔参考として、Ｍｏｎｒｏ
ｅＤ．“ＮｏｖｅｌＬｉｐｏｓｏｍｅＩｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＡｎｔｉ
ｇｅｎｓ，ＡｎｔｉｂｏｄｙｓａｎｄＨａｐｔｅｎ
ｓ”（１９９０）、Ｊ．ＬｉｐｏｓｏｍｅＲｅｓ．１
（３）：３３９〜３７７頁参照〕。

【０００３】リポソーム免疫検定法は、リポソーム小胞
を免疫溶解させ、これによってリポソームの内部容積内
に閉じ込められているマーカーを放出させることにもと
づいている。この放出された物質の量が、生じた反応の
定量的指標として機能する。これらの検定法では種々の
マーカーが使用され、たとえば糖類、特殊イオン類、電
子スピン分子、ならびに極めて多くの場合に、酵素およ
び染料が使用される。

【０００４】リポソーム溶解は、リポソーム表面に生成
される免疫複合体に結合し、補体カスケード反応を開始
して、リポソーム溶解を導く補体の添加によって、ある
いは抗体または抗原に共有結合される細胞溶解剤、たと
えばマリンウォームタンパク質セレブラツルスラクテウ
ム（Ｃｅｒｅｂｒａｔｕｌｕｓｌａｃｔｅｕｓ）毒素
Ａ−ＩＩＩ、中央アジアコブラ毒およびハチ毒メリチン
によって達成される。

【０００５】リポソーム免疫検定法は一般に、古典的免
疫検定法に比較して多くの利点および用途を有し、微量
の分析物の検出用の敏感で、特異的な方法を提供する
が、この技術をさらに魅力的なものとし、かつまた診断
の目的に対してさらに信頼できるものにするためには、
解決すべき問題が依然としてある。これらの問題の中に
は、リポソームの安定性およびその内部容積内に閉じ込
められているマーカーがメジウム中に全く漏出しない
か、または漏出しても極く僅かであるように、これらの
マーカーを保有する能力、およびまた分析の信号対雑音
の比率の改善による分析の感度の向上がある。

【０００６】

【発明の開示】本発明によってここに、ポリマーの網状
構造中に捕獲もしくはからませられているリポソームが
非常に安定であり、リポソーム免疫検定法に適してお
り、この免疫検定法の感度を数倍増加することが見い出
された。

【０００７】捕獲されているリポソームは薬物の徐放用
に提案されている。ヨーロッパ特許出願ＥＰ１６０２６
６には、ゆっくりした速度で生きている身体中に放出さ
れるべき物質を内包しているリポソームを物理的に捕獲
する三次元架橋マトリックスを含むリポソーム組成物が
記載されている。生きている身体中に投与しようとする
物質は、医薬、特にインシュリン、ヘパリン、ウロキナ
ーゼ、ウビデカレノンおよびシトシンアラビノシド、あ
るいは生きている身体中に投与した場合に、有効である
ことを証明するＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミドまたはマー
カーであることができる。

【０００８】医薬物質を含有するリポソームを物理的に
捕獲する三次元網状構造は、リポソームが体液と直接に
接触し、リポソームが短時間で分解されるのを防ぐため
の緩衝物としてばかりでなく、またリポソームをマトリ
ックス中に堅固に保持するための支持体として機能し、
これによって所望のゆっくりした速度で生きている身体
中に放出しようとする物質をリポソームフィルム中に保
有することができることが記載されている。

【０００９】捕獲されているリポソームの内部に含有さ
れている物質がゆっくりした速度で放出されるという従
来技術の教示に反して、本発明の網にからませられてい
るリポソーム内に閉じ込められているマーカーは非常に
迅速な速度で直ちに放出され、これによって、当該検定
における信号対雑音の比率が改善されるのである。

【００１０】本発明によって、試料中の抗体、抗原また
はハプテンを検出するためのリポソーム免疫検定法が提
供される。本発明の検定法は、ポリマー網状構造にから
ませられたリポソームを用いて行ない、この網にからま
せられているリポソームは、それらの内部容積内に閉じ
込められたマーカーを含有する。

【００１１】これらのリポソームは補体−または細胞溶
解剤−媒介免疫溶解を受けると、マーカーを上澄液中に
放出し、このマーカーを定性的に評価するか、または定
量的測定する。このマーカーの量は試料中の抗体、抗原
またはハプテンの濃度を示す。

【００１２】本明細書で使用されているものとして、
「分析物」の用語は、抗体、抗原またはハプテンを包含
し、そしてまた「ハプテン」の用語は、それ自体抗原原
性を有していないが、もう一つの大型分子に結合すると
抗原原性になる分子を意味する。

【００１３】本発明において使用されるリポソームは、
適当な天然または合成のリン脂質のいずれかからなるこ
とができ、たとえば卵黄、大豆および動物組織に由来す
る、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノール
アミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル
グリセロール、ホスファチジルセリンまたはスフインゴ
ミエリン、上記リン脂質の混合物である卵黄レシチンお
よび大豆レシチン、あるいは合成レシチン、たとえばジ
パルミトイルレシチンおよびジステアロイルレシチンな
どであることができる。

【００１４】これらはまた、ステロール類、たとえばコ
レステロール、酸化防止剤、たとえばα−トコフェロー
ル、多少ともイオン性の界面活性物質、たとえばジセチ
ルホスフェート、ステアリルアミンまたはホスファチジ
ン酸および（または）疎水性のその他の物質を含有する
こともできる。好ましくは、本発明のリポソームは大豆
リン脂質、コレステロールおよびα−トコフェロールか
らなり、この組成物中のリン脂質物質の割合は変えるこ
とができ、たとえば大豆リン脂質対コレステロール対α
−トコフェロールは１００：１０：１であることができ
る。

【００１５】ホスファチジルエタノールアミンなどのリ
ン脂質の極性基はアミノ基を含有しており、このアミノ
基はリポソーム外側表面へのハプテン基、たとえばトリ
ニトロベンゼンスルホン酸の結合に使用でき、これによ
って、ハプテンを認識する抗体と反応する最終生成物、
たとえばＮ−トリニトロフェニルホスファチジルエタノ
ールアミンが生成される。

【００１６】リポソーム内に閉じ込められるマーカーは
リポソーム免疫検定法に使用されるマーカーのいずれか
であることができる。マーカーの選択は、最高の安定
性、感度および再現性を得るために重要である。イオン
類、たとえばＦ⁻、糖（グルコース）および電子スピン
分子はリポソーム捕獲ラベルとして使用できるが、好適
なマーカーは、検定感度を通常向上させ、改善された再
現性を有し、かつまた分光光度測定、分光螢光光度測定
または電位差測定によって容易に追跡することができ
る、酵素および螢光染料である。

【００１７】水溶性の螢光染料および酵素は本発明で使
用するのに好適であり、これは、上澄液中のこれらの濃
度を、リポソームからの分離工程を必要とすることな
く、その場で容易に測定することができるからである。

【００１８】本発明において使用することができる染料
の例には、フルオロクロム類、カルセイン、カルボキシ
フルオレセインおよびスルホローダミンＢがある。これ
らの染料は、流動細胞計測法、分光光度測定法、分光螢
光光度測定法、フィルター螢光測定法および螢光顕微鏡
法によつて、簡便に測定される。

【００１９】酵素の例には、ホースラディッシュパーオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼなどがある。放出され
た酵素マーカーは直ちに、多量の特異基質に対する作用
に利用でき、引続いて測定することができる最終生成物
に化学的に変化する。たとえば、リポソーム内に閉じ込
められているアルカルホスファターゼは溶解によって放
出され、無色のｐ−ニトロフェニルホスフェートに作用
し、４１０ｎｍにおいて分光光度測定により検出するこ
とができる、発色したｐ−ニトロフェノールを生成す
る。

【００２０】ポリマー網状構体は、リポソームに損害を
与えず、かつまた検定を干渉しない適当なゲルのいずれ
であることもできる。高分子量の物質、たとえば架橋し
たポリアクリルアミド、ポリメタアクリル酸、ポリエチ
レンオキシドおよび類似物質を使用することができる。
モノマー、たとえばアクリルアミドをリポソームおよび
架橋剤、たとえばＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリル
アミドの存在の下に重合させると、リポソームの周囲の
水性空間にポリマーが生成され、リポソームを溶解させ
ることなく、リポソームを捕獲もしくはからませる三次
元ポリマー網状構造体が得られる。この網状構造のサイ
ズはアクリルアミドの量および架橋剤の量の両方に依存
する。

【００２１】閉じ込められているマーカーを含有し、本
発明のポリマー網にからませられているリポソームは、
若干の公知方法によって得ることができる。多重ラメラ
リポソームは、薄い乾燥多重ラメラシートとして展延さ
れたリン脂質およびその他の脂質を、このリン脂質二重
層またはラメラの間に水を入れることにより膨潤させる
ことによって生成される。膨潤を、適当な溶質、たとえ
ばマーカーを含有する溶液中で行ない、引続いて超音波
振動に短時間さらすと、ラメラシートは破壊され、溶質
を含有する多重ラメラ閉鎖小胞体が形成される。

【００２２】リポソームと等張であるが溶質を含有して
いない溶液に対して、サック中で透析するか、または適
当なクロマトグラフィ材料に通すと、リポソームの内部
容積内に捕獲されていない溶質が除去される。このよう
にして、それらの内部容積中に捕獲されている溶質、た
とえばマーカーを含有する小胞体だけが得られる。単ラ
メラリポソームは、リン脂質を溶解する洗剤の除去によ
って、または水性溶液をエーテルに加え、音波処理し、
引続いてエーテルを除去することによって、生成させる
ことができる。

【００２３】本発明に従い、溶液中の精製リポソーム
は、モノマーと架橋剤との混合物と混合し、次いで重合
させ、これによって閉じ込められたマーカーを含有し、
網にからませられているリポソームが得られる。一例と
して、カルセインまたはホースラディッシュパーオキシ
ダーゼを含有するリポソームを、４〜５％：０．１３％
の最終濃度のアクリルアミドおよびメチレン−ビス−ア
クリルアミドの混合物と混合し、この混合物を、たとえ
ば開始剤として慣用の割合で過硫酸アンモニウム＋Ｎ，
Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（Ｔｅ
ｍｅｄ）を用いて重合させる。

【００２４】重合が終了し、ゲル状物質が得られたなら
ば、いずれか適当な方法、たとえばゲルを針に通すこと
により、またはシリンジを用いて押し出すことにより、
破砕処理に付することができる。１６〜２７．５Ｌｕｅ
ｒの針が適当である。最後の通過の後に、ゲル網にから
ませられたリポソームの懸濁液を、等張溶液、たとえば
Ｈｅｐｅｓ−Ｋ^＋緩衝液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、１０
０ｍＭＫ_２ＳＯ_４、ｐＨ７．４）を用いる沈降によっ
て洗浄し、上澄液を除去し、次いでこのリポソームを検
定に使用する。別法として、網にからませられたリポソ
ームを有する微小球体を重合工程から直接に得ることが
できる。

【００２５】ハプテン、抗原または抗体は、適当なリポ
ソーム表面にこれらの分子が存在することを可能にする
いずれかの手段によって、たとえば化学的に、吸着によ
り、静電力により、あるいはいずれかその他の適当な手
段により、リポソーム表面に結合させることができる。
化学的結合の場合には、この分子はポリマー網にからま
せられたリポソームの表面上で免疫学的反応に係ること
ができる。

【００２６】一態様において、その外側表面に結合した
ハプテンを有する、本発明のポリマー網にからませられ
ているリポソームは、下記の工程からなる方法によって
調製する：ｉ）溶液中で適当なリン脂質、ステロールおよび酸化
防止剤を混合し、次いで溶剤を蒸発させる；ｉｉ）マーカー溶液を加え、音波処理し、これによっ
て、閉じ込められたマーカーを含有するリポソームを得
る；ｉｉｉ）工程ｉｉ）の、閉じ込められたマーカーを含
有するリポソームの存在の下に、モノマーおよび架橋剤
を重合させ、次いでポリマー網にからませられたリポソ
ームを破砕して、その表面積を増大させる；ｉｖ）工程ｉｉｉ）のポリマー網にからませられたリ
ポソームを等張緩衝溶液中でハプテンと反応させる；次
いでｖ）沈降させ、次いで洗浄し、所望のポリマー網にか
らませられたリポソームを採取する。

【００２７】もう一つの方法では、工程ｉｉ）の閉じ込
められたマーカーを含有するリポソームを先ず、ハプテ
ンと反応させ、次いで重合に付する。ハプテンが不必要
な場合には、この工程は省略する。同様に、工程ｉｉ
ｉ）のポリマー網にからませられたリポソームを、工程
ｉＶ）において抗原または抗体と反応させることもでき
る。

【００２８】本発明によって、抗体、抗原またはハプテ
ンの直接リポソーム免疫検定法が提供され、この方法は
下記の工程からなる：ａ）それらの内部容積内に閉じ込められているマーカ
ーを含有し、ポリマー網にからませられたリポソーム
に、抗体、抗原またはハプテンを含有する試料を加え
る；ｂ）この懸濁液を、リポソームの溶解を生じさせる試
薬とともにインキュベートし、引続いてマーカーを上澄
液中に放出させる；ｃ）この懸濁液を正常重力の下に沈降させる；次いでｄ）溶解したリポソームから上澄液中に放出されたマ
ーカーを測定する。

【００２９】リポソーム溶解を生じさせる試薬は、補体
または細胞溶解剤であることができる。

【００３０】補体媒介リポソーム溶解においては、リポ
ソームをからませるポリマーは低度の架橋度、たとえば
アクリルアミドゲルの場合には≦５％の架橋度を有す
る。これによって、抗体分子を試料からゲルマトリック
ス中に浸透させることができ、リポソーム表面に到達さ
せることができる。補体は試料中に、たとえば新鮮な免
疫血清中にすでに存在することもあり、あるいは適当な
供給源、たとえば市販のモルモット補体を用いて外部か
ら加えることもできる。

【００３１】細胞溶解剤媒介リポソーム溶解の場合に
は、リポソームをからませるポリマーは高度の架橋度、
たとえばアクリルアミドゲルの場合に１０％以上の架橋
度を有する。これによって、高分子量抗体分子の拡散が
防止され、低分子量細胞溶解剤が浸透できる。細胞溶解
剤はいずれも、使用することができ、たとえばハチ毒メ
リチン、メリチン様細胞溶解活性を有する合成ペプチド
類、たとえばＣＨ−１と称されるペプチド、以下で説明
する２２アミノ酸のメリチン類縁体、およびホスホリパ
ーゼ類、たとえば中央アジアコブラ毒およびマリンウォ
ームセレブラツルスラクテウム毒素Ａ−ＩＩＩに由来す
るものを使用することができる。

【００３２】前記したように、細胞溶解剤を使用する場
合には、リポソームをからませるポリマー網状構造はこ
れが種々の分子量の分子のリポソーム表面への拡散に対
する選択的障壁として機能するように構築する。これに
よって、ポリマー網状構造体は、〔細胞溶解剤−ハプテ
ン〕結合体のような小型分子の浸透は可能であるが、抗
体または〔抗体−細胞溶解剤−ハプテン〕複合体のよう
な大型分子の拡散は防止されることが可能になる。たと
えば、１０〜１２％架橋したポリアクリルアミドゲル
は、これらの要件を満たすものである。

【００３３】抗体、たとえば微生物またはＡＩＤＳに対
する抗体を検定する場合には、リポソーム外側表面に結
合した、抗体に対するエピトープからなるハプテンを有
し、ポリマー網にからませられているリポソームととも
に、血清をインキュベートする。血清が新鮮ではない場
合には、試料に補体を加える。リポソーム溶解の測定
に、閉じ込められたマーカーの放出が使用される。

【００３４】血清またはその他の試料中に存在する抗原
または小さい分子量の分析物を定量的に検定する場合に
は、この方法は２工程を含む。先ず、分析物に対して特
異性の抗体を、過剰の遊離被測定分析物に加える。次い
で中和されなかった抗体部分を補体の存在下におけるハ
プテン含有リポソームの溶解によって測定する。この場
合には、リポソームに結合したハプテンは分析物と同一
の化学的特徴を有するものにする。

【００３５】試料中の抗体の細胞溶解媒介リポソーム免
疫検定法は下記の工程からなる：ａ）被測定抗体に対して過剰量の、既知濃度の細胞溶
解剤−抗体認識ハプテン結合体とともに試料をインキュ
ベートして、〔抗体−細胞溶解剤−ハプテン〕複合体を
生成させる；ｂ）この複合体および遊離の〔細胞溶解剤−ハプテ
ン〕結合体を含有する試料を、閉じ込められたマーカー
を有し、ポリマー網にからませられたリポソームに加え
る。これにより、この結合体だけがリポソーム表面に浸
透し、そこに到達して、リポソーム溶解が生じ、引続い
てマーカーが上澄液中に放出される；ｃ）この懸濁液を正常重力の下に沈降させる；次いでｄ）溶解したリポソームから上澄液中に放出されたマ
ーカーを測定する。

【００３６】試料中の抗原または抗体を細胞溶解剤の存
在の下に直接免疫検定する方法は下記の工程からなる：ａ）既知量の、抗原またはハプテンに対する抗体を、
細胞溶解剤と抗体により認識されるハプテンとの結合体
とともにインキュベートし、遊離の抗体または〔細胞溶
解剤−ハプテン〕結合体が存在しないように中和および
１：１〔抗体−細胞溶解剤−ハプテン〕複合体の形成を
生じさせる、ｂ）ａ）で得られた混合物を、被測定抗原またはハプ
テンを含有する試料に加える。これにより、この抗原ま
たはハプテンは複合体中の抗体と競合し、〔細胞溶解剤
−ハプテン〕結合体が放出される；ｃ）それらの内部容積内に閉じ込められているマーカ
ーを含有し、高度に架橋したポリマー網にからませられ
ているリポソームを混合物ｂ）に加え、この懸濁液をイ
ンキュべートして、遊離の〔細胞溶解剤−ハプテン〕結
合体によるリポソーム溶解を生じさせ、上澄液中にマー
カーを放出させる；ｄ）この懸濁液を沈降させる；次いでｅ）溶解したリポソームから上澄液中に放出されたマ
ーカーを測定する。

【００３７】本発明のもう一つの態様においては、ポリ
アクリルアミド網にからませられたリポソームを固体状
に保持し、多数のくぼみを有する微量滴定板の壁の一部
とし、試料のための受容場所を形成する。次いで、免疫
血清の試料を加えると、捕獲されているマーカー、たと
えばカルセインの放出が生じ、ポリアクリルアミド壁の
周囲に螢光ハロが生じる。

【００３８】図１には、アクリルアミド網にからませら
れたリポソームが多数のくぼみを有する微量滴定板の一
部である固体支持体を形成する方法が例示されている。
多数のくぼみを有するくぼみ中に透明なポリアクリルア
ミド層を形成する方法は次の工程によって行なう：（Ａ）１０％アクリルアミド−メチレン−ビス−アク
リルアミド溶液（ａｓ）をプラスティック製の多数のく
ぼみを有する板（ｍｗｐ）のくぼみ（ｗ）に入れる。こ
のくぼみに適合できるプラスティック鋳型（ｐｍ）を作
る；（Ｂ）この鋳型（ｐｍ）とともにアクリルアミド（ａ
ｓ）を重合させ、くぼみ中に透明なアクリルアミド層を
形成する（左上から右下に向う斜線部分）。これによ
り、アクリルアミド網にからませられたリポソーム導入
のための用意がととのう。

【００３９】図２には、アクリルアミド網にからませら
れたリポソームのくぼみの形成および免疫血清および非
免疫血清と、反応した時のくぼみの様相が例示されてい
る。図１Ｃのポリアクリルアミド層を含有する多数のく
ぼみを有する微量滴定板の各くぼみ（この図面ではＢで
示されている）に、その表面にハプテン基（Ｎ−トリニ
トロフェニル−ホスファチジルエタノールアミン）を有
し、閉じ込められているカルセインを含有するリポソー
ム（黒い四角点で示されている）とアクリルアミド−メ
チレン−ビス−アクリルアミドとの混合物を加える。

【００４０】各くぼみに、重合開始剤（Ｔｅｍｅｄおよ
び過硫酸アンモニウム）を加えた直後に、鋳型Ａを挿入
し、Ｃに示されているように一緒に合せる。重合後に鋳
型Ａを取り除き、Ｄに示されている形状を有する多数く
ぼみの微量滴定板を得る。それらの表面上に特異的ハプ
テンを有し、かつまたそれらの内部容積内に、自己消光
したカルセインを含有しており、ポリマー網にからませ
られたリポソーム（黒色の四角点で示されている）の内
張りを有するくぼみが生成される。Ｅに示されているよ
うに、これらのくぼみに、新鮮な血清または対照（ＰＢ
Ｓ）を直接に加える。

【００４１】１５〜３０分間のインキュベーションの後
に、被測定抗体（抗−トリニトロフェニル抗体）および
補体を含有する免疫血清をアクリルアミドゲル中に拡散
させ、リポソームの特異的溶解およびカルセインの放出
を生じさせる（Ｇ）。黒点は非常に強いカルセイン螢光
を示しており、これはカルセインが稀釈され、その自己
消光性を失なって、リポソームの外部メジウム中に放出
されるために生じる。くぼみに、非免疫血清（リポソー
ム表面に存在するハプテンに対する抗体を含有していな
いもの）を加えた場合には（Ｆ）、溶解はほとんど生じ
ない。

【００４２】本発明のポリマー網にからませられたリポ
ソームによる免疫検定法は、遊離しており、網状体にか
らませられていないリポソームを用いて行なわれる公知
の免疫検定法に比較して、いくつかの利点を有する：１．ポリマー網状構造体、好ましくはポリアクリルアミ
ドにからませられているリポソームは増長された貯蔵寿
命を有する。この安定性および閉じ込められている螢光
源マーカーおよび酵素マーカーの保有能力は、３ケ月に
わたり、少なくとも４０％増長される。すなわち、溶質
の損失は、ポリアクリルアミド網にからせられたリポソ
ームでは、同等の遊離のリポソームに比較して、４０％
ほど少ない。

【００４３】ポリマー、たとえばアクリルアミド−メチ
レン−ビス−アクリルアミドの架橋度は、このゲルマト
リックス中に浸透することができ、リポソームと相互反
応することができる分子の大きさを決定する。ポリマー
の架橋度を高めることによって、選択的障壁を設計する
ことができる。

【００４４】ポリマー網にからませられたリポソーム
は、ポリマー網によって安定化される。さらにまた、放
出された発螢光団はいずれも、この網状体にからませら
れたリポソームを正常重力の下に沈降させることによっ
て、次いで遊離の発螢光団を含有する上澄液をデカンテ
ーションすることによって容易に分離することができ、
信号対雑音比の劇的な増大を得ることができる。

【００４５】４．ポリアクリルアミド網にからませられ
たリポソームの使用は、免疫検定の感度を増大させる。
ポリアクリルアミド網にからませられたリポソームの免
疫溶解で得られる信号の増強は、同一試料を非免疫血清
の存在の下にインキュベートした場合と比較して、約２
５０倍である。遊離のリポソームの場合には、約９倍の
増大が得られるだけである。

【００４６】この差違の理由には、下記の理由がある：ａ）比重が高いことによって、放出された遊離の螢光
分子の分離は遊離リポソームの場合には、非常に困難で
あるが、ポリマー網にからませられているリポソームゲ
ル断片は数分間（１〜２分間）放置すると、正常重力の
下に沈降し、遠心分離を全く必要としないか、必要とし
ても僅かだけであることから、これらの断片の場合には
非常に効果的である。このことは、私的診療所にとって
非常に適している。

【００４７】ｂ）遊離のリポソームを使用する場合に
は、これらのリポソームは簡単な方法のいずれによって
も除去することができないことから、免疫溶解を受けな
かったリポソームが小さい通路に残留する。これに対し
て、ポリアクリルアミド網にからませられたリポソーム
ゲル断片は、下方の小さい通路から沈降によって容易に
分離することができ、したがって、測定する信号、たと
えば螢光信号に関与しない。

【００４８】５．それらの外側表面に対してハプテンを
結合させるためのリポソームの誘導体化を、これらのリ
ポソームが網にからませられている間に、行なうことが
できる。これは、多大の労力の節約および最終収率の格
別の増加をもたらす。その理由は、各カラム工程のリポ
ソームの損失が１５〜２０％程度で生じる方法でのカラ
ム通過を必要としないことにある。これに対して、網状
体にからませられているリポソームを含有するゲル断片
は、定量的収率で、各工程において、沈降および洗浄す
ることができる。

【００４９】６．ポリアクリルアミド網にからませられ
たリポソームは固体状態を保持することができ、定性分
析を容易に行なうことができる、多数のくぼみを有する
板の形成を可能にするくぼみの形状設計を可能にする。
多数くぼみを有する板にポリアクリルアミド網にからま
せられたリポソームによって形成される層は非常に薄く
作ることができ、従って、試料Ｃの反応は、大面積上で
生起し、透明ポリアクリルアミド層中への放出されたマ
ーカーの拡散は非常に迅速である。

【００５０】

【実施例】本発明をここで、下記の非制限的例によって
説明する。例１閉じ込められたカルセインを含有する、ポリアクリルア
ミド網にからませられたリポソームの調製１．１Ｓｉｇｍａ製大豆リン脂質タイプＩＩ４０ｍｇ
（０．０５ミリモル）を含有するベンゼン溶液０．２ｍ
ｌを、コレステロール１．９３ｍｇを含有するベンゼン
／メタノール９：１溶液１０μｌおよびα−トコフェロ
ール２．５ｍｇを含有するベンゼン溶液１０μｌと、壁
厚培養管内で充分に混合する。溶剤を窒素雰囲気の下に
蒸発させ、この管の底部に脂質フィルムを得る。

【００５１】酸型カルセイン４４ｍｇを水６００μｌ、
５０μｌ１ＭＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中に
懸濁し、ｐＨが７．４になるまで１ＭＫＯＨを加え、
次いで全量を１．０ｍｌに調整することによって、酸型
カルセインをＫＯＨにより中和する。最終濃度はカルセ
イン７０ｍＭ；Ｈｅｐｅｓ５０ｍＭである。この溶液
の浸透圧は約３１０〜３２０ｍＯｓｍである。このカル
セイン溶液１．０ｍｌを工程（１．１）の脂質フィルム
に加え、そこにガラスビーズを加え、次いで全体を１０
分間、強力に渦巻状にかきまぜる。この混合物を次い
で、音波処理浴で、１分間、音波処理し、次いでドライ
アイスを用いて２回、ゆっくりと凍結−解凍する。次い
で１端が開口している透析管に入れ、Ｈｅｐｅｓ−Ｋ^＋
緩衝液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、１００ｍＭＫ_２ＳＯ
_４、ｐＨ７．４）に対して透析する。

【００５２】１．３５％ゲルを得るために、ガラス管
中の３０％アクリルアミド−０．８％メチレン−ビス−
アクリルアミドの水性溶液１６５μｌに、１ＭＨｅｐ
ｅｓ（ｐＨ７．４）５０μｌ、１ＭＫ_２ＳＯ_４１０
０μｌおよび水５８５μｌを加え、混合する。次いで、
この混合物に、上記カルセイン含有リポソーム１００μ
ｌを加え、次に１０％過硫酸アンモニウム５μｌ−Ｎ，
Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（Ｔｅ
ｍｅｄ）６．６Ｍ１μｌにより重合を開始させる。

【００５３】ゲルが重合されたならば、これを管から取
り出し、等量のＨｅｐｅｓ−Ｋ^＋緩衝液中に懸濁し、次
いでシリンジを用いて、１６〜２７．５Ｌｕｅｒの針に
この懸濁液を強制的に通すことによって、針に通す。最
後の通過の後に、このゲル懸濁液をＨｅｐｅｓ−Ｋ^＋緩
衝液の等張溶液から沈降させることによって洗浄する。
このゲルの網にからませられたリポソーム懸濁液には、
ハプテンを結合させる用意がととのえられており、ある
いはハプテン結合が不必要である場合には、細胞溶解剤
の存在の下での免疫検定法に対する用意がととのえられ
ている。

【００５４】例２閉じ込められたカルセインを含有し、ハプテンが結合さ
れている、ポリアクリルアミド網にからませられたリポ
ソームの調製免疫血清中の抗−トリニトロベンゼンおよび（または）
抗−ジニトロベンゼン抗体の検出のためには、ポリアク
リルアミド網にからませられたリポソーム（方法２．
２）とまたは網にからませられていないリポソーム（方
法２．１）と、トリニトロベンゼンスルホン酸とを反応
させることによって、Ｎ−トリニトロフェニル−ホスフ
ァチジル−エタノールアミン（ＴＮＰ−ＰＥ）を含有す
るポリアクリルアミド網にからませられたリポソームを
製造することができる。

【００５５】２．１例１．２と同様にして調製され
た、閉じ込められたカルセインを含有するリポソームを
等張リン酸塩緩衝剤、ｐＨ８．５中でトリニトロベンゼ
ンスルホン酸（ＴＮＢ）（最終的に２０ｍＭ）と反応さ
せる。この反応は４２０ｎｍにおける吸光の変化によっ
て追跡する。利用できる脂質の全部が反応した時点で
（２時間）、この脂質をＨｅｐｅｓ−Ｋ^＋緩衝液に対し
て透析する。このリポソームを次いで、例１．３と同様
にして、架橋ポリアクリルアミドの網状体中にからませ
る。

【００５６】２．２もう一つの方法では、例１．３の
ポリアクリルアミド網にからませられたリポソームゲル
懸濁液５ｍｌを破砕後に、等張リン酸塩緩衝液（ｐＨ
８．５）中に入れ、次いでそこに、トリニトロベンゼン
スルホン酸（最終的に２０ｍＭ）を加える。この懸濁液
を、上記２．１と同様に、遊離の網状体にからませられ
ていないリポソームと反応させ、次いでこのゲルの沈降
および全部の試薬が除去されるまで行なう、Ｈｅｐｅｓ
−Ｋ^＋緩衝剤による洗浄によって、遊離のトリニトロベ
ンゼンスルホン酸を分離する。

【００５７】例３免疫血清中の抗−トリニトロベンゼン抗体の補体存在下
における直接免疫検定例２のＮ−トリニトロフェニル−
ホスファチジルエタノールアミンを有し、カルセインを
含有する、ポリアクリルアミド網にからませられたリポ
ソーム５０μｌに、非免疫血清または新鮮な未稀釈の、
あるいは種々に稀釈した免疫血清５０μｌを加え、補体
（補体供給源として、ヒト非免疫血清を使用）の溶解作
用によって開始される、リポソーム表面上における抗原
−抗体複合体の生成による溶解応答の特異性を試験し
た。この懸濁液は３７℃でおだやかにインキュベート
し、適当な時間（３０分）の後に、Ｈｅｐｅｓ−Ｋ^＋緩
衝液１００μｌを加え、この懸濁液を沈降させ、上澄液
中のカルセインを４８５ｎｍ励起、５１５ｎｍ発光にお
いて、その螢光を測定した。リポソーム中に存在する総
カルセインは、同等のリポソームゲルフラクションを、
抗体の代りに、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最終０．１
％）で処理することによって測定した。これらの結果を
下記の第１表に示す。

【００５８】

【表１】

【００５９】比較のために、同様のリポソームである
が、ポリマー網状構造体内にからませられていないリポ
ソームを用いて、検定を反復した。これらの結果を第２
表に示す。

【００６０】

【表２】

【００６１】ポリマー網にからませられたリポソームお
よびからませられていないリポソームを用いる、これら
の結果は、遊離（からませられていない）リポソームを
用いる免疫検定が非溶解（添加＝ナシ−１１％放出）と
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による完全溶解（９８％放出）
との間で、９倍の増大を示す（第２表）のに対し、ポリ
アクリルアミド網にからませられたリポソームを用いる
免疫検定が約２５０の増大を示す（第１表）ことを示し
ている。これは、溶解していない、ポリアクリルアミド
網にからませられたリポソームがスピンダウンし、上澄
液中に遊離されたカルセインだけが、螢光測定を行なう
時点で、小さい通路中に見い出されることによる。これ
によって、検定の感度は格別に増強される。

【００６２】網状体にからませられていないリポソーム
を用いて、ここで得られた９倍の増強は非常に高く、リ
ポソームが透析サック内に常時保有されていたことによ
るものである。通常の増強ファクターは約５〜６であ
る。リポソーム溶解は血清中の抗体濃度に比例する；血
清をさらに低濃度の抗体で稀釈すると、溶解の低下が生
じ、螢光はほとんど測定されない。

【００６３】例４閉じ込められたホースラディシュパーオキシダーゼを含
有する、ポリアクリルアミド網にからませられたリポソ
ームの調製リポソームは、ＳｚｏＫａＪｒ．，Ｆ．およびＰａｐ
ａ−ｈｅｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．によるＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、７５：４１９４〜４１
９８（１９７８）にしたがい、逆相蒸発によって調製す
る。この方法においては、エーテル中の脂質の溶液中に
水性緩衝液を導入し、音波処理により乳化を生じさせ、
次いでエーテルを蒸発させて、大きい単ラメラリポソー
ム（ＬＵＶ）を形成する。外部からの溶質は、透析によ
って除去し、次いでこのリポソームをポリアミドゲルの
網にからませる。

【００６４】４．１Ｓｉｇｍａ製大豆リン脂質タイプ
ＩＩ２４．８ｍｇを含有するベンゼン溶液０．２ｍｌ、
コレステロール０．５９５ｍｇを含有するベンゼン溶液
１０μｌおよびα−トコフェロール２．５ｍｇを含有す
るベンゼン溶液１０μｌを、５０ｍｌ丸底フラスコの底
部に入れ、充分に混合する。溶剤を窒素雰囲気の下に、
蒸発させる。ジエチルエーテル５ｍｌを加え、次いでフ
ラスコをおだやかに振りうごかすことによって、脂質を
溶解させる。

【００６５】４．２上記工程４．１のリポソームエー
テル溶液に、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼＳｉｇｍａＰ６７
８２（１２００単位／ｍｇ）２．０ｍｇをＨｅｐｅｓ−
Ｋ^＋緩衝液１．５ｍｌ中に溶解）を含有する水性溶液
１．５ｍｌを加え、この溶液を音波処理浴中で２〜３分
間、音波処理し、透明または僅かに濁った懸濁液を生成
する。このエマルジョンは少なくとも３０分間の放置期
間中に分離してはならない。次いで２５℃において、水
を用い、Ｂｕｃｈｉｉ蒸発器でエーテル臭が残らなくな
るまで、エーテルを蒸発させる。このリポソームを次い
で、Ｈｅｐｅｓ−Ｋ^＋緩衝液で平衡にしたＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅ４Ｂのカラムに通して透析し、遊離のパーオキ
シダーゼを除去する。

【００６６】４．３上記４．２のホースラディッシュ
パーオキシダーゼ含有リポソームを用いて、例１．３の
方法を反復し、５％ゲルを調製する。

【００６７】例５閉じ込められたホースラディッシュパーオキシダーゼを
含有し、ハプテン結合したポリアクリルアミド網にから
ませられたリポソームの調製免疫血清中の抗−フルオルセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）抗体の検出のために、そのリポソーム外側
表面に結合したハプテンとして、１−（スクシンイミジ
ル）プロピオニル−３−ジチオ−２−ピリジン（ＳＰＤ
Ｐ）の基を有するポリアクリルアミド網にからませられ
たリポソームを下記のとおりにして調製する。

【００６８】例４の閉じ込められたホースラディッシュ
パーオキシダーゼを含有する、ポリアクリルアミド網に
からませられたリポソームを、１．２モル過剰の（リポ
ソーム表面に存在するアミノ基に対して）、１−（スク
シンイミジル）プロピオニル−３−ジチオ−２−ピリジ
ン（ＳＰＤＰ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）と反応させる。
この反応はＨｅｐｅｓ−Ｋ^＋緩衝液（ｐＨ８．５）中で
行なう。Ｈｅｐｅｓ−Ｋ^＋緩衝液（ｐＨ７．４）中で洗
浄することにより、過剰のＳＰＤＰを除去する。

【００６９】タンパク質単体に結合した抗原、ＦＩＴＣ
−大豆トリプシンインヒビターをまた、同一条件の下に
ＳＰＤＰと反応させ、使用の直前に、０．１ｍＭジチオ
スレイトールで処理し、次いでＳｅｐｈａｄｅｘＧ−
２５カラムに通し、過剰のジチオスレイトールを除去す
る。ＳＤＰＤに由来する遊離のチオール基を含有するＦ
ＩＴＣ−大豆トリプシンインヒビター抗原をポリアクリ
ルアミド網にからませられたリポソームと混合する。反
応は２−チオピリドンの遊離を生じる。反応が完了した
時点で（３０分）、このアクリルアミドゲル中に取り込
まれたリポソームをＨｅｐｅｓ−Ｋ^＋緩衝液（ｐＨ７．
４）で洗浄する。

【００７０】例６補体の存在下におけるホースラディッシュパーオキシダ
ーゼにもとづく直接抗体免疫検定例５の表面結合したＦＩＴＣ−大豆トリプシンインヒビ
ターを含有する、ポリアクリルアミド網にからませられ
たリポソーム（２０μｌ）を３個の円錐状管の底部に入
れる。第１の管には、正常血清２０μｌを加え、第２の
管には、抗−ＦＩＴＣ抗体を含有する被検血清２０μｌ
を加え、そして第３の管には、抗ＦＩＴＣ抗体を含有す
る被検血清２０μｌを加える。そしてさらに、過剰の遊
離ＦＩＴＣ−大豆トリプシンインヒビターを加える。こ
れらの管を室温で１５分間放置し、次いでパーオキシダ
ーゼのための基質として、０．０２５ｍＭ２，２′−
アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スル
ホン酸）を含有する５０ｍＭＨｅｐｅｓ、１００ｍＭ
Ｋ_２ＳＯ_４（ｐＨ６．０）５０μｌおよび０．２５ｍＭ
過酸化水素を加え、これらの成分を室温で１５分間、イ
ンキュベートする。発色を４１２ｎｍで読み取る。これ
らの結果を第３表に示す。

【００７１】

【表３】

【００７２】例７多数のくぼみを有する微量滴定板におけるポリアクリル
アミド網にからませられたリポソームの固体支持体を用
いる抗体免疫検定図１のＣに示されているとおりの、１０％ポリアクリル
アミドくぼみを有する多数くぼみの微量滴定板の各くぼ
みに、閉じ込められたカルセインを含有し、その外側表
面にトリニトロフェニル−ホスファチジル−エタノール
アミンを有する例２．１のリポソームを含有する３０％
アクリルアミド−０．８％メチレン−ビス−アクリルア
ミドの水性溶液を指定量で加える。次いで、図２に示さ
れているように、Ｔｅｍｅｄおよび過硫酸アンモニウム
を添加して、重合を開始させた直後に、鋳型Ａを装入し
て、Ｃに示されているようなアンサンブルを形成する。
重合が生じた後に、鋳型Ａを取り除き、Ｄに示されてい
るような形状を有する、多数のくぼみを有する微量滴定
板を得る。このようにして、それらの表面上に特異性ハ
プテンを有し、かつまたそれらの内部容積内に自己消光
したカルセインを含有する、ポリアクリルアミド網にか
らませられたリポソームの追加の層を内張りとして有す
る透明な重合したアクリルアミド層を有するくぼみが生
成される。

【００７３】これらのくぼみに、抗−トリニトロベンゼ
ン抗体を含有する新鮮な免疫血清を、Ｅに示されている
ように直接に加える。１５〜３０分間のインキュベーシ
ョンの後に、リポソームの補体媒介特異的溶解が免疫血
清中に存在する補体によって生じ、カルセインが放出さ
れる（Ｇ）。（Ｇ）における黒点はポリアクリルアミド
透明層内の非常に強いカルセイン螢光を示している。非
免疫血清、すなわちリポソーム表面に存在するハプテン
に対する抗体を含有していない血清をくぼみに添加した
場合には（Ｆ）、溶解はほとんど生じない。

【００７４】例８閉じ込められた発螢光団を含有する、ポリアクリルアミ
ド網にからませられたリポソームを細胞溶解剤の存在の
下に用いる抗原またはハプテンの免疫検定リン脂質、コ
レステロールおよびα−トコフェロールから形成された
リポソームに発螢光団を負荷する。これらのリポソーム
を１０％アクリルアミド−０．２６％メチレン−ビス−
アクリルアミドゲルの網状体にからませる。

【００７５】８．１細胞溶解性ペプチドにもとづく免
疫検定次式で示され、２０００ダルトンの分子量を有するメリ
チン類縁体のＣＨ−１を誘導体化して、結合したハプテ
ン（ペプチドエピトープまたはその他）を含有させ、こ
の〔ＣＨ−１−ハプテン〕結合体をモノクローナル抗体
と反応させ、抗体と〔ＣＨ−１−ハプテン〕結合体との
１：１複合体を生成させる：ＮＨ_２−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ
−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−アミド

【００７６】この抗体は１５０，０００ダルトンの分子
量を有するので、この複合体は約１５２，０００の分子
量を有する。この大きさで、この複合体はアクリルアミ
ドゲルマトリックスに侵入することはできない。しかし
ながら、モノクローナル抗体との相互反応から放出され
た時に、この遊離〔ＣＨ−１−ハプテン〕結合体は、こ
のゲルマトリックスに容易に侵入する。次いで、これは
共同して、閉じ込められた発螢光団をメジウム中に放出
するリポソーム膜を貫通する溝を形成する。

【００７７】この〔モノクローナル抗体−ＣＨ−１−ハ
プテン〕複合体を被検抗原含有血清または血漿とともに
インキュベートする。この抗原はＣＨ−１に結合したハ
プテンに対し、構造的に類似するものである。この構造
上の類似性によって、ハプテンはモノクローナル抗体か
ら〔ＣＨ−１−ハプテン〕結合体を追い出す。発螢光団
を含有するポリアクリルアミド網にからませられたリポ
ソームを沈降によって洗浄し、発螢光団による干渉をい
ずれも減じ、次いで試料に加える。〔ＣＨ−１−ハプテ
ン〕結合体はアクリルアミドゲルマトリックス中に拡散
し、リポソームを溶解し、そして発螢光団を放出する。
この放出された発螢光団を測定する。

【００７８】８．２ホスホリパーゼにもとずく免疫検
定ホスホリパーゼ（分子量１２，０００ダルトン）を誘導
体化し、結合したハプテン（エピトープ）を含有させ
る。この〔ホスホリパーゼ−ハプテン〕結合体をモノク
ローナル抗体と混合し、１：１複合体を生成する。この
抗体は１５０，０００ダルトンの分子量を有するので、
この複合体は約１６２，０００の分子量を有し、ポリア
クリルアミドゲルマトリックス中に侵入することはでき
ない。しかしながら、モノクローナル抗体との相互反応
により放出された時に、この遊離の〔ホスホリパーゼ−
ハプテン〕結合体はこのゲルマトリックスに容易に侵入
し、リポソームを溶解し、発螢光団を放出する。

【００７９】この〔モノクローナル抗体−ホスホリパー
ゼ−ハプテン〕複合体を、アルブミンの存在の下に、被
測定抗原を含有する血清または血漿とともにインキュベ
ートする。この抗原はホスホリパーゼに結合したハプテ
ンと構造的に類似しているものである。この構造上の類
似性によって、ハプテンはモノクローナル抗体から〔ホ
スホリパーゼ−ハプテン〕結合体を追い出す。発螢光団
を含有する、ポリアクリルアミド網にからませられたリ
ポソームは洗浄し（遊離の発螢光団を除去するため）、
次いで試料に加える。遊離の〔ホスホリパーゼ−ハプテ
ン〕結合体はゲル中に拡散し、リポソームを溶解し、発
螢光団を放出させる。この放出された発螢光団を測定す
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明に係る免疫検定法に有用なアクリ
ルアミド網にからませられたリポソームが多数のくぼみ
を有する微量滴定板の一部を構成する固体支持体の形成
方法を示す模式図である。

【図２】図２は、本発明に係るリポソーム直接免疫検定
法の実施様相を示す模式図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の抗体、抗原またはハプテンのリ
ポソーム直接免疫検定法であって、ａ）ポリマー網にからませられており、それらの内部
容積内に閉じ込められたマーカーを含有するリポソーム
に、抗体、抗原またはハプテンを含有する試料を加え、ｂ）この懸濁液を、リポソームの溶解を生じさせる試
薬とともにインキュベートし、引続いて上記マーカーを
上澄液中に放出させ、ｃ）この懸濁液を正常重力の下に沈降させ、次いでｄ）溶解したリポソームから上澄液中に放出されたマ
ーカーを測定する、ことからなるリポソーム直接免疫検
定法。
【請求項２】工程ｂ）におけるリポソームの溶解を生
じさせる試薬が補体である、請求項１に記載のリポソー
ム直接免疫検定法。
【請求項３】工程ａ）において、抗体を含有する免疫
血清を、低度に架橋したポリマー網にからませられてお
り、それらの外側表面にこの抗体によって認識されるハ
プテンを結合して有するリポソームに加え、そしてまた
工程ｂ）において、懸濁液のインキュベーションを、こ
の免疫血清中に存在する補体または外部から添加した補
体の存在の下に行ない、抗体依存性の補体媒介リポソー
ム溶解を生じさせる、請求項２に記載のリポソーム直接
免疫検定法。
【請求項４】工程ａ）において、抗原またはハプテン
を含有する試料を、先ず過剰の対応する抗体により中和
し、次いでポリマー網にからませられており、それらの
外側表面に、この抗体によって認識されるハプテンを結
合して有するリポソームに加え、そしてまた、工程ｂ）
において、懸濁液のインキュベーションを、この試料中
に存在する補体または外部から添加した補体の存在の下
に行ない、抗体依存性の補体媒介リポソーム溶解を生じ
させる、請求項２に記載の抗原またはハプテンのリポソ
ーム直接免疫検定法。
【請求項５】上記リポソームがゲルからなるポリマー
の網状構造にからませられており、このゲルが上記リポ
ソームに損害を与えるものでも、この検定を干渉するも
のでもない、請求項２に記載のリポソーム直接免疫検定
法。
【請求項６】上記ゲルが、架橋したポリアクリルアミ
ド、ポリメタアクリル酸およびポリエチレンオキシドか
ら選ばれる高分子量物質からなる、請求項５に記載のリ
ポソーム直接免疫検定法。
【請求項７】ポリアクリルアミドゲルが、約５％アク
リルアミドを約０．１３％の架橋剤Ｎ，Ｎ′−メチレン
−ビス−アクリルアミドの存在の下に重合させることに
よって得られるものである、請求項６に記載のリポソー
ム直接免疫検定法。
【請求項８】工程ｂ）におけるリポソームの溶解を生
じさせる試薬が細胞溶解剤であり、そしてまたリポソー
ムをからませて有するポリマーの網状構造が、このリポ
ソーム表面への分子量が異なる分子の拡散に対する選択
的障壁として作用する、請求項１に記載のリポソーム直
接免疫検定法。
【請求項９】ポリマーの網状構造が、〔細胞溶解剤−
ハプテン〕結合体を拡散させることができるが、〔抗体
−細胞溶解剤−ハプテン〕結合体を拡散させることがで
きないものである、請求項８に記載のリポソーム直接免
疫検定法。
【請求項１０】ポリマーが、約１０〜１２％アクリル
アミドを約０．２６〜０．１３％Ｎ，Ｎ′−メチレン−
ビス−アクリルアミドの存在の下に重合させることによ
って得られる架橋ポリアクリルアミドである、請求項８
に記載のリポソーム直接免疫検定法。
【請求項１１】試料中の抗体を細胞溶解剤の存在の下
に直接免疫検定するにあたり、ａ）既知濃度を有する、細胞溶解剤と抗体によって認
識されるハプテンとの結合体を被測定抗体よりも過剰に
存在させて、試料とともにインキュベートして、〔抗体
−細胞溶解剤−ハプテン〕複合体を生成させ、ｂ）この複合体および遊離の〔細胞溶解剤−ハプテ
ン〕結合体を含有する試料を、閉じ込められたマーカー
を含有し、ポリマー網にからませられているリポソーム
に加えて、この結合体だけがリポソーム表面中に侵入
し、リポソーム表面に到達して、リポソームを溶解さ
せ、引続いてマーカーを上澄液中に放出させ、ｃ）この懸濁液を正常重力の下に沈降させ、次いでｄ）溶解したリポソームから上澄液中に放出されたマ
ーカーを測定する、ことからなる、請求項８に記載のリ
ポソーム直接免疫検定法。
【請求項１２】試料中の抗原またはハプテンを直接免
疫検定するにあたり、ａ）既知量の、抗原またはハプテンに対する抗体およ
びこの抗体によって認識されるハプテンと細胞溶解剤と
の結合体の混合物をインキュベートして、遊離の抗体ま
たは〔細胞溶解剤−ハプテン〕結合体が存在しないよう
に、中和および１：１〔抗体−細胞溶解剤−ハブテン〕
複合体の形成を生じさせ、ｂ）被測定抗原またはハプテンを含有する試料に、
ａ）で得られた混合物を加えて、抗原またはハプテンを
上記複合体中の抗体に対して競合させ、〔細胞溶解剤−
ハプテン〕結合体を放出させ、ｃ）高度に架橋したポリマーの網にからまされてお
り、それらの内部容積内に閉じ込められたマーカーを含
有するリポソームを、ｂ）の混合物に加え、次いでこの
懸濁液をインキュベートして、遊離の〔細胞溶解剤−ハ
プテン〕結合体によってリポソーム溶解を生じさせ、マ
ーカーを上澄液中に放出させ、ｃ）この懸濁液を沈降させ、次いでｄ）溶解したリポソームから上澄液中に放出されたマ
ーカーを測定する、ことからなる、請求項８に記載のリ
ポソーム直接免疫検定法。
【請求項１３】ポリアクリルアミドの網にからまされ
ているリポソームが固体状に保持されており、そして試
料に対する受容体を形成している、請求項１に記載のリ
ポソーム直接免疫検定法。
【請求項１４】ａ）プラスティック製の多数のくぼみ
を有する微量滴定板に、１０％アクリルアミド−メチレ
ン−ビス−アクリルアミド溶液を加え、触媒および鋳型
の存在の下に重合させ、次いで鋳型を取り除いてくぼみ
を被覆している透明なポリアクリルアミド層を形成し、ｂ）工程ａ）のポリアクリルアミド被覆したくぼみ
に、１０％アクリルアミド−メチレン−ビス−アクリル
アミド溶液および閉じ込められたマーカーを含有するリ
ポソームを加え、触媒および鋳型の存在の下に重合さ
せ、次いで鋳型を取り除いて、透明なポリアクリルアミ
ド層の上にポリアクリルアミドの網にからませられたリ
ポソームを有するくぼみを生成させ、ｃ）このくぼみに試料を添加し、次いでｄ）溶解したリポソームから、透明なポリアクリルア
ミド層中に放出されたマーカーを評価／測定する、こと
からなる、請求項１３に記載のリポソーム直接免疫検定
法。