FR2538907A1 - Reactif immunologique constitue par des antigenes ou des anticorps en forme de cellules des particules ou des molecules ancres sur des surfaces solides continues par des unions ioniques ou covalents - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR LA FIXATION DES ANTIGENES OU DES ANTICORPS SUR DES SURFACES OU DES PARTICULES, ET LEUR STABILISATION PAR INCLUSION DANS DES GELS PROTECTEURS. LES REACTIFS MIS EN OEUVRE SONT DES AGENTS DE RETICULATION POUR LA FIXATION DE PRODUITS BIOLOGIQUES SUR DES PARTICULES, SURFACES ET DES POLYALCOOLS ETOU DES PROTEINES POUR LEUR STABILISATION. LE PROCEDE DECRIT CONCERNE PARTICULIEREMENT LES IMMUNOADSORBANTS POUR DES REACTIONS D'IMMUNOFLORESCENCE ETOU AGGLUTINATION SUR POLYCUVETTES SEROLOGIQUES.
Description
La stabilisation de réactifs immunologiques, en solution ou en suspension, a été un sujet objet d'importantes consequenctes dans le perfectionnement des méthodes diagnostiques.
En effet, des qualités diverses des preparations diagnostiques dépendent d'une stabilité apropriée: Celle-ci exerce une influence sur de différents aspects, qui vont depuis la reproduc tibilité de résultats jusqu'à l'économie dans la production sur échelle.
Beaucoup de processus immunologiques extrêmement efficaces dans le laboratoire expérimental n"ont pas été suceptibles d'e- tre appliqués aux pratiques de routine en raison de sa basse stabilité.
D'ailleurs, des produits qui ne sont stables que lorsqu'ils sont soumis a de baisses températures, voient leur difusion limai tée lorsqu'il est peu abondant le réseau de froid qui assurerait une distribution efficiente.
L'un des processus les plus employés pour la stabilisation de réactifs biologiques a été la lyophilisation.
Cependant, ce processus a des limitations dans son application, soit pour des raisons de coût ou d'efficience. Ceci est surtout lie à des produits qui restent instables meme avec de baisses teneurs d'humidité résiduelle.
Par conséquent, l'obtention de réactifs immunologiques stabilisés au moyen de processus differents à celui de la lyophilisation a constitué un désir important pour bien de laborateurs producteurs
Depuis plusieurs annees2 a mon laboratoire on a été en train de travailler sur la stabilité d'un type particulier de réactifs immunologiques, qui sont ceux où les antigènes ou les anticorps font partie d'une particule insoluble. La particule peut être le même réactif ou ne constituer qu un support de l'antigène ou de 1' anticorps pour les maintenir en suspension.
Depuis plusieurs annees2 a mon laboratoire on a été en train de travailler sur la stabilité d'un type particulier de réactifs immunologiques, qui sont ceux où les antigènes ou les anticorps font partie d'une particule insoluble. La particule peut être le même réactif ou ne constituer qu un support de l'antigène ou de 1' anticorps pour les maintenir en suspension.
L'antigène ou l'anticorps meme peuvent avoir une stabilité na turelle, ou bien celle-ci peut leur être conférée d'une maniere artificielle. Nous l'avons déjà obtenu pour des antigènes très divers au moyen d'un processus dénommé "reticulation", qui consiste simplement dans un phénomène de polymérisation des proteines qui les transforme en des substances non suceptibles d'être dégradées et d'ailleurs tres stables.
Outre ce que l'on vient d'étre dit, il est inlresant à remarquer que la stabilisation de l'antigène ou de l'anticorps en lui-même n'est pas équivalenteà la stabilite du corpuscule dont elle fait parti; nous faisons allusion à des réactifs avec des.
particules en suspension. Ce genre de produit a une tendence é- vidente à s' ajouter ou s' agglutiner lui-meme, une fois écoulé un certain temps après sa préparation et notamment lorsque les particules restent sans la couverture du délayant où elles devraient etre suspendues.
Par exemple, des particules déposées dans un flacon renverse ou inversé, restent facilement a découvert, ce qui arrive souvent lors de leur transport et qui provoque 'gautoagglutination" irréver sible des particules, rendant inutile le réactif.
Ce phénomdne ne semble pas dépendre exclussivement de la teneur d'humidité, puisqu'il se produit également dans des ampoules fermées hermétiquement.
Un avance importante dans la solution du probleme - bien que de succès partiel - a été constitue par le remplissage total du récipient servant à contenir, en y laissant n'importe quelle chambre d'air. Ce processus empêche, en principe, que, quelle que soit la position du récipient, le sédiment de particules reste a découvert. Malgré cela, il se présente un autre genre de difficultés pratiques, aussi bien dans la production que dans l'emploi de cette variante, qui la rendent antiéconomique et peu acceptable.
Au cours des deux dernières annees nous avons procédé a l'étude de différentes alternatives qui, en faisant superflue la lyophilisa tion, ont permis de garder les particules immoviles ou suspendues de maniera permanente dans un systeme stabilise. Dans cet ordre d1 idées, il a pu être établi que ce but était atteint au moyen de la conformation de mélanges pareuses ou démi-pateuses hydrosolubles caractérisées par la dispersion de particules en glycérol etlou en polyalcools, ou glycérol plus de proteines.
En effet, en mélangeant du glycérol - liquide dense, de même que les polyalcools dissous dans de l'eau aux concentrations de 10% ou encore plus élevées - avec des particules d'origine animal, mi néral ou synthétiques dans une proportion dans laquelle le glycérol represente 60% environ de la mélange et les particules, 40% qui reste, on obtient une pate au sein de laquelle les particules sont immobiles.
Cette pâte se dissout instantanement au contact avec 11 eau.
A son tour, la pâte sus-mentionnée peut contenir de
rentes proportions d'eau, mais celle-ci ne peut dépasser 20%
la mélange, car dans ce cas-la, il serait impossible
rentes proportions d'eau, mais celle-ci ne peut dépasser 20%
la mélange, car dans ce cas-la, il serait impossible
<tb> d'atteindre
<tb> le but de garder les particules suspendues de maniere permanenie.
<tb> le but de garder les particules suspendues de maniere permanenie.
D'autre part, grâce à l'emploi de polyalcools, il est o-tcn des résultats similaires, mais dans ce cas-là, la proportion à'eau dans le système peut arriver jusqu'a 30%.
Une troisieme possibilité pour obtenir la pâte consiste la dispersion du réactif dans une mélange de glycérol dans à peu prés 60% et ce qui reste, de proteines (par exemple, albumine), la proportion d'eau ne pouvant pas depasser 10%.
Une fois la mélange pâteuse ou démi-p teuse obtenue, ces particules qui en elles mêmes sont réactives ou bien ces autres qui constituent un support de substances réactives restent immobiles ou suspendues jusqu'à ce que la mélange soit dissoute avec de l'eau, conformément au volume et a la concentration optimales pour son emploi dans la pratique de la réaction.
De cette maître, il est absolument évité les dangers de 1' autoagglutination, étant en plus obtenu un effet stabilisateur é- tant donnée que le glycérol et les polyalcools - qui agissent en tant qu'agents fixateurs doux sans attaquer les structures des substances fixes - ont aussi un effet stabilisateur propre,
Fondamentalement, alors, l'invention que l'on est en train de decrire consiste à un réactif immunologique stabilise pour des essais d'agglutination, floculation ou précipitation, caractérisés par la dispersion des particules portant des antigènes ou des anticorps dans des solutions concentrées de glycérol et/ou polyalcools, ou bien de glycérol et de proteines.
Fondamentalement, alors, l'invention que l'on est en train de decrire consiste à un réactif immunologique stabilise pour des essais d'agglutination, floculation ou précipitation, caractérisés par la dispersion des particules portant des antigènes ou des anticorps dans des solutions concentrées de glycérol et/ou polyalcools, ou bien de glycérol et de proteines.
La dispersion de particules dans des solutions concentrées de glycérol et/ou polyalcools, ou de glycérol et proteines, ne permettrait l'utilisation directe de ceux-la dans les essais d'agglutination, précipitation ou floculation, etant donne que les alcools que nous venons de mentionner, concentrés9 gênent ou empêchent les reactions antigene-anticorps. Par conséquent, les particules doivent se trouver disperses dans cette solution, aussi dans une concentration élevez, a' un tel point que l'ensemble puisse être entie- rement ou de manière fractionnee, dissous dans la mesure nécessaire pour rendre possible son emploi.
Un exemple de ce qui vient d'être exprimé ci-dessus est conssitué par la stabilisation du réactif pour hemagglutination revers passive pour diagnostique cMiépatite B, produit
sophistiquée et d'une instabilité extrême, que ls
fabricants a niveau mondial qui le produisent, le
sophistiquée et d'une instabilité extrême, que ls
fabricants a niveau mondial qui le produisent, le
<tb> présentent <SEP> tou
jours pour sa commercialisation comme un réactif lyophilise et
même sous ces conditions avec une vie utile limitée.
jours pour sa commercialisation comme un réactif lyophilise et
même sous ces conditions avec une vie utile limitée.
Pendant le développement de cette invention, nous avons eu
l'occasion de comparer des réactifs stabilisés pour lyophilisa
tion avec d'autres qui sont stabilises par dispersion d'hématies
en glycérol (hématies dans une concentration de 30% et glycérol
dans une concentration de 65% avec un résidu d'eau de 5%). Les
deux réactifs ont été soumis å des températures de + 4"C et +
370C pendant 2 mois, étant obtenus les résultats ci-après::
Serums confirmés avec HR passive HR passive en glycérol dis "radioimmunoessai" lyophilises soute 20 fois avant l'usage
40 C 37"C 40C 370C
150+ 147 128 147 145
110- 113 132 113 115
Comme il peut etre remarqué grace aux résultats du tableau,
la stabilité est plus grande dans le matériel dispersé en glycé
rol. En plus, le processus de production est sensiblement plus
simple et économique.
l'occasion de comparer des réactifs stabilisés pour lyophilisa
tion avec d'autres qui sont stabilises par dispersion d'hématies
en glycérol (hématies dans une concentration de 30% et glycérol
dans une concentration de 65% avec un résidu d'eau de 5%). Les
deux réactifs ont été soumis å des températures de + 4"C et +
370C pendant 2 mois, étant obtenus les résultats ci-après::
Serums confirmés avec HR passive HR passive en glycérol dis "radioimmunoessai" lyophilises soute 20 fois avant l'usage
40 C 37"C 40C 370C
150+ 147 128 147 145
110- 113 132 113 115
Comme il peut etre remarqué grace aux résultats du tableau,
la stabilité est plus grande dans le matériel dispersé en glycé
rol. En plus, le processus de production est sensiblement plus
simple et économique.
Un autre exemple est constitué par le cas du réactif pour es
sai d'agglutination rapide pour diagnostique de la maladie de Cha
gas; réactif facilement autoagglutinable lorsque les particules
restent sans couverture de délayant.
sai d'agglutination rapide pour diagnostique de la maladie de Cha
gas; réactif facilement autoagglutinable lorsque les particules
restent sans couverture de délayant.
Dans cet essai il a été employé 170 ampoules avec antigène
suspendu dans une solution saline phosphatée pH 7,2 tel que l'on
fait classiquement, en employant comme bactéricide formol å 0,5%.
suspendu dans une solution saline phosphatée pH 7,2 tel que l'on
fait classiquement, en employant comme bactéricide formol å 0,5%.
Une quant-ité égale d'ampoules contenait des particules d'an
tigene disperses en glycérol (30% des premières et 70% du deuxième)
Toutes les ampoules ont été versées sur une surface et elles
ont été laissées pour son stationnement dans une première position
pendant 10 jours.
tigene disperses en glycérol (30% des premières et 70% du deuxième)
Toutes les ampoules ont été versées sur une surface et elles
ont été laissées pour son stationnement dans une première position
pendant 10 jours.
Une fois ce délai écoulé et sans qu'elles ne soient agitées,
la position des ampoules a été inversée et celles-ci sont restees
ainsi pendant encore dix jours au bout desquels chacune des ampou
les a été analysée pour versifier des effets d'autoagglutination
I1 a pu etre établi qu'entre les particules disperses en gly
cérol, aucune n'a manifesté des phénomènes d'agrégation; en redan
che, dans les ampoules prénarées en employant la methode classique, 138 ampoules sur le total de 170, ont présenté des phEnomEnes d' autoagglutination de différent dégré d'intensité.Il faut faire remarquer que les ampoules contenant des particules disperser ont ete delayées 10 fois avant son emploi.
la position des ampoules a été inversée et celles-ci sont restees
ainsi pendant encore dix jours au bout desquels chacune des ampou
les a été analysée pour versifier des effets d'autoagglutination
I1 a pu etre établi qu'entre les particules disperses en gly
cérol, aucune n'a manifesté des phénomènes d'agrégation; en redan
che, dans les ampoules prénarées en employant la methode classique, 138 ampoules sur le total de 170, ont présenté des phEnomEnes d' autoagglutination de différent dégré d'intensité.Il faut faire remarquer que les ampoules contenant des particules disperser ont ete delayées 10 fois avant son emploi.
Un troisième exemple qui montre un autre avantageZde l'ln- vention est constituee par la configuration d'une alternative révolutionnaire de fractionnement et de présentation des réactifs, seulement réalisable au moyen de ce système de stabilisation.Dans ce cas il a été employé un antigène d'hémagglutination de toxoplasmose disperse en glycérol, avec 15% d'eau. La mélange a été fractionnée par unité de détermination, le volume nécessaire étant déposé dans les orifices d'une polycuvette en plastique au fond en
Immediatement après, la mélangea été soumise à déssechement étant ainsi obtenu t chaque orifice une ptte immobile deja fractionnée, ce qui permet un transport facile et assure la possibilité de garder les mélanges stables pour une seule détermination.
Immediatement après, la mélangea été soumise à déssechement étant ainsi obtenu t chaque orifice une ptte immobile deja fractionnée, ce qui permet un transport facile et assure la possibilité de garder les mélanges stables pour une seule détermination.
Avant d'effectuer l'essai diagnostique9 les mélanges contenues dans les orifices à être employes sont hydratées individuellement avec l'agrégat du volume du liquide original.
Ce système d'emballage et présentation de réactifs immunologiques est d'une énorme importance, aussi bien du point de vue de la practicite que du point de vue économique. En effet, n'im- porte quel autre systeme de stabilisation de réactions individuelles par lyophilisation est sensiblement plus onéreux et impraticable dans la propre polycuvette de reaction.
De mime, il est impossible de garder stable dans une polycuvette, antigene de particules contenues dans les suspensions classiques, même si l'on essaie de sceller chaque orifice avec des feuilles d'aluminium ou des plastiques suceptibles d'être adhérés thermiquement ou avec des colles de diverses natures.
Claims (5)
1) Un réactif immunologique caractérisé pour astre constitué par des antigènes ou des anticorps particules ou fixes å des particules, soit d'origine animal, minéral ou synthétique, dis persés en glycérol et/ou polyalcool ou glycérol et proteines, 1' ensemble formant une mélange hidrosoluble d'une consistence pateu se ou demi-pateuse ou les particules restent immobiles ou suspendues au sein de la masse qui en résulte.
2) Un réactif immunologique d'apres ce qui a été indiquée à 1., dans lequel le glycérol constitue 50% ou plus de la mélange et les particules l'autre 50%, étant considéré comme résidu solide, ou le porcentuel correspondant pour compléter - ajouté au glycérol ou a' ne plus de 20% d'eau - le total de 100%.
3) Un réaetif immunologique d'apres ce qui a ete révendiqué à 1., où un polyalcool constitue 50%, étant considéré comme résidu solide, ou le porcentuel correspondant pour compléter - ajouté au polyalcool ou a ne plus de 30% d'eau - le total de 100%.
4) Un réactif immunologique d'après ce qui a été révendiqué å 1., où le glycérol constitue 50Z ou plus de la mélange et la consistence pâteuse obtenue par l'addition d'une proteine (comme albumine ou d'autres) qu'en résidu solide constitue 50% qui reste, ou bien la proportion qui - ajoutée au réactif lui-meme et au glycérol - permet de compléter le total de 100%.
5) Un reactif immunologique d'apres ce qui a été revendique a' tou tes les révendications préeedentessprésenté pour son utilisation dans des emballages pour de multiples déterminations ou en frac- tions qui - déposées e immobilisées au fond des receptacles de reaction de polycuvettes sérologiques pouvant etre écartées - rend possible leur emploi pour un seul essai par fois.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AR22708582 | 1982-09-15 |
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---|---|
FR2538907A1 true FR2538907A1 (fr) | 1984-07-06 |
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FR8314687A Withdrawn FR2538907A1 (fr) | 1982-09-15 | 1983-09-15 | Reactif immunologique constitue par des antigenes ou des anticorps en forme de cellules des particules ou des molecules ancres sur des surfaces solides continues par des unions ioniques ou covalents |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR2538907A1 (fr) |
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GB2175906A (en) * | 1984-01-05 | 1986-12-10 | Manlab Pty Ltd | Assay methods and reagents |
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EP0301333A2 (fr) * | 1987-07-29 | 1989-02-01 | Abbott Laboratories | Essai immunologique à base de liposomes pour des tests diagnostiques |
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JPS58123459A (ja) * | 1982-01-19 | 1983-07-22 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 安定化された固相試薬及びその製造方法 |
-
1983
- 1983-09-15 FR FR8314687A patent/FR2538907A1/fr not_active Withdrawn
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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ST | Notification of lapse |