FR2534031A1 - Supports pour dosage immunochimique et reactifs de dosage utilisant ces supports - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN SUPPORT POUR DOSAGE IMMUNOLOGIQUE, DONT LA SURFACE EST RECOUVERTE AVEC UNE RESINE SYNTHETIQUE, ET UN REACTIF POUR DOSAGE IMMUNOLOGIQUE UTILISANT CE SUPPORT. LE SUPPORT DU REACTIF PEUT ETRE EN VERRE RECOUVERT AVEC UNE RESINE SYNTHETIQUE. LE SUPPORT SELON L'INVENTION NE MONTRE PAS D'ADSORPTION NON SPECIFIQUE, DE SORTE QUE LE REACTIF CONSERVE UNE FIABILITE DE MESURE SUFFISANTE APRES UN STOCKAGE DE PLUS D'UN AN.

Description

L'invention-concerne des supports pour dosage immuno-

chimique, dont la surface est recouverte avec une résine syn-

thétique, et des réactifs pour des dosages immunochimiques uti-

lisant ces supports.

Ces dernières années, on a utilisé divers réactifs pour les dosages immunochimiques, comme moyen pour déterminer les concentrations de substances physiologiquement actives,

telles que des hormones peptidiques, des stéro 5 des, des protéi-

nes, etc ainsi que les concentrations de médicaments adminis-

très in vivo, contenus en très faibles quantités dans des échan-

tillons physiologiques tels que le sérum, l'urine, Ec Parmi ces réactifs, ceux basés sur un dosage par immunoenzymologie,

un dosage radioimmunologique, un dosage fluoroimmunologique,etc.

sont souvent utilisés en raison de leur sensibilité de mesure

élevée et de leur excellente efficacité quantitative.

Ces réactifs comprennent généralement (a) un anticorps insolubilisé ou un antigène insolubilisé obtenu en fixant un anticorps ou un antigène correspondant à la substance à doser sur un support et (b) un anticorps marqué ou un antigène marqué obtenu en marquant un anticorps ou un antigène avec un marqueur tel qu'une enzyme, etc La-mesure utilisant un tel réactif est effectuée comme suit On fait réagir une substance à doser et un anticorps marqué ou un antigène marqué avec un anticorps

insolubilisé ou un antigène insolubilisé, et on sépare le mar-

queur fixé sur le -support (phase solide) et le marqueur non

fixé, mais présent dans la phase liquide Puis, on mesure l'ac-

tivité du marqueur soit dans la phase solide, soit dans la pha-

se liquides grâce à quoi on détermine la quantité ou la concen-

tration de la substance à doser -Le support ne doit donc pas adsorber de manière non-spécifique, un antigène, un anticorps, ou d'autres constituants qui ne participent pas à la réaction immunologique. D'autre part, on a essayé d'utiliser des récipients comme supports pour les réactifs, tels que par exemple des tubes à essai, etc En d'autres termes, en fixant un antigène ou un anticorps sur la surface interne de la paroi d'un récipient

tel qu'un tube à essai, etc, et en plaçant un antigène mar-

que ou un anticorps marqué dans ce récipient, on a espéré

obtenir un réactif approprié et stable au stockage, qui per-

met une mesure instantanée et est ainsi utilisé de façon com- mode.

Cependant, la stabilité au stockage d'un tel réac-

tif ne s'est pas montrée satisfaisante jusqu'à présent et pose le problème qu'après plusieurs mois de stockage l'exactitude et la sensibilité de la mesure diminuent La Demanderesse a

cherché d'une manière large à expliquer la cause de ce pro-

blème et a trouvé que le changement dans la qualité du réac-

tif après un stockage est attribuable au fait que les tubes à essai en matière plastique utilisés comme supports avaient

une perméabilité aux gaz légère, mais déterminante.

Bien que le verre soit un matériau de support n'ayant

aucune perméabilité aux gaz, comme le verre adsorbe des subs-

tances de manière non-spécifique, l'utilisation du verre com-

me support ne convient pas La Demanderesse a donc poursuivi ses recherches afin de résoudre ce problème et a découvert

qu'en enduisant la surface de verre avec une résine synthéti-

que, il était possible d'éviter l'adsorption non spécifique.

L'emploi de verre recouvert d'une résine synthétique comme support pour un réactif pour un dosage immunochimique n'a pas

encore été proposé jusqu'à présent.

L'invention a pour objet de fournir des supports pour

dosage immunochimique, qui empêchent une adsorption non-spé-

cifique.

L'invention a encore pour objet de fournir des sup-

ports pour dosage immunochimique, en recouvrant une surface

de verre avec une résine synthétique.

L'invention a enfin pour objet de fournir des réac-

tifs pour des dosages immunologiques, qui comprennent (a) un anticorps insolubilisé ou un antigène insolubilisé, obtenu en fixant l'anticorps ou l'antigène sur un support de verre dont la surface est recouverte avec une résine synthétique, et

(b) un anticorps marqué ou un antigène marqué.

la Fig 1 des dessins annexés est un graphique montrant les courbes étalon de l'exemple 7, et la Fig 2 est un graphique montrant les courbes

étalon de l'exemple 8.

Le revêtement d'un support de verre peut être effec-

tué comme suit: Un matériau conçu pour un support tel que

des perles de verre, un tube à essai en verre, etc est mouil-

lé avec une solution ou une suspension de résine synthétique pour faire adhérer la résine sur la surface du support Si nécessaire, l'excès de résine est enlevé et le matériau de support mouillé est ensuite traité à la chaleur La résine qui

n'a pas été déposée sur le matériau de support après le trai-

tement thermique, est éliminée par lavage Sur le support ainsi traité, on fixe alors un anticorps ou un antigène pour

obtenir un anticorps insolubilisé ou'un antigène insolubilisé.

Diverses résines synthétiques peuvent être utilisées comme agent de revêtement Les résines synthétiques peuvent

être classées en résines thermoplastiques et en résines ther-

modurcissables, selon leur structure chimique et leurs pro-

priétés de mise en oeuvre Les premières résines sont des po-

lymères linéaires et se ramollissent et se liquéfient à la

chaleur et se solidifient au refroidissement, ce-cycle pou-

vant être répété Les dernières résines sont telles que leurs produits de condensation dans les premiers stades ont une

structure linéaire, et sont de grandes molécules; lorsqu'el-

les sont chauffées, elles se ramollissent et se liquéfient

d'abord, mais elles subissent ensuite une réaction de réti-

culation entre les molécules en formant des matériaux insolu-

bles et infusibles de structure tridimensionnelle L'un ou l'autre de ces types de résines synthétiques peut être utilisé

dans l'invention.

Comme résine thermoplastique, on peut utiliser les résines de chlorure de vinyle, les résines, de polystyrène, les

résines polypropylène.

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les résines acryliques, les résines fluorées, etc; comme résinesthermodurcissabls, on peut utiliser les résines de silicone, les résines phénoliques, les résines époxy, etc. Parmi celles-ci, on préfère en particulier les résines de * 5 silicone, les résines de polystyrène, les résines acryliques

et les résines fluorées.

e Comme résines de silicone, on peut mentionner les

huiles de silicone ayant une structure linéaire, les caout-

choucs de silicone ayant une structure partiellement réticulée, les résines de silicone totalement réticulées et durcies au moment de la mise en oeuvre, etc Parmi celles-ci, on préfère

en particulier les huiles de silicone.

Comme résines de polystyrène, on peut citer-les rési-

nes de styrène d'emploi général obtenues par homopolymérisa-

tion en masse du styrène, les résines de styrène résistant à la chaleur obtenues en préparant un polymère linéaire de degré

de polymérisation plus élevé que les résines de styrène d'em-

ploi général ou par copolymérisation avec un monomère qui con-

fère la résistance à la chaleur, ou par polymérisation de l' l-

méthylstyrène, les résines de styrène résistant au choc obte-

nues par polymérisation greffée du styrène et du butadiène, etc Parmi celles-ci, on préfère en particulier les résines

de styrène d'emploi général.

Comme résines acryliques, on peut citer les polymères d'acrylates et les polymères de méthacrylates, les polymères

d'acrylates étant particulièrement préférés.

Comme résines fluorées, on peut citer le polytétra-

fluoroéthylène et le polychlorotrifluoroéthylène, le polyté-

trafluoroéthylène étant particulièrement préféré.

Ces résines synthétiques peuvent être utilisées en solution dans un solvant organique tel que l'hexane, l'acétone, le chlorure de méthyle, le chloroforme, le dichloroéthane, le trichloréthvlène, etc à une concentration de 1 à 30 % en

poids, sous forme d'une poudre, d'une pâte ou d'une suspension.

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Lorsqu'il y a dissolution dans un solvant organique, le re-

vêtement est effectué en mettant la surface du support en contact avec la solution et en soumettant ensuite la surface à un traitement thermique Ou bien, on peut pulvériser une solution de résine synthétique sur la surface du support, puis effectuer le traitement thermique Le revêtement peut également être réalisé en utilisant une résine synthétique fondue, à une température supérieure à son point de fusion, au lieu d'une solution dans un solvant organique De plus, il est également possible de mettre la résine synthétique sous forme d'une pâte pour recouvrir la surface du support, puis de la chauffer pour former le revêtement Par exemple,

lorsqu'on doit appliquer une résine de silicone sur un maté-

riau de support, on dissout la résine dans un solvant à une concentration de 1 à 30 %, de préférence de 5 à 10 %, on met la surface du support en contact avec cette solution, puis on élimine l'excès de solution et on effectue un traitement thermique vers 180 OC pendant 1 heure Après refroidissement, la résine qui n'a pas été appliquée est éliminée par lavage

avec du trichloréthylène Après le séchage, on obtient un sup-

port revêtu.

La forme du support peut être variable et, par exem-

ple, diverses formes telles que des perles, des tubes à es-

sai, des perles en forme de tambour, des plaques de titrage,

des ampoules, des seringues, etc sont possibles.

Pour fixer l'anticorps ou l'antigène sur le support recouvert d'une résine synthétique, on peut appliquer des modes opératoires semblables à ceux décrits dans "Clinica Chimica Acta", 48, 15 ( 1973) "Journal of Immunology", 116, 1554 ( 1976) et "Science" 158, 1570 ( 1967) Par exemple, on dissout un anticorps anti-_ -fétoprotéine à une concentration

de 1 mg/ml dans un tampon de glycine de p H 8,2 et on met cet-

te solution d'anticorps en contact avec des perles de verre

ou un tube à essai en verre recouvert avec une résine de si-

licone, puis on fait réagir à 37 O C pendant 3 heures On lave

avec une solution saline physiologique et on ajoute une so-

lution de tampon de phosphate de p H 7,0, contenant 1 % de sérum de lapin normal, on laisse au repos à 4 C pendant une

nuit pour obtenir le support sur lequel est fixé un anti-

corps.

Comme marqueur à utiliser dans un dosage immunochi-

mique, on peut utiliser des enzymes (par exemple la peroxy-

dase, la P-galactosidase, la phosphatase alcaline, la glu-

cose oxydase, etc), des isotopes radioactifs (par exemple 125 I, 3 H, etc) , des substances fluorescentes (par exemple

l'isothiocyanate de fluorescéine, l'isothiocyanate de tétra-

méthylrhodamine, etc), etc Lorsqu'on doit considérer la sensibilité, l'exactitude, la simplicité, etc, l'utilisation d'une enzyme s'avère plus avantageuse Le procédé de marquage

de l'anticorps ou de l'antigène avec ces marqueurs est géné-

ralement connu, et le marquage avec des enzymes peut être ef-

fectué, par exemple, selon le procédé de Nakane, Kawaoi et al'

"J Histochem Cytochem "t 22, 1084 ( 1974).

L'utilisation du réactif de dosage obtenu ci-dessus,

composé de l'anticorps insolubilisé ou de l'antigène insolu-

bilisé et de l'anticorps marqué ou de l'antigène marqué, per-

met de doser diverses substances physiologiquement actives.

Par exemple, dans un tube à essai sur lequel est fixé un an-

ticorps, on introduit une solution à analyser après l'avoir

diluée à une concentration appropriée, et on effectue la ré-

action antigène-anticorps Lorsque la réaction est terminée, on lave le tube à essai et on ajoute l'anticorps marqué dans le tube à essai Après quoi, on lave le tube à essai, et on

détermine par un moyen approprié la quantité d'anticorps mar-

qué fixé sur le tube à essai La quantité de substances à dé-

terminer est calculée par comparaison de la valeur mesurée

avec une courbe étalon obtenue en travaillant de la même ma-

nière sur l'étalon de concentration connue.

En effectuant la mesure, étant donné que des condi-

tions telles que la quantité d'échantillon, la concentration et la quantité de l'anticorps marqué utilisé, la température et la durée de la réaction, etc peuvent varier en fonction

du type de substance à analyser, du titre en anticorps utili-

sé, du type de marqueur, etc des conditions optimales sont établies de façon expérimentale dans chaque système de mesure.

Les réactifs pour dosage immunochimique selon l'in-

vention comprennent, tel que décrit ci-dessus, a) un anticorps insolubilisé ou un antigène insolubilisé et b) un anticorps marqué ou un antigène marqué, et si nécessaire le réactif peut encore contenir, pour la commodité de la mesure, un tampon, une solution témoin et, lorsqu'on utilise une enzyme comme marqueur, un substrat d'enzyme, une solution pour dissoudre le substrat d'enzyme, un agent bloquant la réaction, etc.

La solution tampon est utilisée pour diluer ltéchan-

tillon à une concentration appropriée et également pour main-

tenir le site de la réaction antigène-anticorps à un p H et à une force ionique appropriée Comme solution tampon de ce

type, on peut utiliser des solutions tampon classiques et com-

munément utilisées dans le domaine immunochimique, par exemple une solution saline tamponnée avec de la glycine, une solution

saline tamponnée avec un phosphate, une solution saline tam-

ponnée avec un borate, etc De plus, pour augmenter la repro-

ductibilité de la réaction, la solution peut contenir une quantité appropriée de protéine, par exemple de 0,01 à 5 %,

de préférence de 0,5 à 2 %, d'albumine de sérum bovin (appe-

lée ci-après BSA).

L'anticorps marqué ou l'antigène marqué est celui

obtenu en marquant un anticorps ou un antigène-avec une enzy-

me, un isotope radioactif ou une substance fluorescente La mesure de la substance marquée qui se fixe ou ne se fixe pas sur la substance à doser qui a été fixée à la phase solide

par la réaction antigène-anticorps, permet de doser la subs-

tance physiologiquement active dans la solution à examiner.

Certains ou la totalité des constituants du réactif

de dosage selon l'invention peuvent être sous une forme lyo-

philisée et, si tel est le cas, un solvant approprié pour dissoudre les constituants lyophilisés peut être associé au réactif En outre, le réactif selon l'invention peut tre

fourni sous forme d'une trousse de dosage en livrant égale-

ment des accessoires tels que des tubes à essai, des pipet-

tes, etc afin d'en faciliter l'emploi.

Comme exemples de substance à doser avec les réactifs

de dosage selon l'invention, on citera les hormones protéini-

ques telles que la gonadotropine chorionique humaine, l'insu-

line, l'hormone de croissance humaine, etc; des substances protéiques telles que l' L-fétoprotéine (appelée ci-après AFP), le virus de type B de l'hépatite (H Bs), l'immunoglobuline, un

complexe antigène-anticorps, la celluloplasmine, la transfer-

rine, etc et des haptènes tels que la thyroxine, l'oestradiol, la progestérone, la testostérone, la phnnylto Ine, le phénobarbital, etc. Les réactifs de dosage selon l'invention ne sont pas

adsorbés de façon non-spécifique par les supports, et ils per-

mettent donc non seulement une grande exactitude de la mesure, mais ils ont également une excellente stabilité qui permet un

stockage stable pendant un an ou plus.

L'invention est maintenant décrite en détail à l'aide de l'exemple expérimental et des exemples de préparation et de

dosage suivants.

Exemple expérimental 1 Stabilité du réactif de dosage d'AFP

Selon l'exemple 6 décrit ci-après, on prépare un ré-

actif classique de dosage d'AFP à partir d'un tube à essai

en résine de polystyrène comme support et un réactif de dosa-

ge d'AFP selon l'invention utilisant un tube à essai en verre

recouvert d'une résine de silicone et on compare leurs stabi-

lités au stockage On les conserve à 4 C pendant 1 mois, 3

mois et un an Puis on examine la rétention de leurs réacti-

vités en utilisant une solution témoin (sans AFP) et une solu-

tion d'AFP ( 80 ng/ml) On mesure respectivement les absorban-

ces optiques de ces solutions-à l'aide des réactifs décrits dans l'exemple 7 On détermine les différences d'absorbance

optique entre l'essai à blanc et la solution d'AFP et les ré-

sultats quant à la différence d'absorbance par rapport à une

période de stockage de O jour correspondant à 100 S sont rap-

portés dans le Tableau 1.

Tel qu'il ressort du Tableau 1, avec le réactif clas-

sique, la réactivité (différence d'absorbance) est réduite à

% après un an de stockage alors qu'avec le réactif de l'in-

vention, on n'observe pratiquement aucune diminution de la réactivité même après un an de stockage La diminution de la

réactivité, entra ne naturellement une diminution de l'exacti-

tude et de la sensibilité de la mesure.

TABLEAU 1

Période de stockage O 1 mois 3 mois 1 an Réactif classique 100 % 94 % 82 % 60 % Réactif de l'invention 100 % 98 % 98 % 97 %

Exemple 1

Préparation de tubes à essai recouverts de résine de silicone

Dans des tubes à essai en verre ( 10 x 75 mm), on dis-

tribue chaque fois 1 ml d'une solution d'une résine de sili-

cone (Shin-Etsu Chemical Co, Ltd KC 88) diluée à 10 % avec du n-hexane Après avoir laissé ces tubes à essai au repos à

la température ambiante pendant 10 minutes, on élimine la so-

lution de la résine de silicone dans le n-hexane par aspira-

tion Puis, on chauffe les tubes à essai à 180 C pendant une heure et on laisse refroidir On lave ces tubes à essai avec 2 ml de trichloréthylène et on sèche pour obtenir des tubes à

essai recouverts de résine de silicone.

Exemple 2

Préparation de perles de verre recouvertes de résine de silicone On plonge 100 perles de verre (diamètre de 8 mm) dans une solution d'une résine de silicone (Shin-Etsu Chemical Co.

Ltd KC 88) à 10 % dans le n-hexane Après avoir laissé les per-

les au repos pendant 10 minutes à la température ambiante, on place les perles sur une coupelle de verre au moyen dtune paire de pinces brucelles, puis on chauffe à 180 C pendant une heure et on laisse refroidir On lave alors les perles

avec 5 fois 50 ml de trichloréthylène pour obtenir des per-

les de verre recouvertes de résine de silicone.

Exemple 3

Préparation de tubes à essai recouverts de résine de nolys-

tyrène Dans des tubes à essai en verre ( 10 x 75 mm), on distribue chaque fois 1 ml d'une résine de polystyrène (Sanko

Plastic Co Ltd) fondue à 180 C, on élimine rapidement l'ex-

cès par aspiration et on laisse refroidir pour obtenir des

tubes à essai recouverts de polystyrène.

Exemple 4

Préparation de tubes à essai recouverts de r 6 sine acrylique

Dans des tubes à essai en verre ( 10 x 75 mm), on dis-

tribue chaque fois 1 ml d'une résine acrylique (Sanko Plas-

tic Co Ltd) fondue à 200 C, on élimine rapidement l'excès par aspiration et on laisse refroidir pour obtenir des tubes

à essai recouverts de résine acrylique.

Exemple 5

Préparation de tubes à essai recouverts de résine fluorée On pulvérise une suspension d'une résine fluorée

(Asahi Glass Co, Ltd) sur les parois internes de tubes à es-

sai en verre ( 10 x 75 mm), on chauffe à 400 OC et on laisse refroidir pour obtenir des tubes à essai recouverts de résine fluorée.

Exemple 6

Préparation d'un réactif de dosage d'AFP a) Préparation d'un anticorps anti-AFP On dissout de l'AFP, extraite et purifiée à partir d'ascites d'un patient atteint d'un hépatome selon le procédé

de Nishi et al ("Cancer Res " 30, 2707 ( 1970)), dans une so-

lution saline physiologique à une concentration de 2 mg/ml, on mélange 0, 5 ml de cette solution avec 0,5 ml d'un adjuvant complet de Preund On immunise des lapins au moins 5 fois avec ce mélange pour obtenir un sérum anti-AFP On fractionne deux fois ce sérum avec du sulfate de sodium et on recueille

la fraction globuline pour obtenir l'anticorps anti-AFP.

b) Préparation de tubes A essai sur lesquels est fixé l'anti- corps antiAFP Dans les tubes à essai recouverts, préparés dans les exemples 1, 3, 4 et 5 respectivement, on ajoute 0,5 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (appelée ci-après PBS) contenant l'mg de 1 ' anticorps anti-AFP On conduit la réaction

a 37 C pendant 3 heures, après quoi on lave les tubes A es-

sai avec du PBS pour obtenir des tubes a essai sur lesquels

est fixé l'anticorps.

c) Préparation d'un anticorps anti-AFP marqué avec une enzym On prépare un anticorps marqué avec une enzyme selon le procédé de Nakane, Kawaoi et al (TJ Histochem Cytochem " 22, 1084 ( 1974)) On dissout 5 mg de peroxydase de raifort

(appelée ci-après HRPO) dans 1 ml d'une solution de bicarbo-

nate de sodium 0,3 M 'On ajoute 0,1 ml de 2,4-dinitrofluoroben-

zène A 1 % et on agite le mélange A la température ambiante

pendant 1 heure A cette solution, on ajoute 1 ml d'une solu-

tion de periodate de sodium a 0,08 M et on mélange la solu-

tion A la température ambiante pendant 30 minutes, apres quoi on ajoute 1 ml d'une solution d'éthylène glycol-0,16 M et on

continue le mélange A la température ambiante pendant 1 heure.

On dialyse le mélange réactionnel contre un tampon de carbo-

* nate 0,01 M de p H 9,5 pendant une nuit; puis on ajoute 1 ml de l'anticorps anti-AFP préparé en (a) ci-dessus et dissous

dans un tampon de carbonate 0,01 M de p H 9,5 A une concentra-

tion de 5 mg/ml, on fait réagir à la température ambiante pen-

dant 3 heures, puis on ajoute 5 mg de borohydrure de sodium

et on poursuit la réaction A 4 C pendant encore 3 heures.

Lorsque la réaction est terminée, on dialyse le mélange réac-

tionnel contre du PBS pendant une nuit, on fractionne et on

purifie sur du Sephadex G 200 pour obtenir un anticorps anti-

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AFP marqué à la HRPO.

d) Préoaration d'une solution titrée d'AFP On extrait et on purifie 1 'AFP à partir d'ascites d'un patient atteint d'un hépatome selon le procédé de Nishi et al, voir ci-dessus On dissout l'AFP dans du PBS contenant 1 % de BSA et 0,1 % de Tween 20 à des concentrations de 160,

, 40 e 20 et 10 ng/ml, respectivement.

e) Préparation des réactifs de dosage d'AFP

En utilisant les tubes a essai sur lesquels est fi-

xé l'anticorps anti-AFP, et l'anticorps anti-AFP marqué a la HRPO, préparés respectivement en-(b) et en (c) ci-dessus, on

prépare des réactifs de dosage d'AFP avec la combinaison sui-

vante: 1) Tube à essai sur lequel est fixé l'anti-AFP 2) Anticorps antiAFP marqué de la HRPO 3) Solution titrée d'AFP 4) Substrat d'enzyme (ophénylène diamine) )-Solution pour la dissolution du substrat d'enzyme (PBS contenant 6 m M/l de peroxyde d'hydrogène)

6) Agent de blocage de la réaction (acide chlorhydri-

que 1 N)

7) Solution tampon (PBS contenant 1 % de BSA).

Exemple 7

Dosage de 1 'AFP Dans les tubes à essai de l'invention-, recouverts de diverses résines synthétiques et, à titre de comparaison, dans des tubes à essai différents de ceux de l'invention qui n'ont pas été recouverts de résine synthétique, on introduit

dans chaque cas 0,1 ml des solutions titrée d'AFP aux diver-

ses concentrations de réactif de dosage d'AFP préparées dans l'exemple 6 ci-dessus Dans chaque tube à essai, on ajoute

0,4 ml de PBS contenant 1 S de BSA et on agite,-puis on lais-

se reposer pendant 2 heures pour effectuer la réaction Lors-

que la réaction est terminée, on lave chaque tube à essai avec

de l'eau distillée Puis on ajoute-0,5 ml de l'anti-AFP mar-

qué à la HRPO, préparé dans l'exemple 6 (c) ci-dessus et di-

lué 2 000 fois avec du PBS contenant 1 % de BSA, et on lais-

se réagir pendant 2 heures à la température ambiante Lorsque la réaction est terminée, on lave chaque tube à essai avec de l'eau distillée Pour mesurer l'activité de la HRPO, on ajou- te dans chaque tube 0,5 ml de la solution de substrat (PBS

contenant 6 m M/l de peroxyde d'hydrogène et 20 m M/l d'o-phé-

nylène diamine), et on laisse le mélange réagir à la tempéra-

ture ambiante pendant 30 minutes en le protégeant de la lu-

mière On ajoute 2 ml d'acide chlohydrique 1 N et on mélange, puis on mesure l'intensité de la couleur développée à une

longueur d'onde de 492 nm Les résultats pour les courbes éta-

lon sont rapportés sur la figure 1 Lorsqu'on utilise les tu-

bes à essai autres que ceux de l'invention, on peut observer une adsorption non-spécifique par les tubes à essai en verre,

mise en évidence par l'intense développement de la couleur me-

me dans le cas de O ng/ml d'AFP et également par le fait que

le gradient dela courbe étalon est faible Au contraire, lors-

qu'on utilise les tubes à essai de l'invention, étant donné que

le développement de la couleur est à peine visible en l'absen-

ce dt AFP et qu'en outre les gradients des courbes étalon sont

grands, une mesure exacte est possible.

Exemple 8

Dosage de 1 t AFP a) Préparation d'AFP marqué à 125 I On fait réagir 20 ig d'AFP, extraite et purifiée à partir des ascites d'un patient atteint d'un hépatome selon le procédé de Nishi et al, voir ci-dessus, 1 m Ci de Na I et 250 pg de chloramine T dans 0,225 ml de solution de tampon au

phosphate 0,05 M (p H de 7,2) pendant 60 secondes, puis on a-

joute 600 Mg de pyrosulfite de sodium et on laisse réagir pen-

dant 60 secondes Après avoir ajouté 5 mg de KI, on soumet le mélange réactionnel à une filtration sur gel sur Sephadex G-50

et on recueille la première fraction pour obtenir 1 'AFP mar-

qué à 125 I. b) Dosage de l'AFP Dans chaque tube à essai de l'invention préparé dans l'exemple 6 (b) et dans chaque tube à essai autre que ceux de

l'invention, non recouvert d'une résine synthétique, on intro-

duit 0,1 ml de chaque solution titrée d'AFP préparée dans l'e-

xemple 6 (d) et 0,1 ml d'AFP marqué a 5 I préparé dans l'exem-

ple 8 (a) et dilué 20 000 fois avec du PBS contenant 1 %o de BSA On ajoute ensuite 0,3 ml de PBS contenant 1 so de BSA, on agite et on laisse réagir à 4 OC pendant 18 heures Lorsque la réaction est terminée, on lave chaque tube à essai avec de l'eau distillée, et on mesure la réactivité de chaque tube à essai Les résultats pour les courbes étalon sont rapportés

sur la figure 2 Comme on peut le voir d'après la figure 2, les tubes à essai de

l'invention permettent une mesure exacte en raison

de plus grands gradients des courbes étalon.

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Claims (11)

REVENDICATIONS

1 Support pour dosage immunochimique, ayant une

surface apte a fixer un antigène ou un anticorps pour l'in-

solubiliser, la surface étant recouverte avec 'me resine synthétique.

2 Support selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un récipient et la surface est une paroi

interne du récipient.

3 Support selon la revendication 2, caractérisé en

ce que le récipient est un tube à essai.

4 Support selon la revendication 1, caractérisé en

ce qu'il comprend des perles de verre.

Support selon l'une quelconque des revendications

I à 3, caractérisé en ce qu'il est en verre.

6 Support selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine synthétique est choisie parmi des résines

thermoplastiques et des résines thermodurcissables.

7 Support selon l'une quelconque des revendications

1 a 5 caractérisé en ce que la résine synthétique est choisie parmi une résine de silicone, une résine de polystyrène, une

résine acrylique et une résine fluorée.

8 Réactif pour dosage immunochimique, caractérisé en ce qu'il comprend:

a) des anticorps insolubilisés-ou des antigènes inso-

lubilisés fixés à la surface d'un support de verre, la surface étant recouverte d'une résine synthétique, et

b) des anticorps marqués ou des antigènes marqués.

9 Réactif selon la revendication 8, caractérisé en ce que le support comprend une surface de paroi interne d'un récipient O 10 Réactif selon la revendication 9, caractérisé en

ce que le récipient est un tube à essai.

11 Réactif selon la revendication 8, caractérisé

en ce que le support comprend des perles de verre.

12 Réactif selon l'une quelconque des revendica-

tions 8 à 11, caractérisé en ce que la résine synthétique est

choisie parmi une résine de silicone, une résine de polysty-

rène, une résine acrylique-et une résine fluorée.

L 5 13 Réactif selon la revendication 8, caractérisé

en ce qu'au moins un des anticorps insolubilisés ou des anti-

gènes insolubilisés et des anticorps marqués ou des antigènes

marqués est sous une forme lyophilisée.