Récipient utilisable pour effectuer des
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et procédés pour sa préparation et son utilisation L'invention concerne des récipients tels que des tubes à essais utilisables pour effectuer des dosages ou des manipulations immunochimiques et enzymatiques en phase solide, et elle concerne également des procédés pour la préparation et pour l'utilisation de récipients du genre en question. De tels récipients et modes opératoires sont plus particulièrement intéressants à utiliser pour des dosages par radioimmunotitrages en phase solide.
On connaît de nombreux modes opératoires immunochimiques en phase solide. De tels modes opératoires consistent essentiellement, par exemple, à rendre insoluble le réactif biologiquement actif, qu' il convient d'utiliser, avant de procéder à une immuno-réaction, en le fixant à un support solide, par exemple par adsorption physique, par réticulation transversale covalente, ou par liaison covalente. Dans le cas d'un radioimmunotitrage (en abrégé : RIT), un anticorps est rendu insoluble avant d'effectuer la réaction avec un antigène marqué et non marqué.
Des exemples de divers tubes à essais servant de supports insolubles se trouvent décrits¯ dans les brevet US N[deg.] 3 721 528, N[deg.]
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N[deg.] 3 938 953. Ces brevets concernent des tubes, y compris des tubes en deux pièces, revêtus avec diverses substances biologiquement actives telles que des antigènes ou des anticorps. Des particules insolubles servant de supports se trouvent décrites dans les brevets
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3 551 555 décrit des particules de polymère revêtues avec une protéine inerte sur laquelle une substance biologiquement active se trouve adsorbée. Le brevet US N[deg.] 3 553 310 décrit des particules de polymère revêtues avec une protéine inerte à laquelle une substance biologiquement active est couplée en se servant d'un aldéhyde. Le brevet US N[deg.] 3 639 558 décrit des particules de polymère auxquelles une protéine inerte est couplée et qui comportent la substance biologiquement active couplée à la protéine. Un exemple d'une lamelle et d'une membrane microporeuse se trouve décrit dans le brevet US N[deg.] 3 666 421 et dans le brevet Allemagne DT-2539-657.
Divers polymères et agents de couplage se trouvent décrits dans les brevets US N[deg.] 3 555 143, N[deg.] 3 857 931, N[deg.] 3 914 400, N[deg.] 3 826 619, N[deg.] 3 793 445, N[deg.] 3 949 064, N[deg.] 3 646 346, N[deg.] 3 853 987, N[deg.] 3 708 572 et N[deg.]
3 714 345.
Des modes opératoires de RIT en phase solide utilisant un réactif biologiquement actif attaché à un support insoluble ont été mis au point pour simplifier la séparation d'antigène libre à partir d' antigène lié à un anticorps. Toutefois, certains de ces réactifs couramment disponibles possèdent un ou plusieurs des inconvénients suivants : opérations élémentaires de manipulation trop nombreuses
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sensibilité.
Par conséquent, un mode opératoire immunochimique en phase solide permettant une séparation rapide et qui serait précis, sensible et reproductible serait d'un grand intérêt pour les spécialistes de ces techniques.
Selon un premier de ses aspects, la présente invention a pour objet un récipient allongé creux utilisable pour effectuer un mode opératoire immunochimique ou enzymatique, lequel récipient est caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement : (a) une partie inférieure dotée de réactivité, composée d'une substance polymère, ladite partie étant fermée à une de ses extrémités et comportant, sur au moins une portion de sa surface intérieure, un revêtement d'une protéine inerte à laquelle une substance biologiquement active est attachée, et (b) une partie supérieure séparable, inerte, raccordée à, et en communication avec, ladite partie inférieure.
En utilisant le récipient susspécifié lors de la mise en oeuvre d'un procédé immunochimique, il se trouve établi un mode opératoire simple, facilement conduit et qui est précis, sensible et reproductible. Les pièces séparables permettent de plus grandes facilités et uniformités de fabrication, l'établissement d'un revêtement pratiquement uniforme de protéine inerte sur une première surface continue pour effectuer des modes opératoires immunochimiques donnés ; et, par conséquent, elles permettent d'effectuer un dosage ou un essai plus sur et plus précis. Le revêtement de protéine inerte permet d'utiliser efficacement la substance biologiquement votive. La protéine inerte stabilise la substance biologiquement active et accroît son activité. Elle fournit aussi une surface dotée de caractéristiques constantes.
Quand la substance biologiquement active se trouve attachée par
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ment de protéine inerte est plus facile à maîtriser que d'autres formes de fixation. En outre, une exsudation ou une lixiviation de la substance biologiquement active migrant ainsi jusque dans le mélange réactionnel se trouve diminuée par une liaison covalente, ce qui a pour effet d'accroître la précision et la reproductibilité du mode opératoire immunochimique.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a également pour objet un récipient allongé creux caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement : (a) une partie inférieure dotée de réactivité, composée d'une substance polymère, ladite partie étant fermée à une de ses extrémités et comportant au moins une portion de sa surface intérieure et/ou de sa surface extérieure revêtue avec une protéine inerte à laquelle est attachée une substance biologiquement active, et (b) une partie supérieure séparable, inerte, raccordée à, et en communication avec, ladite partie inférieure.
Selon encore un autre de ses aspects, l'invention a aussi pour objet un procédé pour réaliser des récipients du genre susspécifié, et plus particulièrement sur une large échelle commerciale et industrielle.
Selon un autre aspect de l'invention, il est prévu d'utiliser des récipients du genre susspécifié pour effectuer des modes opéra-
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modes opératoires du type radioimmunotitrage (en abrégé : RIT).
On décrit ci-après en détail les modalités de mise en oeuvre de l'invention, en se référant au dessin ci-annexé dans lequel :
la fig. 1 représente, en coupe longitudinale axiale, un récipient allongé creux réalisé conformément à ladite invention, avec ses deux parties raccordées l'une à l'autre ;
et les fig. 2 et 3 représentent respectivement, semblablement
à la fig. 1, la partie supérieure et la partie inférieure dudit récipient après leur séparation l'une de l'autre.
Ainsi qu'on l'a déjà indiqué ci-dessus, la partie inférieure, dotée de réactivité, d'un récipient du genre en question est composée d'une (ou de plusieurs) substance(s) polymère(s). Des substances polymères utilisables pour préparer la partie inférieure, dotée de réactivité, sont bien connues des spécialistes de ces techniques. De telles substances polymères sont typiquement à peu près insolubles dans l'eau, elles possèdent une faible affinité à l'égard de la substance biologiquement active qui y est attachée, et elles sont moulables. Comme exemples de telles substances polymères, on peut
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hydrocarbures, c'est-à-dire polystyrène, polyéthylène, polypropylène, polystyrène diazoté, caoutchouc de butyle et d'autres caoutchoucs synthétiques. D'autres polymères adéquats et utilisables sont des polyesters, des polyamides, de la cellulose, des dérivés cellulosiques, des acrylates, des méthacrylates, et des polymères vinyliques tels que poly(chlorure de vinyle) et polyvinylidène. Comme autres polymères satisfaisants, on peut indiquer des copolymères, tels que des copolymères substitués par greffe de polystyrène et de poly(tétrafluoroéthylène). On peut aussi se servir de verre, typiquement de celui utilisé habituellement pour fabriquer des tubes à essais ou d'autres équipements de laboratoire.
En raison de leur disponibilité dans le commerce et de leur facilité d'utilisation, des polymères plus spécialement intéressants à utiliser sont des copolymères d'éthylène et d'acide acrylique. Typiquement, de tels
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préférables, on peut notamment citer des copolymères d'acide acrylique et d'acrylamide ; de méthacrylate de méthyle et d'acrylamide ; de méthacrylate de méthyle et de méthacrylamide.
La partie inférieure, dotée de réactivité, du récipient en question affecte de préférence la forme d'un tube classique du genre des tubes que l'on utilise pour les opérations immunochimiques. La longueur de ladite partie inférieure dotée de réactivité peut être de n'importe quelle taille convenable, et ladite partie est,
en général, de la longueur nécessaire et suffisante pour pouvoir fournir la quantité voulue de substance biologiquement active pour mettre en oeuvre l'essai ou la méthode immunochimique à effectuer. Généralement, ladite longueur est comprise entre environ 10 mm et
50 mm, de préférence entre environ 15 mm et 25 mm, et de la manière la plus avantageuse elle est égale à environ 20 mm, cependant que son diamètre est compris entre environ 5 et 20 mm, de préférence entre 10 et 20 mm et, de la manière la plus avantageuse, il est égal à environ 12 mm. Une partie inférieure dotée de réactivité qui mesure environ 20 mm de longueur et environ 12 mm de diamètre possède une capacité égale à environ 1,2 ml. Bien entendu, la capacité dé-
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utilisation d'une partie inférieure dotée de réactivité conduit à une plus grande facilité de fabrication. De plus, un équipement et des ingrédients moins actifs sont nécessaires. En outre, la partie inférieure dotée de réactivité peut être établie à partir du polymère le plus avantageux pour former et fixer un revêtement d'une substance biologiquement active, cependant que la partie supérieure inerte peut avantageusement être formée à partir de polypropylène ou de polyéthylène, deux matières qui confèrent à l'ensemble une bonne rigidité, qui sont faciles à travailler et qui sont relativement peu coûteuses.
A la partie inférieure dotée de réactivité est attachée, conformément à l'invention, une protéine inerte. L'expression "protéine inerte" telle qu'elle est utilisée ici doit s'entendre comme signifiant que la protéine en question ne participe pas à la réaction immunochimique et n'affecte pas défavorablement la substance biologique. Les protéines utilisables sont bien connues des spécialistes. Parmi elles figurent toute sorte de matières protéiniques telles que des glogulines ou des albumines du sérum obtenues à partir de diverses espèces animales, ou bien elles peuvent être d'autres matières uniformes.
De telles matières plus spécialement préférées sont la gélatine et la gammaglobuline bovine, substances que l'on trouve facilement dans le commerce. Il est souhaitable que la substance protéinique utilisée soit suffisamment homogène pour que l'on puisse obtenir, lorsqu'on s'en sert, une surface essentiellement continue. Il est facile d'obtenir une telle surface avec les protéines susspécifiées.
On peut attacher ou fixer, à la protéine inerte, des substances choisies parmi une vaste gamme de matières biologiquement actives. Parmi de telles substances, on peut notamment citer des antigènes
et des anticorps possédant des propriétés immunologiques, et des enzymes possédant des propriétés enzymatiques.
Des antigènes peuvent être définis comme étant des substances qui stimulent la formation d'anticorps à l'intérieur de l'organisme d'un animal, et qui peuvent réagir d'une manière observable avec cet anticorps. Des antigènes possèdent généralement un haut poids moléculaire, supérieur ou au moins égal à 10.000. Un haptène est une substance de bas poids moléculaire qui par elle-même est incapable de provoquer une réponse de formation' d'anticorps mais qui, lorsqu'elle est couplée chimiquement à une substance de haut poids moléculaire, par exemple à une protéine, peut susciter une réponse de formation d'anticorps, et l'haptène peut alors réagir avec l'anticorps résultant.
Une description détaillée d'antigènes se trouve donnée dans l'ouvrage de Rosé, Milgram et van Oss ayant pour titre "Principles of Immunology" édité par MacMillan Publishing Co., à New York, N. Y., Etats-Unis d'Amérique, en 1973.
En réponse à une injection d'antigènes, le corps d'un animal produit des anticorps spécifiques qui réagissent avec les antigènes et qui les neutralisent. Les anticorps sont classés comme étant des protéines ayant la solubilité de globulines. Leur poids moléculaire se range principalement en deux groupes, approximativement de
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niles"). Le type de bas poids moléculaire prédomine chez la plupart des espèces animales. Un anticorps lourd se trouve produit chez le cheval, chez la vache et chez le porc immunisé avec des pneumocoques, et chez le lapin immunisé avec des hématies (globules rouges du sang) de mouton. Les poids moléculaires d'anticorps ne diffèrent pas significativement des poids moléculaires de globulines dans des sérums normaux des diverses espèces. Des substances d'une importan-
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continue de protéines qui possèdent des propriétés physiques et chimiques différentes, et des activités biologiques empiétant les unes sur les autres. Elles manifestent de larges variations de mobilité électrophorétique, elles subissent un relargage sur un intervalle considérablement étendu de concentrations d'électrolyte, elles fournissent de nombreuses fractions par mise en oeuvre de la méthode de précipitation avec des alcools, et elles possèdent des constantes de sédimentation comprises entre 7S et 203 (unités Svedberg).
Parmi les anticorps typiques pouvant être attachés à la protéine inerte, on peut notamment citer ceux à l'encontre des haptènes
que sont la digoxine, la triiodothyronine (T3), la thyroxine (T4),
la TSH, l'angiotensine, la gonadotrapine chorionique humaine (GCH) et l'insuline; les divers stéroïdes biologiquement actifs; les acides de la bile; d'autres hormones du type polypeptide; des enzymes et des isoenzymes; et des substances biologiquement actives telles que des médicaments de toxicomanie aussi bien que des médicaments utilisés en thérapeutique et d'autres.
Parmi les enzymes que l'on peut attacher à la protéine inerte, on peut notamment citer des diastases, la glucose-oxydase, l'uréase, la maltase, l'amylase, des peroxydases, et d'autres enzymes et coenzymes.
Lors de la mise en oeuvre d'un procédé selon la présente invention, on prépare la partie inférieure, dotée de réactivité, des récipients en ayant recours à une méthode consistant essentiellement :
(a) à revêtir, par adsorption, la surface d'une partie inférieure, dotée de réactivité, avec une protéine inerte et dans des conditions favorisant une adsorption, (b) à attacher une substance biologiquement active au revêtement de protéine inerte de la partie inférieu- <EMI ID=14.1> re, dotée de réactivité, de (a) dans des conditions favorisant la fixation de ladite substance à attacher sur la protéine, (c) à traiter la partie inférieure, dotée de réactivité, de (b) comportant la substance biologiquement active attachée au revêtement de protéine,
avec un agent stabilisant afin de stabiliser une telle substance biologiquement active à l'encontre d'une dénaturation, et (d) à décher la partie, dotée de réactivité, de (c) dans des conditions de séchage qui ne dénaturent pas notablement la substance biologiquement active. Les récipients compris dans la portée de l'invention
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partie inférieure, dotée de réactivité.
La proportion de protéine inerte donnant des résultats optimum dépend de la nature de la protéine inerte, de la partie dotée de réactivité, et des substances biologiques. Cette proportion est facilement déterminable par n'importe quel spécialiste compétent en ces techniques. Il suffit typiquement de mettre en place une mince pellicule de protéine, par exemple correspondant à au moins une épaisseur de couche monomoléculaire, attachée à la surface. Généralement, ceci met en oeuvre une proportion suffisante pour établir un revêtement uniforme permettant d'y attacher et fixer la substance biologiquement active.
Il est facile d'attacher la protéine inerte à la surface pour y former un revêtement par pulvérisation et projection, par trempage ou, de préférence, par immersion de la partie inférieure, dotée de réactivité, dans une solution aqueuse de protéine inerte, avantageusement une solution aqueuse tamponnée dans les conditions où se réalise le revêtement. De cette manière, la protéine se trouve adsorbée sur la surface de la partie inférieure, dotée de réactivité. Il est avantageux d'utiliser des solutions aqueuses, tamponnées aux phosphates. De tels tampons se trouvent décrits dans le Codex de la Pharmacopée américaine (U.S.P.) XIX et sont généralement préparés en utilisant du monohydrogénophosphate dipotassique et du
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appropriées dans de l'eau pour former une solution possédant la valeur désirée du pH que l'on ajuste, si cela apparaît nécessaire, avec KOH ou HC1. Si on le désire, on peut ajouter, à la solutiontampon, un agent bactériostatique afin d'inhiber la croissance de microorganismes ; un tel agent bactériostatique adéquat peut être, par exemple, de l'azide de sodium ou du thimerosal.
La protéine inerte est revêtue dans das conditions permettant une adsorption et ne provoquant pas une dénaturation de la protéine. Les conditions spécifiquement adéquates de pH et de température dé-
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d'adsorption comportent des pH classiques, par exemple compris entre environ 3 et 10, et des températures classiques, par exemple com-
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des températures d'application inférieures à 20[deg.]C et supérieures à
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on n'en tire pas d'avantages significatifs. En fait, à des tempé-
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cile à appliquer. Par exemple, on forme, avec de la gamma-globulino bovine, un revêtement généralement à un pH compris entre 5 à 7, et
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ordinaire.
Pour faciliter la fixation de la protéine inerte, la surface de la partie inférieure, dotée de réactivité, peut, avant de réaliser une telle fixation, être traitée avec diverses matières pour faciliter ou permettre une adsorption de la protéine inerte. Parmi de telles matières figurent des solvants, des agents tensio-actifs, des acides ou des bases.
Des agents tensio-actifs, avantageusement du dodécyl-sulfate de sodium, sont utilisés à la manière d'un détergent pour nettoyer la surface et la rendre mouillable. Si les polymères comportent des radicaux carboxyle sur la surfaèe, il est souvent désirable de les traiter par une base formant des sels, par exemple KOH, afin de les convertir en la forme de sels, en leur donnant ainsi une charge négative qui accroît encore l'attraction électrique, ce qui favorise davantage l'adsorption. La base aide aussi à nettoyer la surface. Sous un autre aspect, il est avantageux d'établir la répartition des charges sur la surface à peu près égale à celle de la protéine inerte à appliquer.
On peut parvenir à ce résultat en lavant la surface avec une solution-tampon aqueuse ayant approximativement le même pH que celui de la solution de formation de revêtement contenant la protéine inerte avant d'appliquer ledit revêtement.
La substance biologiquement active peut être attachée ou fixée par tous moyens appropriés. Parmi de tels moyens appropriés connus dans la technique figurent notamment l'adsorption, la liaison covalente, la liaison ionique et le captage. Il est considéré comme préférable d'attacher la substance biologiquement active par liai-son covalente parce qu'il est alors plus facile de maîtriser la réaction de couplage et parce que le produit résultant est plus stable.
Des méthodes permettant de lier chimiquement, c'est-à-dire par covalence, les substances biologiquement actives à la protéine inerte se trouvent décrites dans les brevets US N[deg.] 3 553 310 et N[deg.]
3 639 558. Une méthode préférée pour réaliser la, liaison covalente de la substance biologiquement active à la protéine inerte consiste essentiellement à traiter d'abord la protéine avec un agent de couplage du type aldéhyde, puis à appliquer la substance biologiquement
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quement active. Des agents de couplage convenables, du type aldéhyde, sont ceux qui possèdent soit une double liaison éthylénique
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dicaux aldéhyde, soit ces deux particularités simultanément. Pour des raisons de facilité et de commodité, il est considéré comme préférable d'utiliser un aldéhyde choisi parmi le groupe constitué par
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substances afin de former des produits de réaction de l'aldéhyde avec le revêtement de protéine inerte. Les aldéhydes a,�-non satutés peuvent être choisis parmi les composés représentables par la formule générale suivante :
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de l'hydrogène ou un radical méthyle. Ces exemples représentatifs de ce type d'aldéhyde sont l'acroléine, la méthaacroléine et le 2buténal. On peut utiliser des dialdéhydes tels que le glutaraldéhyde, le propanedial et le butanedial.
Quand un de ces aldéhydes est mis en contact avec la surface
de la protéine inerte, la protéine est stabilisée et se trouve poly-
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actives de molécules d'aldéhyde se trouvent fixées aux surfaces.
On pense que ces portions peuvent être des radicaux carbonyle et, en tant que tels, sont dotés d'une haute réactivité à l'égard des radicaux amino de la substance biologiquement active, étant donné qu'ils forment des liaisons covalentes entre les particules de protéine et les substances biologiquement actives.
A la place des aldéhydes, on peut utiliser, comme agents de couplage, d'autres substances telles que des composés comportant au moins deux des radicaux dotés de réactivité suivants : azoïque, acide sulfonique, des radicaux fluoro activés par des radicaux ni-
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à un cycle possédant une structure de résonance adéquate. Ces radicaux dotés de réactivité sont capables de réagir avec les radicaux amino primaire, sulfylhydryle, carboxyle, hydroxyle et phénoliques se trouvant dans la substance constituant la protéine inerte aussi bien que dans les substances biologiques à y coupler.
Comme exemples représentatifs de tels agents de couplage, on peut notamment citer : acide bis-diazobenzadine-disulfonique,
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nitrophénylsulfone, un carbodiimide, toluène diisocyanate, chlorure cyanurique, dichlorctriazine, perchlorate de N-tert.-butyl-5-méthylisoxazolium. Comme carbodiimides utilisables, on peut citer :
N,N-dicyclohexylcarbodiimide, chlorhydrate de 1-éthyl-3(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide, et métho-para-toluènesulfonate de 1-cyclo-
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A titre de variante, les substances biologiquement actives susmentionnées peuvent être attachées par adsorption en ayant recours au mode opératoire décrit dans le brevet US N[deg.] 3 551 555.
La proportion d'agent de couplage qu'il convient d'utiliser lors de la mise en oeuvre du procédé préféré selon l'invention peut dépendre de la protéine inerte particulière et de la substance biologiquement active qu'il s'agit de coupler ensemble. Cette proportion est facilement déterminable par n'importe quel spécialiste compétent mais, typiquement, il convient de mettre en oeuvre une proportion capable de réaliser une réticulation transversale de la protéine inerte et de fournir un nombre de sites suffisants pour coupler, à la protéine inerte, suffisamment de substance biologiquement active pour permettre d'effectuer le mode opératoire désiré,
du type immunochimique ou enzymatique. Dans le cas d'aldéhyde,
une telle proportion, exprimée en poids par volume (p/vol.), est
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Typiquement, un applique l'agent de couplage sous la forme d'une solution dans un tampon aqueux, et de la manière la plus avantageuse dans un tampon au phosphate qui peut contenir d'autres ingrédients tels que des antioxydants et des agents bactériostatiques. Un tel agent de couplage peut être appliqué à n'importe quel pH convenable, par exemple compris entre environ 3 et environ 10.
On peut, convenablement et commodément, appliquer l'agent de couplage à la température ambiante ordinaire. On peut opérer à des
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le fait d'utiliser des températures inférieures à 4[deg.]C n'apporte aucun avantage significatif. De même, on peut opérer à des températures plus élevées, atteignant, par exemple, jusqu'à 50[deg.]C, mais de telles températures, elles non plus, n'apportent aucun avantage significatif. Dans le cas d'aldéhydes, le pH adéquat est généralement compris entre environ 6 et 8, tandis que la température appro-
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inerte, il est avantageux de laver ladite protéine avec le même tampon, mais dépourvu de l'agent de couplage, avant d'effectuer le traitement par le tampon contenant l'agent de couplage. Etant donné que la stabilité de l'agent de couplage est maximum au pH de la solution-tampon, un tel lavage établie un milieu qui est le plus favorable à la stabilité dudit agent de couplage.
La proportion de substance biologiquement active qu'il convient d'utiliser lors de la mise an oeuvre de la présente invention peut dépendre de la nature de la protéine inerte et de la substance biologiquement active particulière en question. De telles proportions sont facilement déterminables par n'importe quel spécialiste, compétent en ces techniques. Typiquement, il convient de mettre en oeuvre une proportion suffisante pour effectuer le dosage ou l'opération impliquant l'utilisation de la substance biologiquement active en question. Par exemple, dans le cas d'un certain antisérum du type digoxine, la dilution, c'est-à-dire le rapport (nombre de parties d'antisérum contenant de l'anticorps)/(nombre de parties de solution de traitement), est comprise entre environ 1/300 000 et environ 1/360 000, et de préférence entre 1/325 000 et 1/335 000.
La substance biologiquement active est avantageusement appli-
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tion aqueuse du type tampon aux phosphates. On l'applique dans des conditions de fixation ne provoquant pas une dénaturation de la protéine, conditions impliquant une application à la température ambiante ordinaire (bien que l'on puisse utiliser des températures soit plus élevées, soit plus basses), et à n'importe quel pH convenable, compris entre 3 et environ 10. On peut, si cela apparaît
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encore plus basses, ou aussi élevées que 50[deg.]C. On ne tire, toute-stance biologiquement active en question à l'encontre d'une dénatu-
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ses à 20[deg.]C. On le met généralement en oeuvre à raison d'une pro-
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On l'applique habituellement sous la forme d'une solution-tampon aqueuse, qui est de préférence un tampon aux phosphates, à la température ambiante ordinaire. Généralement, le pH de cette solutiontampon dépend du pH auquel on observe la plus grande stabilité de la substance biologiquement active. Après le traitement par l'agent stabilisant, on égoutte la pièce inférieure, dotée de réactivité, puis on la sèche dans des conditions de séchage telles qu'elles ne provoquent pas une dénaturation de la substance biologiquement active en question. Il est avantageux de recourir à une opération de séchage sous vide. On peut utiliser n'importe quel séchoir adéquat disponible dans le commerce, en opérant à des températures de sé-
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entre 25[deg.]C et 35[deg.]C.
Entre chacune des opérations élémentaires susmentionnées, il est préférable d'effectuer plusieurs lavages à l'eau pour garantir qu'il n'interviendra aucune contamination. Généralement, les solutions de traitement, au cours de leur application, sont agitées à une allure telle qu'elle n'affecte défavorablement ni la protéine inerte, ni le revêtement de protéine inerte, ni la substance biologiquement active, ni le revêtement de protéine auquel ladite substance biologiquement active est attachée et fixée ; cette agitation ne doit pas non plus provoquer une formation excessive de bulles, tout en étant cependant suffisante pour assurer une bonne homogénéisation du mélange et permettre de réaliser le traitement approprié.
Par exemple, dans le cas de la solution servant à réaliser le traitement de la protéine inerte, l'allure d'agitation appropriée est facilement déterminable en soumettant un certain nombre de lots à diverses allures d'agitation, puis en déterminant les allures optimales. On peut avoir recours au même mode opératoire pour déterminer l'allure adéquate pour les solutions de traitement contenant l'aldéhyde, la substance biologiquement active, et pour les diverses solutions-tampons.
Généralement, on utilise environ 6 parties de solution de traitement pour chaque partie inférieure dotée de réactivité. On peut en utiliser moins ou davantage, par exemple environ de 2 à 12 par-ties pour chaque partie inférieure dotée de réactivité.
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te invention est réalisable à partir de n'importe lequel des polymères susmentionnés, et aussi à partir de verre. Par le terme "inerte", il convient de comprendre que la matière constitutive de la partie supérieure en question ne doit exercer aucune influence défavorable sur les substances biologiques participant à l'épreuve d'essai immunochimique. Parmi des polymères typiquement utilisés pour des raisons de facilité et de commodité et en raison de leur prix de revient relativement bas, on peut notamment citer le polypropylène et le polyéthylène. En outre, ile possèdent l'avantage de conférer au dispositif une bonne rigidité. Il est, en effet, facile de se rendre compte du fait que la partie supérieure inerte a pour but essentiel de donner à l'ensemble une capacité adéquate en vue d'effectuer convenablement l'opération immunochimique ou enzymatique.
Habituellement, cette partie est constituée par au moins une
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et attachée à la partie inférieure dotée de réactivité. Elle peut ainsi être attachée en ayant recours à des moyens appropriés quelconques, permettant d'établir un récipient exempt de fuites (par exemple, étanche à l'eau). Par exemple, la partir inférieure peut être conçue de manière à s'adapter à frottement relativement doux sur la partie supérieure. La partie supérieure peut aussi être attachée par scellement thermique ou par tous autres moyens adéquats et bien connus des spécialistes de ces techniques. Les dimensions de la partie supérieure inerte peuvent varier selon les modes opératoires immunochimiques ou enzymatiques qu'il s'agit de mettre en oeuvre, et ce d'une manière facilement compréhensible de la part d'un spécialiste.
Généralement, la longueur est comprise entre environ
50 mm et environ 100 mm, de préférence entre environ 55 mm et environ 80 mm ; de la manière la plus avantageuse, elle est égale à 65 mm. Le diamètre est généralement approximativement égal à celui de la partie inférieure, dotée de réactivité.
Les différentes figures du dessin ci-annexé représentent un mode de réalisation préféré du récipient selon l'invention. La fig. 1 montre un dispositif selon l'invention et qui se présente sous la formé d'un tube. La fig. 2 en montre la partie supérieure inerte. La fig. 3 en montre la partie inférieure dotée de réactivité. Ladite partie inférieure 1 dotée de réactivité comporte un revêtement de protéine inerte auquel la substance biologiquement <EMI ID=44.1>
extérieure 4. La partie supérieure inerte et séparable 2 est attachée à la partie inférieure 1 dotée de réactivité.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les parties inférieures, dotées de réactivité, des récipients en question comportent sur leurs deux surface�, intérieure et extérieure, un revêtement de protéine inerte auquel la substance biologiquement active est attachée par lir.ison covalente.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de ces
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immunochimiques, afin d'analyser ou doser des concentrations d'antigènes ou d'haptènes, et ce d'une manière plus particulièrement avantageuse en ayant recours à des techniques de radioimmunotitrage
(en abrégé : RIT). De tels modes opératoires de RIT, et les techniques permettant de les mettre en oeuvre, sont bien connus des spécialistes. Il se trouvent décrits d'une manière plus détaillée dans les exemples suivants qui, bien entendu, ne sont pas limitatifs et servent uniquement à illustrer les modalités de mise en oeuvre de l'invention.
<EMI ID=46.1>
On prépare comme suit 1 300 parties inférieures, dotées de réactivité, possédant la forme représentée fig. 3. ayant une capacité
<EMI ID=47.1>
liq.ue . (contenant en moles 92% de polyéthylène.:Et 8% d'acide acrylique:
(1) Les 1 300 parties inférieures non traitées sont immergées,
à l'intérieur d'un récipient en alliage communément dénommé acier inoxydable ou en polyéthylène, contenant 7800 ml d'une solution aqueuse à 0,5 % de dodécylsulfate de sodium (en abrégé : SIS) et agitées pendant 30 minutes à la température ambiante ordinaire.
(2) On enlève la solution de SDS, on la remplace par 7800 ml d'eau et on lave ensuite les pièces pendant cinq minutes. (3) On enlève l'eau, on la remplace par 7800 ml d'une solution aqueuse 0,2 N d'hydroxyde de potassium, et on agite les pièces dans cette solution pendant 30 minutes. (4) On enlève ensuite la solution d'hydroxyde de potassium, on la remplace par de l'eau et on y lave les pièces pendant 5 minutes. On répète cette opération de lavage jusqu'à ce que le pH de la solution de lavage finale atteigne 7,0. (5) On enlève l'eau, on la remplace par une solution aqueuse 0,1 M de phosphate (pH 6,4) contenant 0,1 % de gamma-globuline de boeuf et 0,1 � d'acide de sodium, puis on agite les pièces pendant 30 minutes dans cette solution.
(6) On enlève la solution de gamma-globuline, on la remplace par de l'eau et on y lave les pièces inférieures, dotées de réactivité, pendant 5 minutes. On répète trois fois cette opération de lavage. (7) On remplace l'eau par 7800 ml d'une solution-tampon
<EMI ID=48.1>
y agite les pièces inf3rieures pendant 30 minutes à la température ambiante ordinaire. (8) On enlève la solution de glutaraldéhyde, on la remplace par 7800 ml d'eau et on y lave les pièces pendant 10 minutes*^ On répète,- deux fois cette opération de lavage . (9) On <EMI ID=49.1> pH 7,0) contenant des anticorps du type digoxine (provenant de la chèvre) à une dilution de 1/160 000, du sérum de chèvre normal à une dilution de 1/32 000, 0,1 % d'albumine de sérum de boeuf et 0,01 % d'azide de sodium, et ensuite on agite les pièces inférieures pendant une demi-heure à la température ambiante ordinaire dans cette solution. (10) On remplace la solution de traitement par 7800 ml d'eau et on y lave les pièces inférieures, dotées de réactivité, pendant 10 minutes. On répète deux fois cette opération de lavage.
(11) On remplace l'eau par 7800 ml d'une solution aqueuse tampon à base de glycine et chlorure de sodium (0,1 M ; pH 2,3) et on y lave les pièces pendant 30 minutes à la température ambiante ordinaire.
(12) On enlève la solution-tampon de glycine et on la remplace par
7800 ml d'une solution-tampon de phosphate 0,1 M, pH 7,4 et on y lave les pièces pendant 10 minutes. On répète encore cette opération de lavage une fois. (13) on enlève le tampon au phosphate, on le remplace par 7800 ml d'une solution saline aqueuse tamponnée au phosphate (0,01 M ; pH 7,4, 0,9 % de NaCl) et on agite les pièces inférieures, dans cette solution, pendant 30 minutes à la températ ure ambiante ordinaire. (14) On enlève la solution saline tamponnée au phosphate et on la remplace par 7800 ml d'un tampon au phosphate 0,01 M, pH 7,4, contenant 2 % de poly(alcool vinylique) et 0,01 % d'azide de sodium, puis on y agite les pièces pendant 30 minutes.
(15) Les pièces inférieures, dotées de réactivité, sont séchées sous vide pendant environ deux heures. (16) Aux pièces inférieures dotées de réactivité, on attache les pièces inférieures inertes en enclenchant brusquement les deux pièces ensemble, et on obtient ainsi un tube à essais classique, utilisable pour effectuer des opérations de RIT en phase solide. La pièce supérieure inerte est établie en polypropylène et elle mesure environ 82,5 mm de longueur. Exemple 2.- Opération de RIT.
<EMI ID=50.1>
place 12 tubes revêtus d'anticorps du type digoxine et préparés conformément à l'invention. Dans chaque tube, on introduit, à la pipette, 1 ml de mélange réactionnel de digoxine contenant de la digoxine marquée à l'iode-125 dans une solution-tampon au phosphate
(0,01 M de phosphate, pH 7,4 et 0,9 % de chlorure de sodium). Au
<EMI ID=51.1>
titré contenant la dilution appropriée de digoxine, c'est-à-dire 0 ng par ml dans les tubes 1 et 2 ; 0,4 ng par ml dans les tubes 3 et 4 ; 1 ng par ml dans les tubes 5 et 6 ; 2 ng par ml dans les tubes 7 et 8 ; 3 ng par ml dans les tubes 9 et 10, et 5 ng par ml dans les tubes 11 et 12. On agite modérément le râtelier-support pendant 5 à
10 secondes, puis on incube dans un bain-marie d'eau à 37[deg.]C pendant environ une heure. On sort le râtelier à tubes du bain-marie, puis on décante soigneusement le contenu de tous les tubes. On introduit 2 ml d'eau distillée dans chaque tube, puis on décante. On soumet les tubes à un comptage dans un compteur de rayonnement gamma pendant une minute. On effectue ensuite les calculs comme suit :
1. On calcule le nombre net de coups par minute pour tous les
étalons titrés en retranchant le comptage moyen de fond de l'instrument (ou "bruit de fond").
2. On exprime le taux de comptage corrigé pour chaque jeu d'étalons titrés sous la forme d'un pourcentage du taux de compta-
<EMI ID=52.1>
nombre corrigé de coups par minute
<EMI ID=53.1>
* B = taux de liaison % dans tous les autres tubes
** Bo taux de liaison % dans l'étalon à 0 ng par ml.
3. En utilisant un papier à graphique en coordonnées semi-loga-
rithmiques, on trace la courbe exprimant la variation du rapport B/Bo % pour chaque concentration d'étalon titré en fonction de la concentration de digoxine exprimée en nanogrammes par millilitre (en abrégé : ng/ml).
Opération réelle.
En suivant le mode opératoire décrit ci-dessus, on obtient les résultats consignés dans le Tableau ci-après.
<EMI ID=54.1>
Un graphique visualisant les résultats ci-dessus prouve la sensibilité et la reproductibilité de l'épreuve d'essai.
Exemple 3.-
On suit le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 pour recouvrir des pièces inférieures, dotées de réactivité, avec de l'anti-
<EMI ID=55.1>
dilution de la solution d'anticorps de revêtement utilisée au cours de l'opération élémentaire (9) est de 1/10 000 et que l'on omet le sérum normal de chèvre. On prépare les lots de plusieurs centaines de pièces inférieures dotées de réactivité, en ajustant le volume de solution de traitement sur la base de 6,0 ml par pièce. On utilise ensuite ces pièces pour déterminer le taux d'absorption ou de captage de la triiodothyronine dans des échantillons de sérum.
Exemple 4.-
On utilise les solutions suivantes pour traiter les récipients selon l'invention décrits ci-après.
Réactifs Pour faire un litre de solution.
1. Tampon aux phosphates, 0,1 M, pH 6,4 (I) <EMI ID=56.1> monopotassique à de l'eau.
(b) A la solution provenant de 1(a), ajouter 4,66 g de monohydrogénophosphate dipotassique.
(c) Diluer jusqu'à 900 ml avec de l'eau et ajouter 1,0 g d'azide de sodium. Mesurer le pH avec un pH-mètre. Si le pH est en dehors de l'intervalle compris entre 6,3 et 6,5, l'ajuster avec des solutions de KOH ou de HC1
<EMI ID=57.1> . -"Ion les besoins. (d) Diluer à un litre.
<EMI ID=58.1>
(a) Ajouter, avec agitation, 2,66 g de dihydrogénophosphate mono potassique à de l'eau.
(b) Ajouter, avec agitation, 14,00 g de monohydrogénophosphate dipotassique à la solution 2(a).
(c) Diluer la solution 2(b) jusqu'à 900 ml et mesurer le pH avec un pH-mètre. Si la valeur n'en est pas comprise
<EMI ID=59.1>
de HCl selon les besoins.
(d) Diluer la solution 2(c) jusqu'à un litre.
3. Tampon aux phosphates, 0,01 M, pH 7,0, 0,01 % d'azide de sodium.
(Solution III)
(a) Ajouter, à de l'eau et tout en agitant, 0,533 g de dihydrogénophosphate monopotassique.
(b) A la solution 3(a), on ajoute, tout en agitant, 1,056 g de monohydrogénophosphate dipotassique.
(c) Diluer la solution 3(b) jusqu'à 900 ml avec de l'eau et ajouter 100 mg d'azide de sodium..Mesurer le pH avec
un pH-mètre. Ajuster, si cela apparaît nécessaire, le pH entre 7,0 et 7,1 à l'aide d'une solution de KOH ou
de HCl.
(d) Diluer la solution 3(c) jusqu'à un litre.
<EMI ID=60.1>
(a) Ajouter, tout en agitant, 7,5 g de glycine et 5,85 g de chlorure de sodium à 600 ml d'eau.
(b) A la solution 4(a), ajouter 5,3 ml de HCl concentré et diluer jusqu'à 900 ml. Si le pH se trouve situé en dehors de l'intervalle compris entre 2,3 et 2,4, l'ajuster avec des solutions de KOH ou de HCl selon les be-
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<EMI ID=62.1>
On prépare, en opérant de la manière décrite ci-dessus, 100 pièces inférieures, dotées de réactivité, possédant la forme représentée fig. 3, ayant une capacité de 1,1 ml et composées d'un polymère de polyéthylène et d'acide acrylique (92%, en moles, de polyéthylène et. 8%, en moles, d'acide acrylique).
(1) Les 100 pièces inférieures non traitées sont plongées, dans un récipient en alliage (communément dénommé acier inoxydable) ou
en polyéthylène contenant 600 ml d'une solution aqueuse à 0,5 � de <EMI ID=63.1> dant 60 minutes à la température ambiante ordinaire. (2) On enlève la solution de SDS, on la remplace par 600 ml d'eau et on lave ensuite les pièces pendant 5 minutes. On répète encore deux fois cette opération de lavage. (3) On enlève l'eau, on la remplace par
600 ml d'une solution aqueuse 0,2 N d'hydroxyde de potassium, et on y agite les pièces pendant 30 minutes. (4) Ensuite, on enlève la solution d'hydroxyde de potassium, on la remplace par de l'eau et on y lave les pièces pendant 5 minutes. On répète cette opération de lavage jusqu'à ce que le pH de la solution de lavage finale soit compris entre 7 et 8. On enlève l'eau on la remplace par une
<EMI ID=64.1>
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<EMI ID=66.1>
globuline de boeuf et on y agite ensuite les pièces pendant 30 minutes. (6) On enlève la solution de gamma-globuline, on la remplace par de l'eau et on y lave les pièces inférieures, dotées de réaotivité, pendant 5 minutes. On répète encore deux fois cette opération de lavage. On enlève l'eau et on la remplace par de la solution-tampon aux phosphates (II) et on y lave les pièces pendant
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600 ml d'une solution-tampon aux phosphates (II) contenant 2 � de glutaraldéhyde et on y agite les pièces inférieures pendant 60 minutes à la température ambiante ordinaire. (8) On enlève la solution de glutaraldéhyde, on la remplace par 600 ml d'eau et on y lave les pièces pendant 5 minutes. On répète encore deux fois cette opération de lavage. On enlève l'eau et on la remplace par de la solution-tampon aux phosphates (III) et on y lave les pièces pendant 5
<EMI ID=68.1>
lution-tampon aux phosphates (III) contenant des anticorps du type digoxine (provenant de la chèvre), à une dilution comprise entre
<EMI ID=69.1>
y agite ensuite les pièces inférieures pendant deux heures à la température ambiante ordinaire. (10) On remplace la solution de traitement par 600 ml d'eau et on y lave les pièces inférieures pendant 5 minutes. (11) On remplace l'eau par 600 ml d'un tampon à la
<EMI ID=70.1>
rature ambiante ordinaire. (12) On enlève le tampon à la glycine et on le remplace par 600 ml de tampon aux phosphates (il), puis on y lave les pièces pendant 5 minutes. On répète encore deux fois <EMI ID=71.1> <EMI ID=72.1>
tamponné et on le remplace par 600 ml d'une solution-tampon aux phosphates (II) contenant 2 % de poly(alcool vinylique) et on y agite les pièces pendant 30 minutes. (14) On sèche sous vide, pendant environ deux heures, les pièces inférieures dotées de réactivité.
(15) Aux pièces inférieures dotées de réactivité, ainsi obtenues,
on attache des pièces supérieures inertes en réalisant l'assemblage de deux telles pièces complémentaires par enclenchement brusque, et l'on obtient ainsi un tube à essais classique utilisable pour effectuer des opérations de RIT en phase solide. La pièce supérieure inerte est réalisée en polypropylène et mesure environ 60 mm de longueur.
Exemple 5.-
On suit le mode opératoire décrit dans l'exemple 4 pour revêtir des pièces inférieures, dotées de réactivité, avec un anticorps du
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la solution servant à établir le revêtement d'anticorps au cours de l'opération élémentaire (9) est égale à 1/300 000 et que l'on utilise un anticorps provenant de chèvres. On prépare ainsi des lots de plusieurs centaines de pièces inférieures, dotées de réactivité, en ajustant le volume de la solution de traitement sur la base de la mise en oeuvre de 6,0 ml d'une telle solution par pièce.
Exemple 6.-
On suit le mode opératoire décrit dans l'exemple 4 pour revêtir des pièces inférieures, dotées de réactivité, avec un anticorps
<EMI ID=74.1>
solution de traitement utilisée au cours de l'opération élémentaire
(9) est égale à 1/2 000 et que l'anticorps provient de lapins. On prépare ainsi des lots de pièces en ajustant le volume de la solution de traitement sur la base de la mise en oeuvre de 6,0 ml d' une telle solution pour chaque pièce.
<EMI ID=75.1>
Dans un râtelier-support classique pour tubes à essais, on place 14 tubes comportant des revêtements d'anticorps du type thyroxine préparés selon la présente invention. Dans chaque tube, on introduit, à l'aide d'une pipette, 1 ml de mélange réactionnel à base de thyroxine contenant un tampon au véronal (0,076 M, pH 8,6),
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<EMI ID=77.1>
tube à l'exception de deux, on introduit, à l'aide d'une pipette, .......
<EMI ID=78.1>
dans les tubes 3 et 4 ; 5 ng/ml dans les tubes 5 et 6 ; 10 ng/ml dans les tubes 7 et 8 ; 20 ng/ml dans les tubes 9 et 10, et 40 ng/ml dans les tubes 11 et 12. Dans les tubes 13 et 14, on introduit, à
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lier pendant de 5 à 10 secondes, puis on fait incuber les prises d'essais dans les tubes, plongés dans un bain-marie d'eau à environ
37[deg.]C, pendant environ une heure. On sort le râtelier du bain-marie, puis on décante soigneusement le contenu de tous les tubes. On distribue deux millilitres d'eau disti-.lée dans chacun de toua les tubes, puis on décante de nouveau. On procède au comptage sur les tu-
<EMI ID=80.1>
effectue ensuite les calculs comme suit :
1. On calcule le nombre net de coups par minute pour tous les
étalons titrés en retranchant le comptage moyen de fond (ou "bruit de fond") de l'instrument.
2. On exprime le taux de comptage corrigé pour chaque jeu
d'étalons titrés sous la forme d'un pourcentage du taux de
<EMI ID=81.1>
nombre corrigé de coups par minute
<EMI ID=82.1>
* B = taux de liaison % dans tous les autres tubes
** Bo = taux de liaison % dans l'étalon à 0 ng/ml.
3. En utilisant un papier à graphique en coordonnées semi-loga-
rithmiques, on trace la courbe exprimant la variation du taux B/Bo %,pour chaque concentration d'étalon titré, en fonction de la concentration de T4 exprimée en ng/ml.
Opération réelle.
En suivant le mode opératoire décrit ci-dessus, on obtient les résultats consignés dans le Tableau ci-après :
<EMI ID=83.1>
Un graphique illustrant les résultats ci-dessus prouve la sensibilité et la reproductibilité de l'épreuve d'essai.
<EMI ID=84.1>
Dans un râtelier-support classique pour tubes à essais, on place 6 tubes revêtus d'anticorps du type T3 préparés conformément à l'invention. Dans chacun de ces tubes, on introduit, à l'aide d'une pipette, 1 ml de mélange réactionnel de T3 contenant 0,05 M de
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et 100 pg/ml de triiodothyronine marquée à l'aide d'iode-125. Dans
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sérum normalisé (titré), et, dans les trois autres, on introduit, à la pipette, 25 microlitrea de sérums inconnus. On agite modérément le râtelier pendant de 5 à 10 secondes, puis on incube le contenu des tubes en plongeant la tout pendant environ une heure dans un bain-marie d'eau à une température d'environ 20-26[deg.]C. On en sort ensuite le râtelier, puis on décante soigneusement le contenu de tous les tubes. On distribue 2 ml d'eau distillée dans chacun des tubes, puis on décante. On procède ensuite au comptage des tubes à l'aide d'un compteur de rayonnement gamma pendant une minute. On effectue les calculs comme suit :
1. On calcule le nombre net de coups par minute pour tous les
étalons titrés en retranchant le comptage moyen de fond (ou "bruit de fond") de l'instrument.
2. On calcule l'indice de capacité de liaison de thyro (en
abrégé : TBC pour "Thyro Binding Capacity") pour chaque échantillon de sérum à l'aide de la formule suivante :
nombre net de coups/mn
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Déterminé à partir d'un sérum-étalon titré.
Il convient d'insister encore sur le fait que tout spécialiste, après avoir pris connaissance de la description ci-dessus, pourra facilement imaginer et utiliser de nombreuses autres variantes et modifications des divers modes de réalisation de l'invention, et ce sans s'écarter pour autant de l'esprit ni de la portée de ladite invention.
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REVENDICATIONS
1. Récipient allongé creux utilisable pour effectuer un mode opératoire immunochimique ou enzymatique, lequel récipient est caractérisé en ce qu'il comporte essentiellement : (a) une partie ou pièce inférieure dotée de réactivité, composée d'une substance polymère, ladite partie ou pièce étant fermée à une de ses extrémités et comportant, sur au moins.une portion de sa surface intérieure, un revêtement d'une protéine inerte à laquelle une substance biologiquement active -est attachée ; et (b) une partie ou. pièce supérieure séparable, inerte, raccordée à, et en communication avec, ladite partie ou pièce inférieure.