JP2005241363A - 測定試薬用担体粒子及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】 低濃度領域から高濃度領域にいたる幅広い濃度範囲において高い測定感度及び
高い測定精度で抗原抗体反応を測定することが可能であるとともに、長期試薬安定性にも
優れる測定試薬用担体粒子及びそれを用いてなる測定試薬を提供する。
【解決手段】 フェニル基を有する重合性単量体及びフェニル基とスルホン酸リチウム塩
とを有する重合性単量体を共重合して得られる、担体粒子（Ａ）及び担体粒子（Ｂ）から
なる測定試薬用担体粒子であって、前記担体粒子（Ａ）と前記担体粒子（Ｂ）とは、互い
に異なる平均粒径を有し、前記担体粒子（Ａ）のサイクリックボルタンメトリ測定による
粒子表面のスルホン酸リチウム荷電量は−１０〜−２５μＡであり、前記担体粒子（Ｂ）
のサイクリックボルタンメトリ測定による粒子表面のスルホン酸リチウム荷電量は−３０
〜−４０μＡである測定試薬用担体粒子。
【選択図】 なし

Description

本発明は、免疫反応物質、核酸等の被測定物質（被検査物質）と特異的に結合する物質（
検査物質）の担持用として好適な測定試薬用担体粒子及びそれを用いてなる測定試薬に関
する。

従来より、抗原又は抗体等の血清学的活性物質を担体に感作（吸着又は結合）させて免疫
学的凝集反応を行ない、対応する抗体又は抗原等の存在を検査する免疫血清学的検査は、
簡便且つ鋭敏な方法であるので、広く利用されている。

このような免疫血清学的検査に使用される試薬としては、妊娠診断テスト、リウマチ因子
を検出するＲＡテスト、Ｃ−反応性タンパク質を検出するＣＲＰテストや、β２マイクロ
グロブリン、ヒトフィブリノーゲン、フェリチン、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ抗原）、抗
ＨＢｓ抗体、β２ミクログロブリン抗体、マイコプラズマ抗原、核酸、核タンパク質、エ
ストロゲン、抗エストロゲン抗体等を検出するための数多くの検査試薬が開発されている
。このような免疫血清学的検査に使用される試薬用の担体としてはポリスチレン等の重合
体粒子が広く用いられている。

免疫血清学的検査用担体として使用されるポリスチレンラテックス粒子は、一般に平均粒
径が０．０５〜１μｍ程度であって、粒子分布が狭く粒径の揃ったものが好ましい。この
ようなポリスチレンラテックス粒子は、公知の乳化重合法により製造される（例えば、特
許文献１、特許文献２、非特許文献１参照）。
これらの重合体粒子には、抗原又は抗体等の血清学的活性物質を重合体粒子に感作させた
状態のラテックス（以下、感作ラテックスという）中における重合体粒子がコロイド化学
的安定性（以下、単に安定性ともいう）と免疫血清学的凝集反応性又は凝集阻止反応性と
に優れることが求められる。

しかし、重合体粒子の安定性を向上させると、免疫血清学的凝集反応性の低下（測定感度
の低下）を来し、逆に重合体粒子の免疫学的凝集反応性を向上させると、安定性が低下し
、非特異的に凝集しやすくなって、実用に供し得ないものとなる。

このように、互いに相反する安定性と免疫血清学的凝集反応性とを高いレベルで兼備する
重合体粒子を得ることは極めて困難である。近年、免疫学的検査の分野においては、抗原
又は抗体等の血清学的に活性な微量物質を、定性的のみならす、定量的に測定することが
重要となっている。従来は、感作ラテックスをガラス板上で被測定物質と混合して反応さ
せ、感作ラテックス中の重合体粒子の凝集状態を肉眼で観察することによって、被測定物
質を定量的に検出していたが、最近では、凝集反応の肉眼観察の代わりに、例えば、分光
光度計、濁度計、光錯乱測定装置等の光学的装置を用いて被測定物質を定量的に検出する
ことが行われており、例えば、感作ラテックスが凝集する現象を利用して上澄液の濁度の
減少率を測定する方法、及び、感作ラテックスの凝集による吸光度や散乱光を測定する方
法等が知られている（例えば、特許文献３、非特許文献２等参照）。

上記の原理を利用した測定装置として、日立製作所社製の商品名ＨＩＴＡＣＨＩ−７０７
０、７１５０、７１７０、ＬＰＩＡ−Ａ７００、Ｓ５００等の多数のラテックス凝集反応
自動分析測定機が市販されている。
これらのラテックス凝集反応自動分析測定機は感作ラテックスの免疫血清学的凝集反応に
よる反応系の吸光強度や散乱光強度等の光学的特性の変化を測定することによって被測定
物質を定量的に検出しようとするものである。

これらのラテックス凝集反応自動分析測定機に適用できる担体粒子ラテックスや測定試薬
を開発すべく様々な試みがなされており、例えば、スチレンとスチレンに対し１０重量％
以下のスチレンスルホン酸塩とを乳化剤の不存在下で過硫酸塩を重合開始剤として水中で
共重合させ、次いでアルカリ性の条件下で加熱するラテックスの製造方法が開示されてい
る（例えば、特許文献４参照）。

しかし上記製造方法には、均一な粒径を有し且つ安定性に優れるラテックス粒子を得られ
ないという問題点がある。スチレンに対する重合開始剤の量を増量すれば、均一な粒径を
有し安定性に優れるラテックスを得ることは可能となるが、このラテックスを用いて測定
試薬を調製した場合、測定感度が低くなり、また、非特異的凝集反応を起こす確率が高く
なって、安定性に優れる測定試薬を得られないという別の問題が発生する。

一方、測定試薬の感度向上のために、異なった量の同一抗原又は抗体を担持し、異なった
サイズを有する、少なくとも２種類のラテックス粒子を含有する測定試薬が開示されてい
る（例えば、特許文献５）。また、平均粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子に抗体
又は抗原を感作して混合した懸濁液、又は、平均粒径の異なる２種類以上のラテックス粒
子を混合した後、抗体又は抗原を感作したラテックスと、感作した抗体に対する抗原又は
感作した抗原に対する抗体とを水溶媒中で反応させ、光を照射し、その吸光度変化を測定
して、抗原抗体反応を測定する方法において、平均粒径が０．０５〜０．３μｍの範囲に
あるラテックス粒子と、平均粒径が０．３〜１．０μｍの範囲にあるラテックス粒子とを
混合すること、及び、混合したラテックス粒子の平均粒径の少なくとも２．５倍であり、
かつ、０．６〜２．４μｍの波長の光を照射する抗原抗体反応の測定法が開示されている
（例えば、特許文献６）。

また、不溶性担体粒子に固定した抗体を抗原と反応させ、抗原抗体反応によって生じる不
溶性担体粒子の凝集を観察することによって抗原を検出又は測定する方法であって、抗体
として分析対象抗原に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を用いる免
疫学的粒子凝集反応方法が開示されている（例えば、特許文献７参照）。

また、特定の抗原に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ
、水溶媒中で抗原と反応させ、不溶性担体と抗原の結合物を選択的に凝集させるに当たり
、不溶性担体として平均粒径の異なる２種以上の担体を用い、これら不溶性担体に各モノ
クローナル抗体をそれぞれ担持させることを特徴とする高感度免疫測定法が開示されてい
る（例えば、特許文献８参照）。

更に、大小２種類の担体粒子を用い、平均粒径の小さい方の担体粒子には反応速度の小さ
いモノクローナル抗体を感作し、平均粒径の大きい方の担体粒子には反応速度の大きいモ
ノクローナル抗体を感作した感作粒子混合物を用いて凝集法により免疫測定を行うことが
開示されている(例えば、非特許文献２参照)。

しかし、これらの従来技術文献に開示されているラテックス試薬や測定方法は、いずれも
測定可能な濃度範囲が狭く、特に濃度７０ｍｇ／ｄｌ以上の高濃度領域の測定が困難であ
るという問題点を有する。一般に、臨床検査における免疫血清学的検査では、低濃度領域
に臨床的な判定を下すための重要なポイントを有するものが多いが、一方ではイムノグロ
ブリンのように高濃度で存在する成分のみならず、低濃度領域から高濃度領域にいたる幅
広い濃度範囲で存在する成分も知られている。例えば、炎症マーカーであるＣ−反応性蛋
白質（ＣＲＰ）、血清アルブミンＡ（ＳＡＡ）、アレルギー炎症等の指標となるＩｇＥ等
は、低濃度領域から高濃度領域にいたる幅広い濃度範囲で存在する成分の代表的なもので
ある。
低濃度領域から高濃度領域にいたる幅広い濃度範囲にわたって抗原抗体反応の測定を可能
にするためには、例えば、平均粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子にそれぞれ抗体
又は抗原を感作し、一定の比率で混合するラテックス試薬調製方法により得られるラテッ
クス試薬を用いることが有効とされている（例えば、特許文献６参照）。

上記ラテックス試薬調製方法により得られるラテックス試薬は、平均粒径が小さい方のラ
テックス粒子が有する測定可能な濃度範囲が広いという利点と、平均粒径が大きい方のラ
テックス粒子が有する低濃度領域における測定感度が高いという利点とを兼備するもので
ある。

しかし、上記ラテックス試薬調製方法により得られるラテックス試薬には、確かに測定可
能な濃度範囲は広いものの、測定精度については必ずしも充分ではないという問題点があ
る。また、ラテックス凝集反応自動分析測定機と測定試薬との両面からアプローチするこ
とにより、測定可能な濃度範囲の拡大や測定精度の向上を図る方法も検討されている（例
えば、非特許文献２）。
しかし、上記方法は、高濃度領域における測定が困難であるため、測定可能な濃度範囲は
必ずしも広がっていないという問題点を有する。

特公昭５１−９７１６号公報 特開昭５４−４５３９３号公報 特開昭５４−１０９４９４号公報 特公昭５８−５０６４５号公報 特公昭６３−１４７８３号公報 特許第２５８８１７４号公報 特開平１０−９０２６８号公報 特公平１−３６４８４号公報 特開昭６３−２４０１５号公報 Ｉｍｍｕｎｏｃｈｍｉｓｔｒｙ １２（１９７５）、３４９〜３５１ 医学と薬学 ４２巻、５号（１９９９）、７８１〜７８８頁

本発明は、上記現状に鑑み、低濃度領域から高濃度領域にいたる幅広い濃度範囲において
高い測定感度及び高い測定精度で抗原抗体反応を測定することが可能であるとともに、長
期試薬安定性にも優れる測定試薬用担体粒子及びそれを用いてなる測定試薬を提供するこ
とを目的とする。

本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、測定試薬用担体粒子表面のスルホン酸リチウム荷電
量が互いに異なる特定の範囲にあり、かつ、平均粒径が互いに異なる２種類の担体粒子を
用いることにより、低濃度領域から高濃度領域にいたる幅広い濃度範囲において、特に高
濃度領域において、プロゾーンの影響を受けずに直性性に優れ、高い測定感度及び高い測
定精度で測定することが可能であるとともに、長期試薬安定性にも優れる測定試薬を得ら
れることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、フェニル基を有する重合性単量体及びフェニル基とスルホン酸リチウム
塩とを有する重合性単量体を共重合して得られる、担体粒子（Ａ）及び担体粒子（Ｂ）か
らなる測定試薬用担体粒子であって、上記担体粒子（Ａ）と上記担体粒子（Ｂ）とは、互
いに異なる平均粒径を有し、上記担体粒子（Ａ）のサイクリックボルタンメトリ測定によ
る粒子表面のスルホン酸リチウム荷電量は−１０〜−２５μＡであり、上記担体粒子（Ｂ
）のサイクリックボルタンメトリ測定による粒子表面のスルホン酸リチウム荷電量は−３
０〜−４０μＡである測定試薬用担体粒子である。
以下に本発明を詳述する。

本発明の測定試薬用担体粒子を構成する担体粒子（Ａ）及び担体粒子（Ｂ）は、フェニル
基を有する重合性単量体、及び、フェニル基とスルホン酸リチウム塩とを有する重合性単
量体を共重合して得られるものである。
上記フェニル基を有する重合性単量体としては特に限定されず、例えば、スチレン、ジビ
ニルベンゼン、エチルスチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロ
スチレン、クロロメチルスチレン等が挙げられる。中でも、スチレンが好ましく用いられ
る。これらのフェニル基を有する重合性単量体は単独で用いられてもよく、２種以上が併
用されてもよい。

上記フェニル基とスルホン酸リチウム塩とを有する重合性単量体としては、重合後の担体
粒子表面にスルホン酸リチウム塩基を含有せしめることができる単量体であれば特に限定
されず、例えば、スチレンスルホン酸リチウム塩、ジビニルベンゼンスルホンリチウム酸
塩、エチルスチレンスルホン酸リチウム塩、α−メチルスチレンスルホン酸リチウム塩等
が挙げられる。中でも、スチレンスルホン酸リチウム塩が好ましく用いられる。これらの
フェニル基とスルホン酸リチウム塩とを有する重合性単量体は単独で用いられてもよく、
２種以上が併用されてもよい。

上記フェニル基とスルホン酸リチウム塩とを有する重合性単量体の配合量は、フェニル基
を有する重合性単量体１００重量部に対して、好ましくは、下限が０.０００１重量部、
上限が１０重量部である。０.０００１重量部未満であると、スチレンスルホン酸リチウ
ム塩を有する重合性単量体の添加効果が認められ難くなり、１０重量部を超えると、得ら
れた担体粒子の凝集反応性が低下し感度が鈍くなる場合がある。より好ましくは、下限が
０.０００１重量部、上限が４重量部であり、更に好ましくは、下限が０.０００１重量部
、上限が２重量部であり、特に好ましくは、下限が０.００１重量部、上限が１．５重量
部である。

上記担体粒子（Ａ）及び上記担体粒子（Ｂ）は、互いに異なる平均粒径を有するものであ
る。上記担体粒子（Ａ）及び上記担体粒子（Ｂ）の平均粒径が同じであると、低濃度領域
から高濃度領域にいたる幅広い濃度範囲において、特に高濃度領域において、高い測定感
度及び高い測定精度で抗原抗体反応を測定することが不可能となる。

上記担体粒子（Ａ）及び上記担体粒子（Ｂ）の平均粒径は、互いに異なるものであれば特
に限定されないが、好ましくは、下限が０．０１μｍ、上限が１．５μｍである。上記担
体粒子の好適な平均粒径は該粒子が使用される測定方法、測定機器によって異なるが、上
記範囲をはずれると、測定試薬用担体粒子及び測定試薬の長期安定性が低下して、測定試
薬が非特異的凝集を起こし易くなることがある。また、平均粒径が０．０１μｍ未満であ
ると、凝集による光学的変化量が小さすぎて、測定に必要な感度が得られなかったり、又
は、試薬調製時の遠心分離工程に多くの時間がかかりすぎて効率が悪く試薬コストが高く
なってしまう。また、平均粒径が１．５μｍを超えると、被測定物質が多いときに、担体
粒子の凝集による光学的変化量が測定可能領域を超えてしまい、高濃度領域では被測定物
質の量に応じた光学的変化量が得られず、定量的な測定ができなくなってしまう。より好
ましくは、下限が０．０５μｍ、上限が０．８μｍである。

上記担体粒子（Ａ）及び上記担体粒子（Ｂ）の好適な粒径分布は、該粒子が使用される測
定方法、測定機器によって異なるが、粒径分布が狭く粒子径が揃っていることが好ましい
。粒径が揃っていないと試薬製造時のロット再現性が悪く、これらを試薬に用いた場合、
測定結果の再現性が低下するため好ましくない。
上記粒径分布は、下記式で定義される担体粒子の変動係数（Ｃｖ値）が１０％以下である
ことが好ましく、より好ましくは５％以下であり、特に好ましくは３％以下である。
変動係数（Ｃｖ値）＝（粒子径の標準偏差／平均粒径）×１００

上記担体粒子のサイクリックボルタンメトリ測定による粒子表面のスルホン酸リチウム荷
電量は、担体粒子（Ａ）が−１０〜−２５μＡであり、担体粒子（Ｂ）が−３０〜−４０
μＡである。本発明において、担体粒子のサイクリックボルタンメトリ測定による粒子表
面のスルホン酸リチウム荷電量は、以下のようにして測定する。即ち、透析セルロースチ
ューブ膜に濾過処理後ラテックスを注入後、自動注廃水、及び、攪拌機能付ガラス円筒管
透析装置（積水化学工業社製）を用い、７日間連続処理したラテックスを１０％に調整後
５ｍＬ採取し、蒸留水にて２〜１０％濃度に希釈した試料を用い、Ｗ（作用電極、特殊カ
ーボン電極）で、Ｒｅｆ（Ａｇ・ＡｇＣｌ）電極、Ｃ（対極電極、Ｐｔ）を用い、−１〜
１Ｖまでサイクリックボルタンメトリ（ＣＶ）を測定する。

本発明者は、担体粒子表面のスルホン酸リチウム荷電量が抗原抗体反応に重要な影響を及
ぼすことを見出し、担体粒子の表面荷電量を特定の範囲に限定した。
上記担体粒子（Ａ）のサイクリックボルタンメトリ測定による粒子表面のスルホン酸リチ
ウム荷電量が−１０μＡ未満であると、調製された測定試薬が非特異的凝集を起こし易く
なり、逆に−２５μＡを超えると、担体粒子及び得られる測定試薬の長期安定性が不充分
となる。

上記担体粒子（Ｂ）のサイクリックボルタンメトリ測定による粒子表面のスルホン酸リチ
ウム荷電量が−３０μＡ未満であると、調製された測定試薬が、特に高濃度領域において
免疫血清学的凝集反応性が低下して、測定感度や測定精度が不充分となり、逆に−４５μ
Ａを超えると、得られる測定試薬は低濃度領域から高濃度領域にいたる全ての濃度範囲に
おいて免疫血清学的凝集反応性が低下して、測定感度や測定精度が不充分となる。

上記担体粒子（Ａ）及び上記担体粒子（Ｂ）の混合比率は特に限定されないが、固形分換
算の重量比で、担体粒子（Ａ）／担体粒子（Ｂ）＝１／１０〜１０／１であることが好ま
しい。上記範囲外であると、低濃度領域から高濃度領域にいたる幅広い濃度範囲において
、特に高濃度領域において、高い測定感度及び高い測定精度で抗原抗体反応を測定するこ
とが不可能となる。

上記担体粒子（Ａ）及び上記担体粒子（Ｂ）を製造する方法としては、例えば、溶媒とし
て水が仕込まれた反応器内に、上記フェニル基を有する重合性単量体、及び、上記フェニ
ル基とスルホン酸リチウム塩とを有する重合性単量体を加え、重合開始剤を添加し、窒素
雰囲気化で攪拌しながら加熱して共重合を行う方法等が挙げられる。この製造方法におけ
る重合反応温度は、下限が５０℃、上限が１００℃であり、好ましくは、下限が６０℃、
上限が８５℃である。また、重合反応に要する時間は、重合性単量体組成、重合性単量体
濃度、重合開始剤等により変わるが、通常５〜５０時間である。

上記重合開始剤としては特に限定されないが、例えば、過硫酸塩類が使用され、具体的に
は、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等が好適に用いられる。上
記重合開始剤の添加量としては、重合性単量体１００重量部に対して、下限が０．０１重
量部、上限が１重量部であることが好ましい。０．０１重量部未満であると、重合がスム
ースに進行しない場合があり、１重量部を超えると、重合時にエマルションがクリーム状
化したり、得られた担体粒子を試薬として使用する際に、抗原・抗体が吸着し難くなり非
特異凝集を起こし易く、凝集反応性が低下し感度が鈍くなることがある。

上記担体粒子（Ａ）及び上記担体粒子（Ｂ）の共重合反応は、乳化剤の存在（共存）下で
行ってもよいし、乳化剤の非存在（非共存）下で行ってもよい。
上記乳化剤としては特に限定されず、例えば、エーテル型、エーテルエステル型、エステ
ル型、含窒素型等のノニオン性（非イオン性）界面活性剤；カルボン酸塩、スルホン酸塩
、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩等のアニオン性（陰イオン性）界面活性剤、脂肪族
４級アンモニウム塩等のカチオン性（陽イオン性）界面活性剤；ベタイン型、アミノカル
ボン酸塩型等の両面界面活性剤等が挙げられる。これらの乳化剤は、単独で用いられても
よく、２種以上が併用されてもよい。
上記乳化剤を用いた場合には、重合後の後処理工程において、例えば、重合後に透析等を
行うことにより乳化剤を除去することが好ましい。

上記乳化剤の使用量は、得られる担体粒子のサイクリックボルタンメトリ測定による粒子
表面のスルホン酸リチウム荷電量が、担体粒子（Ａ）では−１０〜−２５μＡとなり、上
記担体粒子（Ｂ）では−３０〜−４０μＡとなる量であればよく特に限定されないが、フ
ェニル基を有する重合性単量体に対して、１重量％以下であることが好ましく、より好ま
しくは０．５重量％以下であり、更に好ましくは、下限が０．０１重量％、上限が０．０
２重量％である。

上述のとおり、上記担体粒子（Ａ）及び上記担体粒子（Ｂ）の共重合反応は、乳化剤の存
在（共存）下で行ってもよいし、乳化剤の非存在（非共存）下で行ってもよいが、得られ
る担体粒子（Ａ）及び担体粒子（Ｂ）の耐湿性や耐水性がより優れたものとなることから
、乳化剤の非存在下で共重合反応を行うことが好ましい。換言すれば、上記担体粒子（Ａ
）及び上記担体粒子（Ｂ）は、実質的に乳化剤を含有していないことが好ましい。

このようにして得られた本発明の測定試薬用担体粒子に、被測定物質と特異的に結合する
物質を担持させることにより測定試薬を得ることができる。このような測定試薬もまた、
本発明の１つである。

本発明における被測定物質と特異的に結合する物質としては、免疫学的凝集反応及び凝集
阻止反応を利用する免疫血清学的検査試薬や生化学測定法において、通常使用される生理
活性物質であれば特に限定されないが、なかでも、抗原又は抗体として機能するものが好
ましく用いられる。

上記抗原又は抗体として機能するものとしては、例えば、タンパク質、核酸、核タンパク
質、エストロゲン脂質等が挙げられる。
上記抗原としては、例えば、各種抗原、レセプター、酵素等が挙げられ、より具体的には
、β２マイクログロブリン、Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）、ヒトフィブリノーゲン、フェ
リチン、リウマチ因子（ＲＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、マイコプラズマ抗原
、ＨＢｓ抗原等が例示される。

上記抗体としては、例えば、各種の毒素や病原菌等に対する抗体が挙げられ、より具体的
には、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗エストロゲン抗体、β２マイクログロブリン抗体、
梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗
体等が例示される。また、上記抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、例えば、Ｆ
（ａｂ’）２のような免疫グロブリン分子の断片であってもよい。

上記被測定物質と特異的に結合する物質の担持量は、その種類により異なるため特に限定
されない。
本発明の測定試薬用担体粒子に、被測定物質と特異的に結合する物質を担持する方法とし
ては特に制限されず、従来公知の方法により、物理的及び／又は化学的結合により担持さ
せればよい。

本発明の測定試薬は、適当な検体希釈液で希釈されてもよい。上記検体希釈液としてはｐ
Ｈ５．０〜９．０の緩衝液であれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、グリシ
ン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。

本発明の測定試薬は、例えば、測定感度の向上や、抗原抗体反応の促進のために種々の増
感剤を用いてもよい。上記増感剤としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロー
ス等のアルキル化多糖類；プルラン、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

本発明の測定試薬は、検体中に存在する他の物質により起こる非特異的凝集反応を抑制す
るため、又は、試薬の安定性を高めるために、アルブミン（牛血清アルブミン、卵性アル
ブミン）、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質、タンパク質分解物、アミノ酸、界面活性
剤等を含有してもよい。

本発明の測定試薬を用いて、検体中の被測定物質と、該被測定物質に特異的に結合する物
質との反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定することにより、検体中の被測定物
質の反応量を測定することができる。

上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては、公知の方法が用いられ、例えば、凝
集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布又は平均粒径の変化
としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光
強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。上記の測定法においては、異なる時
点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分、すなわち増
加速度に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、及び、通常は反応の終
点と考えられるある時点で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終
点試験（エンドポイントアッセイ）を利用できるが、測定の簡便性、迅速性の点から比濁
法による速度試験を行うことが好ましい。

このような本発明の測定試薬用担体粒子及びそれを用いてなる測定試薬によれば、低濃度
領域から高濃度領域にいたる幅広い濃度範囲において、特に高濃度領域において、高い測
定感度及び高い測定精度で抗原抗体反応を測定することが可能であり、かつ、長期安定性
にも優れる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。

＜担体粒子の製造＞
攪拌機、冷却コイル、温度検出器、ジャケット等を装備したガラス反応器（容量２Ｌ）に
、表１に記載した組成で水、スチレン及びスチレンスルホン酸リチウムを仕込み、窒素置
換したのち、攪拌しながら反応温度を７１〜７３℃に制御して４８時間共重合反応を行な
った。重合開始剤としては過硫酸カリウムを用い、過硫酸カリウム０．５ｇを蒸留水１０
ｇに溶解し水溶液として使用した。得られたラテックスを取り出し、ペーパー濾紙にて濾
過した。濾過処理後、得られた担体粒子の平均粒径、固形分濃度、及び、サイクリックボ
ルタンメトリ測定による担体粒子表面のスルホン酸リチウム荷電量を測定した。なお、担
体粒子の平均粒径は、透過型電子顕微鏡にて担体粒子を撮影し、直接続された画像解析装
置により測定した。

サイクリックボルタンメトリ測定による担体粒子表面のスルホン酸リチウム荷電量は、透
析セルロースチューブ膜に濾過処理後ラテックスを注入後、自動注廃水、及び、攪拌機能
付ガラス円筒管透析装置（積水化学工業社製）を用い、７日間連続処理したラテックスを
１０％に調整後５ｍＬ採取し、蒸留水にて１．２５〜１０％濃度に希釈調整した試料を用
い、Ｗ（作用電極、特殊カーボン電極）で、Ｒｅｆ（Ａｇ・ＡｇＣｌ）電極、Ｃ（対極電
極、Ｐｔ）を用い、−１〜１Ｖまでサイクリックボルタンメトリ（ＣＶ）の測定を行った
。
結果を表１及び表２に示した。

＜試薬の調製＞
試料１の担体粒子を固形分濃度が１０％濃度となるようにグリシン緩衝液に分散させたも
のを、８ｍＬガラス管に２５０μＬ注入し、次いで、抗ヒトＣＲＰ山羊血清（ＤＡＫＯ社
製、タンパク質濃度１８ｍｇ／ｍＬ；以下、抗体溶液という）１７０μＬを添加し、３７
℃で１時間攪拌し、担体粒子に抗ヒトＣＲＰ山羊抗体を吸着させた後、ＢＳＡ（牛血清ア
ルブミン）を１％含むグリシン緩衝液（ｐＨ８．５）２０８０μＬを加え、３７℃にて６
０分攪拌してブロッキング処理を行った。次にブロッキング処理品を、８ｍＬ遠心管に分
取し、１８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離処理した後、上清を廃棄し、ＢＳＡ含有グリ
シン緩衝液（ｐＨ８．５）に再分散させて、余剰抗体を除去するための洗浄処理を２回繰
り返し行なった後、ＢＳＡ含有グリシン緩衝液（ｐＨ８．５）を２．５ｍＬ添加し、超音
波処理した後、更にＢＳＡ含有グリシン緩衝液（ｐＨ８．５）を追加し、最終液量を５ｍ
Ｌにし、測定試薬とした。

試料２、３、４及び比較試料１、２、４の担体粒子を用いた測定試薬は、担体粒子の表面
積当たりの抗体感作量が試料１と同じになるようＢＳＡ含有グリシン緩衝液（ｐＨ８．５
）を調整したこと、並びに、試料２及び比較試料２の担体粒子に対する遠心処理条件を１
８０００ｒｐｍで２５分間とし、試料３及び比較試料４の担体粒子に対する遠心処理条件
を１８０００ｒｐｍで１５分間としたこと以外は、試料１の担体粒子を用いた場合と同様
にして調製した。なお、比較試料３では、重合中にクリーム状になり正常なラテックスが
得られなかった。

＜試験例１＞試薬性能（感度）評価
上記の方法にて調製した各測定試薬を用いて以下の測定条件にて、ＣＲＰ濃度０．０８〜
１３０ｍｇ／ｄＬの検体測定時の吸光度変化量を測定した。
測定機種：日立７１５０形自動分析装置
検体：３μＬ
希釈液：２７０μＬ（１％ＢＳＡ含有グリシン緩衝液（ｐＨ８．５））
測定試薬：９０μＬ
測定波長：８００ｎｍ
測光ポイント：２ポイント３０−５０ｐ
測定結果を、図１及び２に示した。

＜試験例２＞ブレンド評価
各試料及び比較試料の担体粒子を１：１０又は１０：１で混合した試薬を用い、各試料及
び比較試料の担体粒子（単品）と同様にして、ＣＲＰ濃度０．５〜１３０ｍｇ／ｄＬの検
体測定時の吸光度変化量を測定した。
測定結果を、図３及び４に示した。

本発明は、上述の構成よりなるので、低濃度領域から高濃度領域にいたる幅広い濃度範囲
において、特に高濃度領域において、高い測定感度及び高い測定精度で抗原抗体反応を測
定することが可能であるとともに、長期安定性にも優れる測定試薬用担体粒子及び測定試
薬を提供することができる。

試験例１における測定結果を示すグラフである。 試験例１における測定結果を示すグラフである。 試験例２における測定結果を示すグラフである。 試験例２における測定結果を示すグラフである。

Claims (7)

1. フェニル基を有する重合性単量体及びフェニル基とスルホン酸リチウム塩とを有する重合
   性単量体を共重合して得られる、担体粒子（Ａ）及び担体粒子（Ｂ）からなる測定試薬用
   担体粒子であって、
   前記担体粒子（Ａ）と前記担体粒子（Ｂ）とは、互いに異なる平均粒径を有し、
   前記担体粒子（Ａ）のサイクリックボルタンメトリ測定による粒子表面のスルホン酸リチ
   ウム荷電量は−１０〜−２５μＡであり、前記担体粒子（Ｂ）のサイクリックボルタンメ
   トリ測定による粒子表面のスルホン酸リチウム荷電量は−３０〜−４０μＡである
   ことを特徴とする測定試薬用担体粒子。
2. 担体粒子（Ａ）及び担体粒子（Ｂ）の平均粒径は、０．０１〜１．５μｍである
   ことを特徴とする請求項１記載の測定試薬用担体粒子。
3. 担体粒子（Ａ）及び担体粒子（Ｂ）の混合比は、固形分換算の重量比で、担体粒子（Ａ）
   ／担体粒子（Ｂ）＝１／１０〜１０／１であることを特徴とする請求項１又は２記載の測
   定試薬用担体粒子。
4. フェニル基を有する重合性単量体は、スチレンであることを特徴とする請求項１、２又は
   ３記載の測定試薬用担体粒子。
5. フェニル基とスルホン酸リチウム塩とを有する重合性単量体は、スチレンスルホン酸リチ
   ウム塩であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の測定試薬用担体粒子。
6. 担体粒子（Ａ）及び担体粒子（Ｂ）は、フェニル基を有する重合性単量体、及び、フェニ
   ル基とスルホン酸リチウム塩とを有する重合性単量体を、乳化剤の不存在下で共重合して
   得られることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の測定試薬用担体粒子。
7. 請求項１、２、３、４、５又は６記載の測定試薬用担体粒子に、被測定物質と特異的に結
   合する物質を担持させてなることを特徴とする測定試薬。

Images