JP2711974B2 - 免疫凝集反応試薬及び免疫分析方法 - Google Patents
免疫凝集反応試薬及び免疫分析方法Info
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- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫凝集反応試薬に関
し、更に詳細には被検試料中に存在する広い濃度範囲の
成分を簡単な操作で、又は自動分析機を用いて、感度よ
く測定することのできる免疫凝集反応試薬及びこれを用
いた免疫分析方法に関する。
し、更に詳細には被検試料中に存在する広い濃度範囲の
成分を簡単な操作で、又は自動分析機を用いて、感度よ
く測定することのできる免疫凝集反応試薬及びこれを用
いた免疫分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗原抗体反応を利用する免疫測定法は、
各種内分泌疾患の臨床診断等において極めて重要であ
り、従来種々の免疫測定法が知られている。その中で
も、抗原性物質又は抗体を結合させた担体からなる免疫
凝集反応試薬を被検物質中の抗体又は抗原性物質と反応
させ、この抗原−抗体反応により生じた凝集量を目視に
より又は分光光度計により濁度として測定し、その結果
を予め作成しておいた標準検量線と照合させて、抗体又
は抗原性物質を定量する免疫測定法が知られている。こ
のような免疫測定法に用いられる免疫凝集試薬の担体と
しては、従来、主としてポリスチレン等の合成ラテック
ス粒子が用いられている。
各種内分泌疾患の臨床診断等において極めて重要であ
り、従来種々の免疫測定法が知られている。その中で
も、抗原性物質又は抗体を結合させた担体からなる免疫
凝集反応試薬を被検物質中の抗体又は抗原性物質と反応
させ、この抗原−抗体反応により生じた凝集量を目視に
より又は分光光度計により濁度として測定し、その結果
を予め作成しておいた標準検量線と照合させて、抗体又
は抗原性物質を定量する免疫測定法が知られている。こ
のような免疫測定法に用いられる免疫凝集試薬の担体と
しては、従来、主としてポリスチレン等の合成ラテック
ス粒子が用いられている。
【０００３】前記従来の合成ラテックス粒子を担体とし
て用いた免疫凝集試薬はその表面が疎水性であるため
に、抗原−抗体反応を起こすための好適な水溶液中のｐ
Ｈ７〜７．５では、特に、疎水結合による凝集が起こり
やすくなって非特異凝集する傾向があり、分析精度にお
いて安定性に欠けるきらいがあった。このために合成ラ
テックス粒子を担体として用いた免疫凝集試薬には、こ
のような非特異凝集を抑えるために種々の添加剤を加え
る技術が、既に特許出願（例えば、特公平３−１４２３
６０号公報、特公平３−７６４２５号公報等）されてい
る。
て用いた免疫凝集試薬はその表面が疎水性であるため
に、抗原−抗体反応を起こすための好適な水溶液中のｐ
Ｈ７〜７．５では、特に、疎水結合による凝集が起こり
やすくなって非特異凝集する傾向があり、分析精度にお
いて安定性に欠けるきらいがあった。このために合成ラ
テックス粒子を担体として用いた免疫凝集試薬には、こ
のような非特異凝集を抑えるために種々の添加剤を加え
る技術が、既に特許出願（例えば、特公平３−１４２３
６０号公報、特公平３−７６４２５号公報等）されてい
る。
【０００４】また、合成ラテックス粒子に固定した抗原
又は抗体は、その結合が物理吸着によるものであるた
め、このような固定化抗原又は固定化抗体、即ち、ラテ
ックス凝集試薬は、長期保存中にその抗原や抗体が担体
である合成ラテックス粒子から遊離してしまい、測定感
度の低下を引き起こすことがあった。さらに最近では、
このようなラテックス凝集試薬を汎用生化学自動分析機
に適用し、被検体中の抗原または抗体を測定することが
行なわれているが、合成ラテックス粒子を担体として用
いた免疫凝集試薬が自動分析機の反応セルに付着して汚
染し、測定精度に影響を与えることが問題となってい
る。
又は抗体は、その結合が物理吸着によるものであるた
め、このような固定化抗原又は固定化抗体、即ち、ラテ
ックス凝集試薬は、長期保存中にその抗原や抗体が担体
である合成ラテックス粒子から遊離してしまい、測定感
度の低下を引き起こすことがあった。さらに最近では、
このようなラテックス凝集試薬を汎用生化学自動分析機
に適用し、被検体中の抗原または抗体を測定することが
行なわれているが、合成ラテックス粒子を担体として用
いた免疫凝集試薬が自動分析機の反応セルに付着して汚
染し、測定精度に影響を与えることが問題となってい
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、これら
の問題点を解決すべくラテックス粒子のかわりに、リポ
ソームを担体とし、共有結合によりこの担体に抗原や抗
体を結合したリポソーム凝集試薬を開発し、既に、特願
平４−１６４７８３号として出願している。このリポソ
ーム凝集試薬は、リポソーム表面に抗原または抗体が共
有結合により固定化されているので、その試薬を長期間
保存しても保存中に抗原や抗体が遊離することもなく、
またリポソーム自体の表面が親水性であるために、疎水
結合による凝集が起こり難く、したがって非特異凝集が
起こり難いという利点がある。
の問題点を解決すべくラテックス粒子のかわりに、リポ
ソームを担体とし、共有結合によりこの担体に抗原や抗
体を結合したリポソーム凝集試薬を開発し、既に、特願
平４−１６４７８３号として出願している。このリポソ
ーム凝集試薬は、リポソーム表面に抗原または抗体が共
有結合により固定化されているので、その試薬を長期間
保存しても保存中に抗原や抗体が遊離することもなく、
またリポソーム自体の表面が親水性であるために、疎水
結合による凝集が起こり難く、したがって非特異凝集が
起こり難いという利点がある。
【０００６】また、自動分析機の反応セルを汚染するこ
ともないという、従来のラテックス凝集試薬にない長所
を有している。ところで、ラテックス凝集試薬は、試薬
自体の濁度が高いため、即ち、試薬ブランクが高いた
め、分光光度計等で測定する場合には濁度変化が小さい
長波長領域で測定しなければならず、そのために感度を
あげることは困難であった。これに対して、リポソーム
凝集試薬はそれ自体屈折率が低いため、短波長領域、即
ち、大きな濁度変化が観察される３４０ｎｍ程度の短波
長で測定することができるという特徴を有している。
ともないという、従来のラテックス凝集試薬にない長所
を有している。ところで、ラテックス凝集試薬は、試薬
自体の濁度が高いため、即ち、試薬ブランクが高いた
め、分光光度計等で測定する場合には濁度変化が小さい
長波長領域で測定しなければならず、そのために感度を
あげることは困難であった。これに対して、リポソーム
凝集試薬はそれ自体屈折率が低いため、短波長領域、即
ち、大きな濁度変化が観察される３４０ｎｍ程度の短波
長で測定することができるという特徴を有している。
【０００７】しかしながら、リポソームは水との屈折率
の差が小さいという性質を持っており、そして、リポソ
ームの製造は水溶液において製造され、リポソームの内
部は水溶液であるために、リポソーム内部の水溶液とリ
ポソームの分散媒である水との屈折率の差がほとんどな
い。しかも、リポソーム自体も屈折率が低い。このよう
なために、前記リポソーム凝集試薬は、リポソームが凝
集を起こしてもその濁度が高くならず、したがって、３
４０ｎｍの短波長で測定することができる利点を有しな
がらも分光光度計又は自動分析機等、或いは目視等によ
る測定感度が低いという問題があった。
の差が小さいという性質を持っており、そして、リポソ
ームの製造は水溶液において製造され、リポソームの内
部は水溶液であるために、リポソーム内部の水溶液とリ
ポソームの分散媒である水との屈折率の差がほとんどな
い。しかも、リポソーム自体も屈折率が低い。このよう
なために、前記リポソーム凝集試薬は、リポソームが凝
集を起こしてもその濁度が高くならず、したがって、３
４０ｎｍの短波長で測定することができる利点を有しな
がらも分光光度計又は自動分析機等、或いは目視等によ
る測定感度が低いという問題があった。
【０００８】そこで本発明は、リポソームを担体とし
て、抗原や抗体を共有結合したリポソーム凝集試薬の凝
集において、前記した問題点を解決し、凝集による濁度
変化が大きく観察される光の波長領域、即ち、短波長
で、感度よく測定することができる免疫凝集反応試薬を
提供することを目的とする。また、本発明は、屈折率の
増大されたリポソームを用いることにより、感度のよい
免疫凝集反応試薬を提供することを目的とする。
て、抗原や抗体を共有結合したリポソーム凝集試薬の凝
集において、前記した問題点を解決し、凝集による濁度
変化が大きく観察される光の波長領域、即ち、短波長
で、感度よく測定することができる免疫凝集反応試薬を
提供することを目的とする。また、本発明は、屈折率の
増大されたリポソームを用いることにより、感度のよい
免疫凝集反応試薬を提供することを目的とする。
【０００９】さらに本発明は、被検体の濃度が低くても
感度の良い免疫分析方法を提供することを目的とする。
感度の良い免疫分析方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】前記した問題点を解決す
るために本発明は、抗原抗体反応で生じた凝集量を測定
するための免疫凝集反応試薬において、免疫凝集反応試
薬の担体としてリポソームが使用され、該リポソーム表
面に抗体または抗原が固定化され、該リポソームには、
水溶性高分子化合物又はゲル化処理された化合物が内包
されていることを特徴とする免疫凝集反応試薬とするも
のである。
るために本発明は、抗原抗体反応で生じた凝集量を測定
するための免疫凝集反応試薬において、免疫凝集反応試
薬の担体としてリポソームが使用され、該リポソーム表
面に抗体または抗原が固定化され、該リポソームには、
水溶性高分子化合物又はゲル化処理された化合物が内包
されていることを特徴とする免疫凝集反応試薬とするも
のである。
【００１１】本発明におけるリポソームには、リン脂質
及びコレステロールを主要構成成分とするものであれ
ば、従来リポソームに使用されている何れの材料も使用
できる。リポソームの粒径は５０ｎｍ〜５μｍ、好まし
くは１００〜６００ｎｍ、特に好ましくは１００〜２０
０ｎｍがよい。この範囲においては、保存中に沈澱しづ
らいので試薬の安定性に優れ、しかも、分光光度計及び
スライド凝集法等の濁度の測定において好ましい。
及びコレステロールを主要構成成分とするものであれ
ば、従来リポソームに使用されている何れの材料も使用
できる。リポソームの粒径は５０ｎｍ〜５μｍ、好まし
くは１００〜６００ｎｍ、特に好ましくは１００〜２０
０ｎｍがよい。この範囲においては、保存中に沈澱しづ
らいので試薬の安定性に優れ、しかも、分光光度計及び
スライド凝集法等の濁度の測定において好ましい。
【００１２】本発明における免疫凝集反応試薬のリポソ
ーム内に含まれる水溶性高分子化合物又はゲル化処理さ
れた化合物には、アクリルアミド、グリコシルメタクリ
レート等の重合体或いはそれらの共重合体、セルロース
又はその誘導体、メタクリル酸の重合体、アクリル酸又
はアクリル酸エステルの重合体或いはその共重合体、Ｎ
−ビニルピロリドンの重合体等が使用され、これらの水
溶性高分子化合物又は重合体は、架橋剤によるゲル化処
理が行なわれたものである。
ーム内に含まれる水溶性高分子化合物又はゲル化処理さ
れた化合物には、アクリルアミド、グリコシルメタクリ
レート等の重合体或いはそれらの共重合体、セルロース
又はその誘導体、メタクリル酸の重合体、アクリル酸又
はアクリル酸エステルの重合体或いはその共重合体、Ｎ
−ビニルピロリドンの重合体等が使用され、これらの水
溶性高分子化合物又は重合体は、架橋剤によるゲル化処
理が行なわれたものである。
【００１３】本発明の免疫凝集反応試薬は、例えば、下
記に示した抗体又は抗原をリポソーム表面に共有結合に
より固定する方法で製造されるが、本発明は、水溶性高
分子化合物又はゲル化処理された化合物をリポソームに
内包することを特徴とする免疫凝集反応試薬の発明であ
るので、抗体又は抗原とリポソーム表面との結合様式に
は限定されない。例えば、抗体又は抗原とリポソームと
の結合には、従来の過ヨウ素酸法、Ｐａｓｓｉｖｅ法等
も適用できる。
記に示した抗体又は抗原をリポソーム表面に共有結合に
より固定する方法で製造されるが、本発明は、水溶性高
分子化合物又はゲル化処理された化合物をリポソームに
内包することを特徴とする免疫凝集反応試薬の発明であ
るので、抗体又は抗原とリポソーム表面との結合様式に
は限定されない。例えば、抗体又は抗原とリポソームと
の結合には、従来の過ヨウ素酸法、Ｐａｓｓｉｖｅ法等
も適用できる。
【００１４】まず、リン脂質、コレステロール、架橋剤
を導入したリン脂質からＶｏｒｔｅｘｉｎｇ法又はガラ
スビーズを使用する方法によってリポソームを調製する
方法を説明する。この方法に用いられる架橋剤として
は、例えば、Ｎ−ハイドロオキシスクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−
（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（ＳＭＰＡ）、
Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
プロピオネート（ＳＭＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミドブ
チリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）及びＮ−
（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド
（ＥＭＣＳ）等が挙げられる。
を導入したリン脂質からＶｏｒｔｅｘｉｎｇ法又はガラ
スビーズを使用する方法によってリポソームを調製する
方法を説明する。この方法に用いられる架橋剤として
は、例えば、Ｎ−ハイドロオキシスクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−
（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（ＳＭＰＡ）、
Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
プロピオネート（ＳＭＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミドブ
チリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）及びＮ−
（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド
（ＥＭＣＳ）等が挙げられる。
【００１５】上記のリン脂質、コレステロール、架橋剤
を含む混合物に含まれる溶媒を留去し、吸引乾燥する。
しかる後に、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に、重
合性モノマーが溶解している水溶液を加え、必要があれ
ば更にガラスビーズを加え密栓して振とうし、リポソー
ム懸濁液を得る。その後、一定のポアサイズを持ったポ
リカーボネートの膜を通すことによって、重合性モノマ
ーが内包された均一な粒径のリポソームを得る。リポソ
ームに内包されなかった重合性モノマーを透析により外
液より取り除き、その後、重合開始剤によりリポソーム
に内包したモノマーを重合させる。
を含む混合物に含まれる溶媒を留去し、吸引乾燥する。
しかる後に、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に、重
合性モノマーが溶解している水溶液を加え、必要があれ
ば更にガラスビーズを加え密栓して振とうし、リポソー
ム懸濁液を得る。その後、一定のポアサイズを持ったポ
リカーボネートの膜を通すことによって、重合性モノマ
ーが内包された均一な粒径のリポソームを得る。リポソ
ームに内包されなかった重合性モノマーを透析により外
液より取り除き、その後、重合開始剤によりリポソーム
に内包したモノマーを重合させる。
【００１６】一方、抗体または抗原の分子中に上記架橋
剤と反応する反応基を導入する。次いで、このようにし
て調製したリポソームと修飾抗体または修飾抗原を混合
して緩衝液中で反応せしめれば、抗体または抗原がリポ
ソーム表面に固定化されたものが得られる。本発明にお
いてリポソーム表面に固定される抗体は、被測定抗原生
物質を認識するモノクローナル抗体及び／又はポリクロ
ーナル抗体が使用できる。これらの抗体とリポソームを
組合せた免疫凝集反応試薬の種類は、モノクローナル抗
体のみをリポソーム表面に固定した免疫凝集反応試薬、
ポリクローナル抗体のみをリポソーム表面に固定した免
疫凝集反応試薬、モノクローナル抗体とポリクローナル
抗体を同一のリポソーム表面に固定した免疫凝集反応試
薬、モノクローナル抗体をリポソーム表面に固定したも
のとポリクローナル抗体を別のリポソーム表面に固定し
たものとを混合した免疫凝集反応試薬が挙げられる。
剤と反応する反応基を導入する。次いで、このようにし
て調製したリポソームと修飾抗体または修飾抗原を混合
して緩衝液中で反応せしめれば、抗体または抗原がリポ
ソーム表面に固定化されたものが得られる。本発明にお
いてリポソーム表面に固定される抗体は、被測定抗原生
物質を認識するモノクローナル抗体及び／又はポリクロ
ーナル抗体が使用できる。これらの抗体とリポソームを
組合せた免疫凝集反応試薬の種類は、モノクローナル抗
体のみをリポソーム表面に固定した免疫凝集反応試薬、
ポリクローナル抗体のみをリポソーム表面に固定した免
疫凝集反応試薬、モノクローナル抗体とポリクローナル
抗体を同一のリポソーム表面に固定した免疫凝集反応試
薬、モノクローナル抗体をリポソーム表面に固定したも
のとポリクローナル抗体を別のリポソーム表面に固定し
たものとを混合した免疫凝集反応試薬が挙げられる。
【００１７】前記のように、ポリクローナル抗体とモノ
クローナル抗体を併用した免疫凝集反応試薬では、抗原
との親和力の強いモノクローナル抗体がポリクローナル
抗体の低親和力を補い、且つ凝集特性に優れたポリクロ
ーナル抗体がモノクローナル抗体の組み合わせの選択の
煩雑を回避できる特徴を有する。このリポソーム表面に
固定される抗体は、例えば、ＩｇＧ分画のまま用いても
よいし、そのフラグメントであるＦ（ａｂ’）2 化され
たものを用いてもよい。
クローナル抗体を併用した免疫凝集反応試薬では、抗原
との親和力の強いモノクローナル抗体がポリクローナル
抗体の低親和力を補い、且つ凝集特性に優れたポリクロ
ーナル抗体がモノクローナル抗体の組み合わせの選択の
煩雑を回避できる特徴を有する。このリポソーム表面に
固定される抗体は、例えば、ＩｇＧ分画のまま用いても
よいし、そのフラグメントであるＦ（ａｂ’）2 化され
たものを用いてもよい。
【００１８】本発明においてリポソーム表面に固定され
る抗原には、主に血漿タンパク、ウイルス性タンパク等
が挙げられる。本発明の免疫凝集反応試薬による免疫分
析方法に適用される被測定抗原物質には、ホルモン（例
えば、インシュリン、ＨＣＧ−β、成長ホルモン、ＴＳ
Ｈ、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン、サイロキシン、トリ
ヨードサイロニン、ガストリン、グルカゴン、ソマトス
タチン等）、酵素（例えば、エラスターゼ、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、エノ
ラーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、血清タンパク
質（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｄ、ＲＦ、ＳＬＯ、マクログロブリン、ＴＢＧ、糖タン
パク質、糖脂質、アポＡＩ、ＡII、Ｂ、ＣＩ、ＣII、Ｃ
III 、Ｄ、Ｅ、Ｆタンパク質等）、腫瘍関連抗原（例え
ば、ＣＥＡ、α−フェトプロテイン、フェリチン、ＰＯ
Ａ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５等）、ＤＮＡ結合性タン
パク質因子、サイトカイン（例えば、インターフェロ
ン、インターロイキン１、インターロイキン２等）、種
々の細菌、ウイルス、原虫等（例えば、真菌、連鎖球
菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイル
ス、トキソプラズマ原虫、マラリア原虫、赤痢アメーバ
ー等）などが挙げられる。これらのうち、特に大量の被
検体を短時間で測定する必要のある血清タンパク質、腫
瘍関連抗原、ウイルス等が好適に適用できる。
る抗原には、主に血漿タンパク、ウイルス性タンパク等
が挙げられる。本発明の免疫凝集反応試薬による免疫分
析方法に適用される被測定抗原物質には、ホルモン（例
えば、インシュリン、ＨＣＧ−β、成長ホルモン、ＴＳ
Ｈ、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン、サイロキシン、トリ
ヨードサイロニン、ガストリン、グルカゴン、ソマトス
タチン等）、酵素（例えば、エラスターゼ、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、エノ
ラーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、血清タンパク
質（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｄ、ＲＦ、ＳＬＯ、マクログロブリン、ＴＢＧ、糖タン
パク質、糖脂質、アポＡＩ、ＡII、Ｂ、ＣＩ、ＣII、Ｃ
III 、Ｄ、Ｅ、Ｆタンパク質等）、腫瘍関連抗原（例え
ば、ＣＥＡ、α−フェトプロテイン、フェリチン、ＰＯ
Ａ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５等）、ＤＮＡ結合性タン
パク質因子、サイトカイン（例えば、インターフェロ
ン、インターロイキン１、インターロイキン２等）、種
々の細菌、ウイルス、原虫等（例えば、真菌、連鎖球
菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイル
ス、トキソプラズマ原虫、マラリア原虫、赤痢アメーバ
ー等）などが挙げられる。これらのうち、特に大量の被
検体を短時間で測定する必要のある血清タンパク質、腫
瘍関連抗原、ウイルス等が好適に適用できる。
【００１９】被測定抗体物質には、例えば、ウイルスに
対する抗体（例えば、ＨＩＶ、ＡＴＬ、ＨＢ等）、抗核
抗体等が挙げられる。本発明の免疫凝集反応試薬を用い
た免疫分析法による被検試料中の成分の定量は、例えば
次のようにして行なわれる。まず、本発明の免疫凝集反
応試薬及び測定対象物を含む試料を適当な緩衝液（例え
ば、ＴＥＳ緩衝液）中で混合し、抗原−抗体結合反応を
引き起こさせ、それに伴うリポソームの凝集を形成させ
る。その凝集量に依存した光の透過光の減少を分光光度
計または自動分析機（日立７０５，７０５０，７１５
０，７３６，７０７０など）により測定し、例えば、予
め作成した検量線との照合により、試料中の測定対象物
の量を測定することができる。
対する抗体（例えば、ＨＩＶ、ＡＴＬ、ＨＢ等）、抗核
抗体等が挙げられる。本発明の免疫凝集反応試薬を用い
た免疫分析法による被検試料中の成分の定量は、例えば
次のようにして行なわれる。まず、本発明の免疫凝集反
応試薬及び測定対象物を含む試料を適当な緩衝液（例え
ば、ＴＥＳ緩衝液）中で混合し、抗原−抗体結合反応を
引き起こさせ、それに伴うリポソームの凝集を形成させ
る。その凝集量に依存した光の透過光の減少を分光光度
計または自動分析機（日立７０５，７０５０，７１５
０，７３６，７０７０など）により測定し、例えば、予
め作成した検量線との照合により、試料中の測定対象物
の量を測定することができる。
【００２０】
【実施例】次の実施例１は、リポソーム比濁法によるＣ
ＲＰ抗原検出用免疫凝集反応試薬の製造に本発明を適用
したものである。実施例１においては、次に挙げる試薬
及び測定用検体を使用した。後述の実施例２及び比較例
１、２においても特に指示のない限り、同名の試薬及び
検体については同じものを使用した。
ＲＰ抗原検出用免疫凝集反応試薬の製造に本発明を適用
したものである。実施例１においては、次に挙げる試薬
及び測定用検体を使用した。後述の実施例２及び比較例
１、２においても特に指示のない限り、同名の試薬及び
検体については同じものを使用した。
【００２１】 ＤＰＰＣ： ジパルミトイルフォスファチジルコリン、 Ｃｈｏｌ： コレステロール、 ＤＴＰ−ＤＰＰＥ： ジチオピリジル化ジパルミトイル
フォスファチジルエタノールアミン Ａａｍ溶液： アクリルアミド及びＢｉｓ−アクリルア
ミドを精製水に溶解し、ゲル濃度２．５％、架橋度５％
となるように調製する。
フォスファチジルエタノールアミン Ａａｍ溶液： アクリルアミド及びＢｉｓ−アクリルア
ミドを精製水に溶解し、ゲル濃度２．５％、架橋度５％
となるように調製する。
【００２２】ＴＥＳ： ＴＥＳ、塩化ナトリウム、ミラ
クルモルノン（商品名：片山化学工業研究所製）を精製
水に溶解し、ＴＥＳ、塩化ナトリウム、ミラクルモルノ
ン（商品名：片山化学工業研究所製）の終濃度がそれぞ
れ１０ｍＭ、１５０ｍＭ、０．０１％となるように溶解
し、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調製する。 酢酸緩衝液： 酢酸、塩化ナトリウム、ミラクルモルノ
ンを精製水に溶解し酢酸、塩化ナトリウム、ミラクルモ
ルノン（商品名：片山化学工業研究所製）の終濃度がそ
れぞれ１００ｍＭ、１５０ｍＭ、０．０１％となるよう
に溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨを４．５に調製す
る。
クルモルノン（商品名：片山化学工業研究所製）を精製
水に溶解し、ＴＥＳ、塩化ナトリウム、ミラクルモルノ
ン（商品名：片山化学工業研究所製）の終濃度がそれぞ
れ１０ｍＭ、１５０ｍＭ、０．０１％となるように溶解
し、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調製する。 酢酸緩衝液： 酢酸、塩化ナトリウム、ミラクルモルノ
ンを精製水に溶解し酢酸、塩化ナトリウム、ミラクルモ
ルノン（商品名：片山化学工業研究所製）の終濃度がそ
れぞれ１００ｍＭ、１５０ｍＭ、０．０１％となるよう
に溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨを４．５に調製す
る。
【００２３】ＳＰＤＰ：Ｎ−ハイドロオキシスクシンイ
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート ＤＴＴ：ジチオスレイトール ヤギ抗ＣＲＰ抗体：１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１５
０ｍＭ塩化ナトリウム含有ｐＨ７．５）に溶解したも
の。
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート ＤＴＴ：ジチオスレイトール ヤギ抗ＣＲＰ抗体：１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１５
０ｍＭ塩化ナトリウム含有ｐＨ７．５）に溶解したも
の。
【００２４】〔実施例１〕 （Ａ）リポソームの調製 ＤＰＰＣ ５０μｍｏｌ、Ｃｈｏｌ ５０μｍｏｌ、Ｄ
ＴＰ−ＤＰＰＥ ２．５μｍｏｌのクロロホルム溶液を
１００ｍｌ容ナシ型フラスコに分注し、加温しながらエ
バポレーションしてクロロホルムを留去する。このとき
脂質及びコレステロールはフラスコ内壁に薄膜を形成す
る。更に１時間以上減圧下にフラスコを置き、溶媒を完
全に除去する。
ＴＰ−ＤＰＰＥ ２．５μｍｏｌのクロロホルム溶液を
１００ｍｌ容ナシ型フラスコに分注し、加温しながらエ
バポレーションしてクロロホルムを留去する。このとき
脂質及びコレステロールはフラスコ内壁に薄膜を形成す
る。更に１時間以上減圧下にフラスコを置き、溶媒を完
全に除去する。
【００２５】その後、２ｍｌのＡａｍ溶液、２ｇのガラ
スビーズを加え激しく攪拌して薄膜を剥がしとる。ガラ
スビーズを除去した後、脂質懸濁液をエクストゥルーダ
ーを用いて０．２μｍまでサイジングして粒径の均一な
リポソームを調製する。リポソームに内包されなかった
Ａａｍ溶液はＴＥＳに一昼夜透析することによって除去
する。
スビーズを加え激しく攪拌して薄膜を剥がしとる。ガラ
スビーズを除去した後、脂質懸濁液をエクストゥルーダ
ーを用いて０．２μｍまでサイジングして粒径の均一な
リポソームを調製する。リポソームに内包されなかった
Ａａｍ溶液はＴＥＳに一昼夜透析することによって除去
する。
【００２６】その後、精製水に１０％となるように溶解
した過硫酸アンモニウム３３μｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′
−テトラメチルエチレンジアミン１４μｌを加え室温で
４〜１６時間反応させ、内包したＡａｍ溶液を重合させ
る。反応後の過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′
−テトラメチルエチレンジアミンをＴＥＳに一昼夜透析
することによって除去し、ゲル化合物内包リポソームを
調製する。こうして得られたリポソームの濃度はリン定
量により決定する。
した過硫酸アンモニウム３３μｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′
−テトラメチルエチレンジアミン１４μｌを加え室温で
４〜１６時間反応させ、内包したＡａｍ溶液を重合させ
る。反応後の過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′
−テトラメチルエチレンジアミンをＴＥＳに一昼夜透析
することによって除去し、ゲル化合物内包リポソームを
調製する。こうして得られたリポソームの濃度はリン定
量により決定する。
【００２７】（Ｂ）抗体への反応基の導入 ヤギ抗ＣＲＰ抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌに３０ｍＭ
ＳＰＤＰ（エタノール溶解）１０μｌを加え、室温で
３０分間反応させる。その後酢酸緩衝液で平衝化したセ
ファデックスＧ−２５でゲル濾過し、緩衝液の交換とと
もに未反応のＳＰＤＰを除去する。得られた抗体溶液に
ＤＴＴを終濃度１０ｍＭとなるように添加し室温で３０
分間反応させる。その後ＴＥＳで平衝化したセファデッ
クスＧ−２５でゲル濾過し、緩衝液の交換とともに、Ｄ
ＴＴを除去する。得られた抗体溶液は、分光光度計で２
８０ｎｍの吸光度を測定し濃度を決定する。
ＳＰＤＰ（エタノール溶解）１０μｌを加え、室温で
３０分間反応させる。その後酢酸緩衝液で平衝化したセ
ファデックスＧ−２５でゲル濾過し、緩衝液の交換とと
もに未反応のＳＰＤＰを除去する。得られた抗体溶液に
ＤＴＴを終濃度１０ｍＭとなるように添加し室温で３０
分間反応させる。その後ＴＥＳで平衝化したセファデッ
クスＧ−２５でゲル濾過し、緩衝液の交換とともに、Ｄ
ＴＴを除去する。得られた抗体溶液は、分光光度計で２
８０ｎｍの吸光度を測定し濃度を決定する。
【００２８】（Ｃ）抗体結合リポソームの調製 前記（Ａ）で調製したリポソーム（リン濃度１０ｎｍ）
１ｍｌと前記（Ｂ）で調製した抗体溶液（濃度５ｍｇ／
ｍｌ）１ｍｌを混合し、４℃で１６〜２０時間反応させ
る。その後、ＴＥＳで平衝化したセファロースＣＬ−４
Ｂでゲル濾過を行ない、未反応の抗体を除去し、リポソ
ーム分画を分取する。得られた抗体が共有結合したリポ
ソームについてリン定量を行ない濃度を決定した後、ロ
ーリー法によりリン当りのタンパク質結合量を求める。
また、粒度分布測定機により粒径の確認を行なう。
１ｍｌと前記（Ｂ）で調製した抗体溶液（濃度５ｍｇ／
ｍｌ）１ｍｌを混合し、４℃で１６〜２０時間反応させ
る。その後、ＴＥＳで平衝化したセファロースＣＬ−４
Ｂでゲル濾過を行ない、未反応の抗体を除去し、リポソ
ーム分画を分取する。得られた抗体が共有結合したリポ
ソームについてリン定量を行ない濃度を決定した後、ロ
ーリー法によりリン当りのタンパク質結合量を求める。
また、粒度分布測定機により粒径の確認を行なう。
【００２９】（Ｄ）ＣＲＰ抗原の測定 前記（Ｃ）で調整した抗体が共有結合したリポソームを
ＴＥＳでリン濃度１ｍＭとなるように希釈して免疫凝集
反応試薬とする。測定機には日立７１５０型自動分析装
置を用いて、ＣＲＰ精製抗原７μｌ及び免疫凝集反応試
薬２８０μｌを用い、測定主波長３４０ｎｍ、測定副波
長７００ｎｍ、測定ポイント２４−５０の条件下でＣＲ
Ｐ抗原を測定する。その結果を図１に示す。
ＴＥＳでリン濃度１ｍＭとなるように希釈して免疫凝集
反応試薬とする。測定機には日立７１５０型自動分析装
置を用いて、ＣＲＰ精製抗原７μｌ及び免疫凝集反応試
薬２８０μｌを用い、測定主波長３４０ｎｍ、測定副波
長７００ｎｍ、測定ポイント２４−５０の条件下でＣＲ
Ｐ抗原を測定する。その結果を図１に示す。
【００３０】図１において、縦軸は各被検検体による吸
光度の変化をｍＡＢＳの単位で示す。なお、吸光度は、
ＣＲＰ抗原０濃度の時の試薬のブランクを差し引いたも
のである。また横軸はＣＲＰ抗原濃度をｍｇ／ｄｌの単
位で示す。 〔比較例１〕前記（Ａ）のＡａｍ溶液の代わりにＴＥＳ
を用いること、及び過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，
Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンを使用しな
いことを除けば、前記実施例１と同様の操作を繰り返
す。その結果を図１に示す。縦軸、横軸の表示は同様で
ある。図１の結果から明らかなように、リポソームにゲ
ル化合物を内包させて屈折率を上げることによって、抗
体結合リポソームが反応した時の吸光度変化量は約１．
７倍になり、感度が高いＣＲＰ抗原検出用免疫凝集反応
試薬が得られることが分かる。
光度の変化をｍＡＢＳの単位で示す。なお、吸光度は、
ＣＲＰ抗原０濃度の時の試薬のブランクを差し引いたも
のである。また横軸はＣＲＰ抗原濃度をｍｇ／ｄｌの単
位で示す。 〔比較例１〕前記（Ａ）のＡａｍ溶液の代わりにＴＥＳ
を用いること、及び過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，
Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンを使用しな
いことを除けば、前記実施例１と同様の操作を繰り返
す。その結果を図１に示す。縦軸、横軸の表示は同様で
ある。図１の結果から明らかなように、リポソームにゲ
ル化合物を内包させて屈折率を上げることによって、抗
体結合リポソームが反応した時の吸光度変化量は約１．
７倍になり、感度が高いＣＲＰ抗原検出用免疫凝集反応
試薬が得られることが分かる。
【００３１】なお、前記実施例１とこの比較例１で使用
したリポソームの感作量は、リン量１モルに対して約１
５０ｇであった。 〔実施例２〕 リポソーム比濁法によるＲＦ検出用免疫凝集反応試薬 リポソームの調製は前記実施例１と同じ方法で行う。ま
た、抗原結合リポソームの調製方法は、前記実施例１に
おける抗体結合リポソームの調製方法において、ヤギ抗
ＣＲＰ抗体にかえて抗原として熱変性ヒトＩｇＧを使用
する以外は前記実施例１と同様に調製して抗原結合リポ
ソームを得る。
したリポソームの感作量は、リン量１モルに対して約１
５０ｇであった。 〔実施例２〕 リポソーム比濁法によるＲＦ検出用免疫凝集反応試薬 リポソームの調製は前記実施例１と同じ方法で行う。ま
た、抗原結合リポソームの調製方法は、前記実施例１に
おける抗体結合リポソームの調製方法において、ヤギ抗
ＣＲＰ抗体にかえて抗原として熱変性ヒトＩｇＧを使用
する以外は前記実施例１と同様に調製して抗原結合リポ
ソームを得る。
【００３２】ＲＦの測定：上記の方法で調製した抗原感
作リポソームをＴＥＳでリン濃度０．２５ｍＭとなるよ
うに希釈して第二試薬とする。なお第一試薬は、ＴＥＳ
を使用するものをいう。測定機は日立７１５０型自動分
析装置を用いて、ＲＦ陽性血清１０μｌ、第一試薬３０
０μｌ及び第二試薬１００μｌを使用し、測定主波長３
４０ｎｍ、測定副波長７００ｎｍ、測定ポイント２４−
５０の条件下でＲＦを測定する。その結果を図２に示
す。
作リポソームをＴＥＳでリン濃度０．２５ｍＭとなるよ
うに希釈して第二試薬とする。なお第一試薬は、ＴＥＳ
を使用するものをいう。測定機は日立７１５０型自動分
析装置を用いて、ＲＦ陽性血清１０μｌ、第一試薬３０
０μｌ及び第二試薬１００μｌを使用し、測定主波長３
４０ｎｍ、測定副波長７００ｎｍ、測定ポイント２４−
５０の条件下でＲＦを測定する。その結果を図２に示
す。
【００３３】図２において縦軸は各被検検体による吸光
度の変化をｍＡＢＳの単位で示す。なお吸光度はＲＦ抗
原０濃度の時の試薬ブランクを差し引いたものである。
また、横軸はＲＦ濃度を示す。 〔比較例２〕熱変性ヒトＩｇＧを前記比較例１と同様に
して感作し、前記実施例２の（Ａ）と同様にしてＲＦを
測定し、得られた結果を図２に示す。図２の結果から明
らかなように前記実施例１の場合と同様にリポソームに
ゲル化合物を内包させ、屈折率を上げることによって、
リポソームが反応した時の吸光度変化量は約１．４倍に
なり感度が高いＲＦ用診断試薬が得られることが分か
る。なお、前記実施例２とこの比較例２共に感作量は、
リン量１モルに対し約２１０ｇであった。
度の変化をｍＡＢＳの単位で示す。なお吸光度はＲＦ抗
原０濃度の時の試薬ブランクを差し引いたものである。
また、横軸はＲＦ濃度を示す。 〔比較例２〕熱変性ヒトＩｇＧを前記比較例１と同様に
して感作し、前記実施例２の（Ａ）と同様にしてＲＦを
測定し、得られた結果を図２に示す。図２の結果から明
らかなように前記実施例１の場合と同様にリポソームに
ゲル化合物を内包させ、屈折率を上げることによって、
リポソームが反応した時の吸光度変化量は約１．４倍に
なり感度が高いＲＦ用診断試薬が得られることが分か
る。なお、前記実施例２とこの比較例２共に感作量は、
リン量１モルに対し約２１０ｇであった。
【００３４】図１及び図２により、以下のことが示され
る。即ち、凝集反応を基にした免疫凝集反応試薬におい
て、担体として用いるリポソームに水溶性高分子化合物
又はゲル化処理された化合物を内包することで測定感度
を上げることができることが確認された。
る。即ち、凝集反応を基にした免疫凝集反応試薬におい
て、担体として用いるリポソームに水溶性高分子化合物
又はゲル化処理された化合物を内包することで測定感度
を上げることができることが確認された。
【００３５】
【発明の効果】本発明の免疫凝集反応試薬を用いて、被
検物に含まれる抗原又は抗体の測定を行なえば、抗原−
抗体反応に基づくリポソームの凝集により生じる濁度変
化を高めることができるので、被検体中に存在する物質
が低濃度であっても感度よく測定することができる。
検物に含まれる抗原又は抗体の測定を行なえば、抗原−
抗体反応に基づくリポソームの凝集により生じる濁度変
化を高めることができるので、被検体中に存在する物質
が低濃度であっても感度よく測定することができる。
【００３６】また、本発明によれば、担体として抗原性
の少ないリポソームを用いるため非特異的な凝集反応が
起こりにくい。更に、本発明の免疫凝集反応試薬を使用
すれば、自動分析装置による測定が可能であるため、大
量の検体を一度に短時間で測定することができる。ま
た、自動分析装置内を汚染することがないので、安定し
て測定ができる。
の少ないリポソームを用いるため非特異的な凝集反応が
起こりにくい。更に、本発明の免疫凝集反応試薬を使用
すれば、自動分析装置による測定が可能であるため、大
量の検体を一度に短時間で測定することができる。ま
た、自動分析装置内を汚染することがないので、安定し
て測定ができる。
【図１】ゲル化合物内包リポソームとＴＥＳ緩衝液内包
リポソームを担体として用いたＣＲＰ測定用免疫凝集反
応試薬による標準曲線を示す。
リポソームを担体として用いたＣＲＰ測定用免疫凝集反
応試薬による標準曲線を示す。
【図２】ゲル化合物内包リポソームとＴＥＳ緩衝液内包
リポソームを担体として用いたＲＦ測定用免疫凝集反応
試薬による標準曲線を示す。
リポソームを担体として用いたＲＦ測定用免疫凝集反応
試薬による標準曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−214668（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−94636（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−201568（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】 抗原抗体反応で生じた凝集量を測定する
ための免疫凝集反応試薬において、 （１）免疫凝集反応試薬の担体としてリポソームが使用
され、 （２）該リポソーム表面に抗体または抗原が固定化さ
れ、 （３）該リポソームには、水溶性高分子化合物又はゲル
化処理された化合物が内包されている、ことを特徴とす
る免疫凝集反応試薬。 - 【請求項２】 抗体または抗原が共有結合によりリポソ
ーム表面に固定されたものである請求項１記載の免疫凝
集反応試薬。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の免疫凝集反応試
薬を被検体に作用せしめ、抗原抗体反応により生じたリ
ポソームの凝集量を透過光の減少として測定することを
特徴とする免疫分析方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5016167A JP2711974B2 (ja) | 1993-02-03 | 1993-02-03 | 免疫凝集反応試薬及び免疫分析方法 |
| CA002153874A CA2153874A1 (en) | 1993-02-03 | 1994-02-01 | Reagent for immunoagglutination and immunoanalytical method |
| US08/464,866 US5756363A (en) | 1993-02-03 | 1994-02-01 | Liposome reagent for immunoagglutination and immunoanalytical method |
| EP94905240A EP0683397A4 (en) | 1993-02-03 | 1994-02-01 | REAGENT ON IMMUNOAGGLUTINATION AND IMMUNOANALYTIC PROCEDURE |
| PCT/JP1994/000136 WO1994018567A1 (en) | 1993-02-03 | 1994-02-01 | Reagent for immunoagglutination and immunoanalytical method |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5016167A JP2711974B2 (ja) | 1993-02-03 | 1993-02-03 | 免疫凝集反応試薬及び免疫分析方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06230010A JPH06230010A (ja) | 1994-08-19 |
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Family
ID=11908957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5016167A Expired - Fee Related JP2711974B2 (ja) | 1993-02-03 | 1993-02-03 | 免疫凝集反応試薬及び免疫分析方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5756363A (ja) |
| EP (1) | EP0683397A4 (ja) |
| JP (1) | JP2711974B2 (ja) |
| CA (1) | CA2153874A1 (ja) |
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| AU5395000A (en) * | 1999-05-27 | 2000-12-18 | Zeptosens Ag | Vesicle containing polymers and sensor detection methods based thereon |
| FR2821431B1 (fr) * | 2001-02-28 | 2003-11-21 | Louis Lery | Reactif destine au depistage ante-morten d'atnc |
| CN104237525B (zh) * | 2013-06-24 | 2016-04-13 | 北京美康生物技术研究中心有限责任公司 | 一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN104215771B (zh) * | 2014-08-14 | 2015-12-30 | 上海睿康生物科技有限公司 | 一种基于脂质体信号放大的超敏c-反应蛋白检测试剂盒 |
| CN112180079B (zh) * | 2020-09-25 | 2024-04-19 | 上海睿康生物科技有限公司 | 一种稳定的脂质体颗粒及其在免疫比浊检测中的应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5594636A (en) * | 1979-01-09 | 1980-07-18 | Fuji Photo Film Co Ltd | Microcapsule for antigen-antibody reaction and detecting method for antigen-antibody reaction using said microcapsule |
| US4598051A (en) * | 1980-03-12 | 1986-07-01 | The Regents Of The University Of California | Liposome conjugates and diagnostic methods therewith |
| US4762915A (en) * | 1985-01-18 | 1988-08-09 | Liposome Technology, Inc. | Protein-liposome conjugates |
| JPS63201568A (ja) * | 1987-02-18 | 1988-08-19 | Green Cross Corp:The | 免疫分析方法 |
| JPS63214668A (ja) * | 1987-03-03 | 1988-09-07 | Hitachi Ltd | 細胞測定方法 |
| US5000960A (en) * | 1987-03-13 | 1991-03-19 | Micro-Pak, Inc. | Protein coupling to lipid vesicles |
| JPH07117542B2 (ja) * | 1987-05-01 | 1995-12-18 | 工業技術院長 | 免疫センサー、その形成方法および免疫センサーによる抗原の濃度の測定方法 |
| IL98473A (en) * | 1991-06-12 | 1995-08-31 | Yeda Res & Dev | Liposome immunoassays for detection of antigens antibodies and haptens |
| JPH063358A (ja) * | 1992-06-23 | 1994-01-11 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫分析用試薬 |
-
1993
- 1993-02-03 JP JP5016167A patent/JP2711974B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-02-01 WO PCT/JP1994/000136 patent/WO1994018567A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1994-02-01 CA CA002153874A patent/CA2153874A1/en not_active Abandoned
- 1994-02-01 EP EP94905240A patent/EP0683397A4/en not_active Withdrawn
- 1994-02-01 US US08/464,866 patent/US5756363A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0683397A4 (en) | 2000-09-27 |
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| JPH06230010A (ja) | 1994-08-19 |
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