FR2598811A1

FR2598811A1 - Immunoessai enzymatique.

Info

Publication number: FR2598811A1
Application number: FR8706639A
Authority: FR
Inventors: Yasuhiko Tanaka; Masakazu Sugiura; Kazuto Sakata
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 1986-05-13
Filing date: 1987-05-12
Publication date: 1987-11-20
Also published as: JPH081438B2; GB8711055D0; JPS63118656A; GB2190490B; DE3715984A1; GB2190490A

Abstract

IMMUNOESSAI ENZYMATIQUE CONSISTANT1 A FAIRE REAGIR A UN IMMUN-COMPLEXE OBTENU PAR REACTION (A) D'UNE SUBSTANCE ANTIGENIQUE, (B) D'UN PREMIER ANTICORPS RECONNAISSANT LA SUBSTANCE ANTIGENIQUE ET (C) D'UN DEUXIEME ANTICORPS RECONNAISSANT LA SUBSTANCE ANTIGENIQUE, PROVENANT D'UNE ESPECE ANIMALE DIFFERENTE, AVEC B UN TROISIEME ANTICORPS MARQUE PAR UN ENZYME RECONNAISSANT UNE IMMUNOGLOBULINE, PROVENANT DE LA MEME ESPECE ANIMALE QUE LE DEUXIEME ANTICORPS; (2) A SEPARER UNE PHASE SOLIDE DE LA PHASE LIQUIDE; ET (3) A MESURER PAR L'ACTIVITE ENZYMATIQUE LA QUANTITE D'ENZYME PRESENTE DANS LA PHASE SOLIDE. LE PREMIER ANTICORPS EST IMMOBILISE SUR UN SUPPORT ORGANIQUE OU INORGANIQUE. APPLICATION : QUANTIFICATION D'UNE SUBSTANCE ANTIGENIQUE, AVEC UNE SENSIBILITE AMELIOREE.

Description

La présente invention a pour objet un immunoessai enzymatique (IEE).

Comme technique d'IEE, on connaît l'IEE du type sandwich. Cette technique consiste à faire réagir 5 un antigène lié à un premier anticorps immobilisé avec un second anticorps marqué par un enzyme, réaction suivie par la mesure de la quantité dudit enzyme (comme dans

le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 474 878).

Cependant, cette technique présente des 10 inconvénients, une sensibilité suffisante n'étant pas

obtenue lorsque le titre du second anticorps est faible.

Un objectif de la présente invention consiste

à proposer un IEE ayant une sensibilité améliorée.

Un autre objectif de la présente invention 15 consiste à proposer un IEE offrant une sensibilité élevée

même lorsque le titre du second anticorps est faible.

Encore un autre objectif de la présente

invention consiste à proposer un IEE capable d'utiliser un anticorps non purifié comme second anticorps, avec 20 une sensibilité suffisamment élevée.

Encore un autre objectif de la présente

invention consiste à proposer un IEE permettant de parvenir à une mesure de haute spécificité en ce qui concerne l'antigène.

En quelques mots, ces objectifs, parmi d'autres, de la présente invention, tels qu'ils apparaîtront plus aisément ci-après, ont été atteints d'une manière générale par une méthode d'immunoessai enzymatique pour la quantification d'une substance antigénique, comprenant 30 les étapes consistant: (1) à faire réagir [A] un immun-complexe, obtenu par réaction, à un moment donné, (a) de la substance antigénique, (b) d'un premier anticorps immobilisé reconnaissant 35 la substance antigénique et (c) d'un deuxième anticorps

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reconnaissant la substance antigénique, provenant d'une espèce animale différente, avec [B] un troisième anticorps marqué par un enzyme reconnaissant une immunoglobuline, provenant de la même espèce animale que le deuxième. anticorps; (2) à séparer une phase solide de la phase liquide; et

(3) à mesurer la quantité de l'enzyme présent dans la phase solide par l'activité enzymatique.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins

annexés sur lesquels les figures 1, 2, 3, 4, 5 et 6 sont des -5 courbes de référence d'IEE obtenues, respectivement, dans l'exemple 1, l'exemple comparatif 1, l'exemple comparatif 2, l'exemple 2, l'exemple comparatif 3 et

l'exemple comparatif 4.

Des exemples illustratifs de substances 20 antigéniques convenables utilisées dans la présente invention sont 1) des hormones, comme l'insuline, la sousunité bêta de la gonadotrophine chorionique humaine (HCG-bêta), l'hormone de croissance, la thyréostimuline (TSH), la thyroxine, la triiodothyronine, etc. 2) des protéines sériques, comme les IgG, les IgA, les IgM, les IgE, l'alpha-foetoprotéine, la bêta microglobuline, la TBG, etc. 3) des antigènes associés aux tumeurs, comme 30 l'antigène carcinoembryonnaire (CEA), la ferritine, le POA, le CA-19-9, le CA125, etc.; et 4) des substances pathogènes (bactéries pathogènes, virus, parasites ou protozoaires, provoquant -diverses maladies), comme un streptocoque, les virus de l'hépatite (comme le virus de l'hépatite B), le virus À -.. de la rubéole, le virus de l'herpès, Toxoplasma gondii, le parasite responsable du paludisme, etc. Parmi ces antigènes, les antigènes préférés sont l'HCG-bêta, la TSH, le CEA et le virus de l'hépatite B, en ce qui concerne la sensibilité élevée. Les premiers anticorps convenables, utilisables dans la présente invention, comprennent des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux. Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus en immuni10 sant un mammifère (comme le lapin, la chèvre, le mouton, le cobaye, etc.), avec l'antigène. Des anticorps monoclonaux utiles dans la présente invention peuvent être obtenus par un procédé connu, tel que décrit, par exemple, dans Nature 256, 495-497. Dans son principe, il consiste 15 à injecter à une souris ou un autre mammifère convenable une substance immunogène, à fusionner des cellules productrices d'anticorps prélevées chez l'animal avec des cellules de myélome (provenant d'tume souris ou d'un autre animal convenable), et à cultiver ou effectuer un déve20 loppement en ascite de l'hybridome ou cellule hybride résultant. Ces anticorps peuvent être purifiés par des procédés connus, comme par précipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie sur DEAE-cellulose, chromatographie d'affinité, etc. Dans la présente invention, le premier anticorps peut être immobilisé sur un support inorganique

ou organique (substance solide insoluble).

Des supports convenables comprennent des supports inorganiques, par exemple des matières sili30 ceuses [telles que le verre(verre poreux, verre dépoli,

etc.), la silice (gel de silice, silice colloidale), la bentonite, la wollastonite, la cordiérite, etc.], et des oxydes métalliques non siliceux [tels que l'alumine, la spinelle, l'apatite, l'hydroxy-apatite, le 35 dioxyde de titane, la zircone, et des substances magnéti-

25988 Il1 ques (telles que des oxydes de f er, la f errite, des oxydes de nickel, des oxydes de cobalt, etc.)] et des supports organiques, par exemple des matières plastiques (telles que le polystyrène et ses dérivés, tels que le poly(aminostyrène) des polymères acryliques, Comme le polyacrylonitrile;des polyméthacrylates, comme le poly(méthacrylate de méthyle) des polyoléfines, comme le polyéthylène, le polypropylène, le polybutène et le polybutadiène; des polymères halogénés, comme 1o le poly(chlorure de vinyle) et le poly(chlorure de vinylidène); des polyesters, comme le poly(téréphtalate d'éthylène); des polyamides, comme le "Nylon 6" et le "Nylon 6,6"; etc.] et des polymères naturels, comme des polysaccharides, la cellulose, le dextrane, l'agarose, le papier (comme le papier-filtre), un polypeptide, le collagène, etc. Ces supports peuvent être de nature particulaire, allant d'une poudre finement divisée à une matière granulaire grossière (par exemple mailles d'environ 20 à environ 100 ou plus, tamis de référence des EtatsUnis d'Amérique), ou bien peuvent être un article façonné, * comme une feuille ou une pastille, ou des articles tridimensionnels, comme des billes, des tubes à essai, des bacs, des disques, etc. Parmi ceux-ci, les préférés *-25 sont le verre (en particulier les perles de verre et * les tubes à essai en verre) et des matières plastiques * (tubes en matière plastique et bacs en matière plastique). Ces supports peuvent être poreux ou modifiés en surface par des procédés connus, comme par décapage ou dépolissage, traitement chimique, revêtement chimique, etc. L'anticorps peut être immobilisé par n'im- -. porte quel procédé connu, qui peut varier d'une simple adsorption à un couplage chimique. Le couplage chimique consiste normialement à traiter le support avec un ou plusieurs composés chimiques (silanes, polyisocyanates, etc.), puis à mettre en contact le support traité avec une solution aqueuse de l'anticorps. L'adsorption consiste habituellement à mettre en contact une solution 5 aqueuse de l'anticorps à immobiliser avec le support pendant un temps suffisant pour permettre le degré d'immobilisation désiré ou maximal. Des exemples de modes opératoires convenables pour l'immobilisation de l'anticorps sont ceux consistant en une adsorption physique 10 ou un couplage chimique à du verre avec un agent de couplage du type silane avec ou sans agent de réticulation, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 280 992; et ceux consistant en une adsorption physique à des matières plastiques, comme décrit dans E. Engvall, J. Johnson, P. Parlman:Biochim. Biophys,

Acta, 251 (1971) 427-434.

Des exemples de deuxièmes anticorps convenables comprennent: 1) des anticorps polyclonaux, reconnaissant 20 l'antigène et provenant d'une espèce animale différente de celle du premier anticorps [par exemple des anticorps provenant de la chèvre, du mouton, du cobaye, etc. (dans le cas o le premier anticorps provient du lapin), et des anticorps provenant du lapin, de la chèvre, du cobaye, 25 etc., (dans le cas o le premier anticorps provient du mouton)]; et 2) des anticorps monoclonaux, produits en cultivant ou en effectuant un développement en ascite de l'hybridome ou de la cellule hybride résultant,

obtenu par fusion des cellules productrices de l'anticorps contre l'antigène (provenant, par exemple, d'une souris) avec des cellules de myélome (provenant d'une souris) dans le cas o le premier anticorps est un anticorps polyclonal reconnaissant l'antigène et provenant 35 d'un animal (autre qu'une souris).

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Des formes convenables de deuxièmes anticorps comprennent, par exemple, des anti-sérums, un liquide de culture d'hybridome et un liquide d'ascite, ainsi qu'une immunoglobuline pouvant être obtenue en les puri: - 5 fiant.

La concentration de l'immunoglobuline, qui peut varier largement suivant la concentration de l'antigène dans l'échantillon à tester et la concentration du troisième anticorps marqué par un enzyme, est généralement comprise entre environ 0,1 et environ 1000 microgrammes/ml, de préférence entre environ 1 et environ

microgrammes/ml.

L'immun-complexe peut être obtenu, conformément à la présente invention, en faisant réagir en même temps le premier anticorps immobilisé, la substance antigénique et le troisième anticorps. Par exemple, un premier anticorps lié à un support insoluble, un -' -'- échantillon contenant un antigène à tester, et un tampon contenant le deuxième anticorps sont mis à incuber en même temps pour obtenir un immun-complexe. L'incubation peut être effectuée dans des conditions habituelles, par exemple à une température de 5 à 50 C, de préférence de 34 à 40'C, pendant 5 minutes à 2 jours, de préférence

pendant 5 à 30 minutes.

25. Après l'incubation, les matières n'ayant pas réagi peuvent être éliminées de l'immun-complexe résultant de la manière habituelle. Par exemple, i à 5 ml d'un liquide de lavage (comme l'eau distillée, le sérum physiologique, un tampon au phosphate, etc.), ".0 sont ajoutés au mélange incubé, puis le liquide est éliminé par succion en utilisant un dispositif d'aspiration. Le mode opératoire est répété plusieurs fois (par exemple deux à cinq fois) pour obtenir un immun-complexe

séparé des matières n'ayant pas réagi.

NS Des exemples de troisièmes anticorps convenables sont des anticorps reconnaissant l'immunoglobuline, provenant de la même espèce animale que le deuxième anticorps: par exemple, un anticorps (de cobaye) 5 dJtype anti-immunoglobuline de lapin dans le cas o le deuxième anticorps est un anticorps provenant du lapin; un anticorps (de souris) dtapetniimmunoglobuline de chèvre dans le cas o le deuxième anticorps provient

de la chèvre; et un anticorps (de lapin) du type anti-immuno10 globuline de souris dans le cas o le deuxième anticorps provient de la souris.

Quant aux associations du premier, du deuxième et du troisième anticorps, on préfère, eu égard à une adsorption non spécifique inférieure, utiliser 15 le troisième anticorps provenant de la même espèce animale que le premier anticorps. Des exemples illustratifs d'associations du premier, du deuxième et du troisième anticorps sont: (1) le premier anticorps provenant du lapin, le deuxième anticorps, monoclonal, provenant 20 de la souris et le troisième anticorps provenant du lapin; (2) le premier anticorps provenant du cobaye, le deuxième anticorps provenant du mouton et le troisième anticorps provenant du cobaye; (3) le premier anticorps provenant du mouton, le deuxième anticorps provernant 25 du lapin et le troisième anticorps provenant du mouton;

et (4) le premier anticorps provenant de la chèvre, le deuxième anticorps, monoclonal, provenant de la souris et le troisième anticorps provenant de la chèvre. Parmi ceux-ci, (1) et (4) sont préférés, quant à une spécifi30 cité supérieure contre l'antigène.

Des enzymes convenables, pour le marquage du troisième anticorps, comprennent une peroxydase, une phosphatase alcaline, la bêtagalactosidase, etc. Parmi ceux-ci, le plus apprécié est une peroxydase, 35 qui peut offrir un marquage aisé de l'anticorps et une

sensibilité élevée.

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: - 0 : -. f . Le marquage du troisième anticorps peut être effectué par n'importe quel procédé connu, par exemple les procédés décrits dans S. Yoshitake, M.Imagawa, E.Ishikawa, et collaborateurs, J. Biochem. 92 (1982)

1413-1424.

La réaction de l'anticorps marqué par un enzyme avec l'immun-complexe obtenu par réaction conjointe conformément à la présente invention peut être effectuée de la manière habituelle. Par exemple, l'immuncomplexe est transféré dans 100 à 1000 microlitres d'une solution de l'anticorps marqué par un enzyme, puis l'incubation du mélange est effectuée. L'incubation peut etre effectuée dans les conditions habituelles, par exemple à une température de 5 à 5Q0 C, de préférence de 34 à 40 C, pendant 5 minutes à 2 jours, de préférence pendant à 30 minutes.

Le produit de réaction de l'immun-complexe avec l'anticorps marqué par un enzyme peut être lavé avec un liquide de lavage (comme l'eau distillée, le sérum physiologique, un tampon au phosphate, etc.).Après lavage, le produit est transféré dans 100 à 1000 microlitres d'un substrat [tel que l'acide 5-aminosalicylique, l'ortho-phénylènediamine, l'acide 2,2'azinodi -(3-éthylbenzothiazoline)-6'-sulfonique (ABTS), etc., de préférence l'ortho-phénylènediamine], puis l'incubation est effectuée. L'incubation peut être conduite dans les conditions habituelles, par exemple à une température de 5 à 50 C, de préférence de 30 à 40 C, pendant 5 minutes à 1 heure, de préférence pendant 5 à 30 minutes. Après incubation, 1 à 10 ml d'un agent de terminaison de réaction (comme l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique, etc.), sont ajoutés au mélange incubé. Le produit ainsi cb*enu est utilisé pour la mesure cd l'activité enzynatique.

La présente invention étant décrite de manière générale, une meilleure compréhension peut être obtenue en se référant à certains exemples particuliers, qui sont inclus seulement à titre d'illustration et

non à titre limitatif, sauf spécification contraire.

Exemple 1 [mesure du CEA] a) Préparation d'une solution de référence de CEA humain La concentration d'une solution de CEA fortement concentré, obtenue à partir de tumeurs métastatiques du colon par extraction à l'acide perchlorique, a été déterminée en utilisant le "CEA International Reference 10 Standard" (63/701) de la World Health Organization,

avec l'utilisation d'un kit de mesure du CEA [CEA-EIA, produit par DAINABOT], puis en diluant la solution avec du tampon au phosphate 0,02 M pour obtenir des solutions de référence contenant, respectivement, 5, 10, 30 et 15 60 ng/ml.

b) Préparation d'un anticorps monoclonal anti-CEA

Une souris (Balb/c) a été immunisée en injectant une solution de CEA humain à haute concentration.

Au bout de 6 semaines, une suspension cellulaire a été 20 produite à partir de la rate; puis, la fusion d'environ 1 x 108 cellules de la rate et environ 2 x 10 cellules de myélome de souris a été effectuée avec un traitement au PEG. Les cellules fusionnées résultantes ont été cultivées dans du milieu HAT, puis un tri a été effectué 25 pour sélectionner les cellules productrices d'anticorps

(hybridome). Ensuite, cet hybridome a été cultivé comme un monoclone par clonage, puis développement en ascite du monoclone avec une souris. Le liquide ascitique résultant a été purifié pour obtenir une immunoglobuline 30 monoclonale anti-CEA.

c) Préparation d'un anticorps du type anti-imnoqldculire de souris marqué avec une peroxydase Un anticorps du type anti-immunoglobuline de souris (produit par Dako) a été associé à une peroxydase 35 suivant la méthode décrite dans J. Biochem. 92 (1982),

1 4 - 1

1413-1424, puis la substance résultante a été diluée à une concentration de 1/10-1/5000 avec un tampon contenant.1 % de sérum-albumine bovine.

d) Préparation de perles de verre revêtues d'anticorps - polyclonaux anti-CEA Un anticorps polyclonal de lapin anti-CEA (produit par Dako) a été fixé par revêtement à la surface de perles de verre, suivant le procédé du brevet des Etats-Unis d'Amérique No 3 652 761. 10 e) Quantification du CEA humain Une perle de verre revêtue d'anticorps polyclonaux de lapin anti-CEA et 50 microlitres de solution de référence de CEA humain à 60 ng/ml ont été mis à incuber pendant 15 minutes à 370C dans 300 microlitres 15 de tampon au phosphate 0,02 M contenant 10 à 100 microgrammes/ml d'anticorps monoclonal anti-CEA dans un tube à essai, puis la perle a été lavée avec de l'eau distillée. Ensuite, la perle a été enlevée et placée dans 300 microlitres d'une solution d'anticorps du type ati-inmunoglobuline de souris marquée avec une peroxydase, puis une incubation a été effectuée pendant 15 minutes à 37 C. Après un nouveau lavage de la perle avec de l'eau distillée, la perle a été mise à incuber pendant minutes à 37 C dans 400 microlitres d'une solution -25 de substrat (solution d'ortho-phénylènediamine contenant du peroxyde d'hydrogène). Ensuite, la réaction a été terminée en ajoutant 3 ml d'acide sulfurique 1,5 N.

L'absorbance à 492 nm de la solution résultante a été mesurée pour quantifier l'activité enzymatique de l'en30 zyme lié à la perle.

Les activités enzymatiques, dans le as

de solutions de référence de CEA humain à, respectivement, 30, 10, 5 et 0 ng/ml, ont été mesurées de la même manière, pour construire une courbe de référence pour le dosage 35 du CEA humain, comme le montre la figure 1.

Les résultats du dosage du CEA humain étaient tels que l'indique le tableau I. Exemple comparatif 1 [mesure du CEA par une méthode sandwich] a) Préparation d'une solution de référence de CEA humain

L'exemple 1, a) a été répété.

b) Préparation d'une immunoglobuline monoclonale antiCEA

L'exemple 1, b) a été répété.

c) Préparation d'une immunoglobuline monoclonale antiCEA marquée avec une peroxydase L'immunoglobuline monoclonale anti-CEA cidessus a été associée à une peroxydase de la même manière que dans l'exemple 1, c), puis la substance résultante 15 a été diluée à une concentration de 1/10-1/5000 avec

un tampon contenant 1 % de sérum-albumine bovine.

d) Préparation de perles de verre revêtues d'anticorps polyclonaux antiCEA L'exemple 1, d) a été répété. 20 e) Quantification du CEA humain Une perle de verre revêtue d'anticorps polyclonaux de lapin anti-CEA et 50 microlitres de solution de référence de CEA humain à 60 ng/ml ont été mis à incuber pendant 15 minutes à 37'C dans 200 microlitres 25 de tampon au phosphate 0,02 M dans un tube à essai, puis la perle a été lavée avec de l'eau distillée. La perle a été alors enlevée et placée dans 300 microlitres d'une solution d'immunoglobuline monoclonale anti-CEA marquée avec une peroxydase, puis mise à incuber pendant 30 15 minutes à 37 C. Après un nouveau lavage de la perle avec de l'eau distillée, la perle a été mise à incuber pendant 15 minutes à 37 C dans 400 microlitres d'une solution de substrat (solution d'ortho-phénylènediamine contenant du peroxyde d'hydrogène). Ensuite, la réaction 35 a été terminée par addition de 3 ml d'acide sulfurique ".r'"' -2598811 12 1,5 N. L'absorbance à 492 nm de la solution résultante a été mesurée pour quantifier l'activité enzymatique

de l'enzyme lié à la perle.

Les activités enzymatiques dans le cas de solutions de référence de CEA humain à, respectivement, , 10, 5 et 0 ng/ml, ont été mesurées de la même manière pour construire une courbe de référence pour le dosage

du CEA humain, comme le montre la figure 2.

Les résultats du dosage du CEA humain * 10 étaient tels que l'indique le tableau I. Exemple comparatif 2 [mesure du CEA par une méthode de réactions successives]

a) Préparation d'une solution de référence de CEA humain L'exemple 1, a) a été répété.

* b) Préparation d'une immunoglobuline monoclonale anti-CEA L'exemple 1, b) a été répété. c) Préparation d'une immunoglobuline monoclonale antiCEA marquée avec une peroxydase L'exemple 1, c) a été répété. 20 d) Préparation de perles de verre revêtues d'anticorps polyclonaux anti-CEA L'exemple 1, d) a été répété. e) quantification du CEA humain Une perle de verre revêtue d'anticorps poly2 5 clonaux de lapin anti-CEA et 50 microlitres d'une solution de référence de CEA humain à 60 ng/ml ont été mis à incuber pendant 15 minutes à 37 C dans 300 microlitres de tampon au phosphate 0,02 M dans un tube à essai, puis la perle a été lavée avec de l'eau distillée. La perle a été alors enlevée et placée dans 300 microlitres de tampon au phosphate 0,02 M contenant 10 à 100 microgrammes/ml d'anticorps monoclonal anti-CEA, puis une

% * incubation a été effectuée pendant 15 minutes à 370C.

Après lavage de la perle avec de l'eau distillée, -35 la perle a été enlevée et placée dans 300 microlitres d'une solution d'immunoglobuline monoclonale anti-CEA marquée avec une peroxydase, puis mise à incuber pendant 15 minutes à-37 C. Après un nouveau lavage de la perle avec de l'eau distillée, la perle a été mise à incuber 5 dans 400 microlitres d'une solution de substrat (solution d'ortho-phénylènediamine contenant du peroxyde d'hydrogène). Ensuite, la réaction a été terminée en ajoutant 3 ml d'acide sulfurique 1,5 N. L'absorbance à 492 nm de la solution résultante a été mesurée pour 10 quantifier l'activité enzymatique de l'enzyme lié à

la perle.

Les activités enzymatiques dans le cas de solutions de référence de CEA humain à, respectivement, , 10, 5 et 0 ng/ml, ont été mesurées de la même manière, 15 pour construire une courbe de référence pour le dosage

du CEA humain, comme le montre la figure 3.

Les résultats du dosage du CEA humain étaient tels que l'indique le tableau I.

TABLEAU I

25 30

Sensi- Intervalle Précision

bilité d'analyse.

ng/ml ng/ml (coefficient (coefficien de variation de varia%) tion, %) Exemple 1 1,0 0 - 60 5,0 + 0,4 38,2 + 2,2

(8,0 %) (5,8 %)

Exemple

comparatif 4,5 0 - 60 5,3 + 0,9 37,5 + 5,3

(17,0 %) (14,1 %)

Exemple

comparatif 3,9 0 - 60 6,6 + 0,9 40,2 + 5,8

2 (13,6 %) (14,4 %)

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Exemple 2 [mesure -dela TSH] a) Préparation d'une solution de référence de TSH humaine De la TSH humaine (50 microgrammes/flacon), obtenue auprès de UCB Bioproducts, a été diluée avec du tampon au phosphate 0,02 M pour obtenir des solutions de référence contenant, respectivement, 50, 25, 5, 2,5

et 0 UI/ml.

b) Préparation d'un anticorps monoclonal anti-TSH L'exemple 1, b) a été répété, sauf que la -10 TSH humaine ci-dessus a été utilisée à la place du CEA

humain pour obtenir un anticorps monoclonal anti-TSH.

c) Préparation de perles de verre revêtues d'anticorps polyclonaux antiTSH L'exemple 1, d) a été répété, sauf qu'un 1_ anticorps polyclonal de lapin anti-TSH (produit par Dako) a été utilisé au lieu d'un anticorps polyclonal

de lapin anti-CEA.

d) Quantification de la TSH humaine Une perle de verre revêtue d'anticorps poly20 clonaux de lapin anti-TSH et 100 microlitres d'une solution de référence de TSH humaine à 50 UI/ml ont été mis à incuber pendant 30 à 60 minutes à 37 C dans microlitres de tampon au phosphate 0, 02 M contenant 10 à 100 microgrammes/ml d'anticorps monoclonal anti25 TSH dans un tube à essai, puis la perle a été lavée avec de l'eau distillée. La perle a été alors enlevée et placée dans 300 microlitres de solution d'anticorps du type anti-immunoglobuline de. -souris marquée avec une peroxydase, préparée dans l'exemple 1, c), puis une -30 incubation a été effectuée pendant 30 à 60 minutes à 370C. Après un nouveau lavage de la perle avec de l'eau distillée, la perle a été mise à incuber pendant minutes à 10-30 C dans 400 microlitres d'une solution de substrat (solution d'ortho-phénylènediamine contenant 35 du peroxyde d'hydrogène). Ensuite, la réaction a été terminée en ajoutant 3 ml d'acide sulfurique 1, 5 N.

L'absorbance à 492 nm de la solution résultante a été mesurée pour quantifier l'activité enzymatique de l'enzyme lié à la perle.

Les activités enzymatiques dans le cas de

solutions de référence de TSH humaine contenant, respectivement, 25, 5, 2, 5 et O UI/ml, ont été mesurées de la même manière, pour construire une courbe de référence destinée au dosage de la TSH humaine, comme le montre 10 la figure 4.

Les résultats du dosage de la TSH humaine

étaient tels que le montre le tableau Il.

Exemple comparatif 3 [mesure de la TSH par une méthode du type Sandwich] a) Préparation d'une solution de référence de TSH humaine

L'exemple 2, a) a été répété.

b) Préparation d'immunoglobuline monoclonale anti-TSH

L'exemple 2, b) a été répété.

c) Préparation d'une immunoglobuline monoclonale anti20 TSH marquée avec une peroxydase

L'immunoglobuline monoclonale anti-TSH cidessus a été associée a une peroxydase de la même manière que dans l'exemple 1, c), puis la substance risultante a été diluée à une concentration de 1/10-/5000 avec 25 un tampon contenant 1 % de sérum-albumine bovine.

d) Préparation de perles de verre revêtues d'anticorps polyclonaux antiTSH L'exemple 2, c) a été répété. e) Quantification de la TSH humaine Une perle de verre revêtue d'anticorps polyclonaux anti-TSH et 100 microlitres d'une solution de référence de TSH humaine à 50 UI/ml ont été mis à incuber pendant 60 minutes à 37 C dans 200 microlitres de tampon au phosphate 0,02 M contenant 10 à 100 micro35 grammes d'anticorps polyclonal anti-TSH dans un tube 15

25 30 35

à essai, puis la perle a été lavée avec de l'eau distillée. La perle a été alors enlevée et placée dans 300 microlitres d'une solution d'immunoglobuline monoclonale anti-TSH marquée avec une peroxydase, puis une incubation a été effectuée pendant 60 minutes à 37 C. Après un' nouveau lavage de la perle avec de l'eau distillée, la perle a été mise à incuber pendant 30 minutes à 37 C dans 400 microlitres d'une solution de substrat (solution d'ortho-phényl1nediamine contenant du peroxyde d'hydrogène). Ensuite, la réaction a été terminée en ajoutant 3 ml d'acide sulfurique 1,5 N. L'absorbance à 492 nm de la solution résultante a été mesurée pour quantifier l'activité enzymatique de l'enzyme lié à la perle.

Les activités enzymatiques dans le cas de solutions de référence de TSH humaine contenant, respectivement, 25, 5, 2,5 et O UI/ml, ont été mesurées de la même manière, pour construire une courbe de référence pour le dosage de la TSH humaine, comme le montre la figure 5.

Les résultas du dosage de la TSH humaine étaient tels que le montre le tableau II. Exemple comparatif 4 [mesure de la TSH par une méthode de réactions successives] a) Préparation d'une solution de référence de TSH humaine

L'exemple 2, a) a été répété.

b) Préparation d'immunoglobuline monoclonale anti-TSHL'exemple 2, b) a été répété.

c) Préparation de perles de verre revêtues d'anticorps polyclonaux antiTSH L'exemple 2, c) a été répété. d) Quantification cdelaTSH humaine Une perle de verre revêtue d'anticorps polyclonaux de lapin anti-TSH et 100 microlitres d'une solution de référence de TSH humaine à 50 UI/ml ont été

mis à incuber pendant 30 minutes à 37 C dans 200 microlitres de tampon au phosphate 0,02 M dans un tube à essai, puis la perle a été lavée avec de l'eau distillée.

La perle a été alors enlevée et placée dans 300 micro5 litres de tampon au phosphate 0,02 M contenant 10 à 100 microgrammes/ml d'anticorps monoclonal anti-TSH, puis une incubation a été effectuée pendant 30 minutes à 37 C. Après lavage de la perle avec de l'eau distillée, la perle a été enlevée et placée dans 300 microlitres 10 d'une solution d'anticorps du type anti-immunoglobuline de souris marquée avec une peroxydase, puis une incubation a été effectuée pendant 30 minutes à 37 C. Après un nouveau lavage de la perle avec de l'eau distillée, la perle a été mise à incuber dans 400 microlitres d'une 15 solution de substrat (solution d'ortho-phénylènediamine

contenant du peroxyde d'hydrogène). Ensuite, la réaction a été terminée en ajoutant 3 ml d'acide sulfurique 1,5N.

L'absorbance à 492 nm de la solution résultante a été mesurée pour quantifier l'activité enzymatique de l'en20 zyme lié à la perle.

Les activités enzymatiques dans le cas de solutions de référence de TSH humaine contenant, respectivement, 25, 5, 2,5 et 0 UI/ml, ont été mesurées de la même manière, pour construire une courbe de référence 25 destinée au dosage de la TSH humaine, comme le montre

la figure 6.

Les résultats du dosage de la TSH humaine étaient tels que le montre le tableau II.

TABLEAU II

Sensi- Intervalle Précision bilité d'analyse UlI/ml UI/ml UI/ml UI/ml (coefficient (coefficient de variation, de variation, Exemple 2 2,0 0 2,8 + 0,2 26,0 + 1,4

(7,1 %) (5,4 %)

1.0- Exemple

comparatif 6,5 0 - 50 2,6 + 0,7 25,5 + 4,3

(26,9 %) (16,9 %)

Exemple

comparatif 5,7 0 - 50 3,0 + 0,6 28,2 + 4,7

(20,0 %) (16,6 %)

L'IEE conforme à la présente invention offre une sensibilité suffisamment élevée, même si le titre du deuxième anticorps est faible; tandis qu'un IEE par la méthode sandwich et un IEE par la méthode de -20 réactions successives de trois anticorps ont pour résul-tat une sensibilité faible, notamment lorsque le titre du deuxième anticorps est faible. La présente invention peut offrir une sensibilité élevée, même lorsque le deuxième anticorps est un anticorps non purifié, comme 25 des anti-sérums, un liquide de culture ou un liquide d'ascite. En outre, une sensibilité élevée peut être obtenue conformément à la présente invention, même lorsqu'un anticorps monoclonal est utilisé comme deuxième anticorps; tandis que les anticorps monoclonaux possè30 dent généralement une spécificité élevée mais une affinité faible et donc une sensibilité faible. En conséquence, on peut parvenir à une mesure de spécificité élevée avec une forte sensibilité conformément à la présente invention par l'utilisation d'un anticorps monoclonal comme deuxième anticorps. Ainsi, la présente invention est particulièrement utile pour la production de réactifs de diagnostic pour les antigènes CEA, TSH, HCG- bêta et HBs, pour lesquels une sensibilité élevée est requise. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y

être apportées sans sortir de son cadre.

z

-. 1 1

1 l

1- 1 1. -

Claims

REVENDICATIONS 1. Méthode d'immunoessai enzymatique pour la quantification d'une substance antigénique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant: --5 (1) à faire réagir [A] un immun-complexe, obtenu en faisant réagir en même temps (a) la substance antigénique, (b) un premier anticorps immobilisé reconnaissant la substance antigénique et (c) un deuxième anticorps reconnaissant la substance antigénique, provenant d'une espèce animale différente, avec o 1 1

1. _

*1 5 [B] un troisième anticorps marqué par un enzyme reconnaissant une immunoglobuline, provenant de la même espèce animale que le deuxième anticorps; (2) à séparer une phase solide de la phase liquide; et (3) à mesurer la quantité de l'enzyme présent

dans la phase solide par l'activité enzymatique.

2. Méthode suivant la revendication 1, carac20 térisée en ce que le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal.

3. Méthode suivant la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'enzyme est une peroxydase.

4. Méthode suivant la revendication 1, 2 25 ou 3, caractérisée en ce que l'antigène est l'antigène carcinoembryonnaire, l'hormone appelée thyréostimuline, la sous-unité bêta de la gonadotrophine chorionique humaine ou le virus de l'hépatite B.

5. Méthode suivant l'une quelconque des 30 revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le troisième

anticorps provient de la même espèce animale que le -, f. À

- 0 premier anticorps.

6. Méthode suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le premier

3 anticorps est immobilisé sur un support inorganique. StQ-,.0 f 350.

7. Méthode suivant la revendication 6, caractérisée en ce que le support est siliceux.

8. Méthode suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le support est du verre.

9. Méthode suivant la revendication 6, 7 ou 8, caractérisée en ce que le support est en particules

et divisé relativement finement.

10. Méthode suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le premier 10 anticorps est immobilisé sur un support organique.

11. Méthode suivant la revendication 10,

caractérisée en ce que le support est une matière plastique.