JPS63117253A

JPS63117253A - 免疫センサ−

Info

Publication number: JPS63117253A
Application number: JP61264436A
Authority: JP
Inventors: 堀川　幸雄; Satoshi Ibaraki; 敏茨木; Yukio Horikawa; 通昭藤; Hiroshi Jinno; 神野　紘; Seiichi Iwamoto; 岩本　成一
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1986-11-05
Filing date: 1986-11-05
Publication date: 1988-05-21
Anticipated expiration: 2010-12-25
Also published as: JPH07122622B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、免疫センサーに関する。更に詳しくは、抗体
を包括固定化したフィブロインフィルムを、酸素電極に
装着することを特徴とするエンザイムイムノアッセイ用
の免疫センサーに関する。

（従来の技術）抗原抗体反応の高い特異性を利用して検体中に含まれる
特定の抗原あるいは抗体を検出、定量し、疾病等の診断
あるいは治療に役立たせることは広く行われている。な
かでもエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）は、簡便さ
、安全性の面から臨床検査に於ける微量分析手法として
、その有用性は益々高まって来ている。

ＥＩＡに於いては、一般に測定対象の抗原（あるいは抗
体）に対応する抗体（あるいは抗原）を予め適当な不溶
性担体に化学結合法、吸着法、又は包括法等によって固
定化しておき、この固定化抗体（あるいは抗原）に測定
対象の抗原（あるいは抗体）を反応させる固相法が用い
られている。

ところで、最近この固相法の応用として、抗体を固定化
した膜（フィルム）を、酸素電極に装着したＥＩＡ用の
免疫センサーが、感度や取り扱いの容易さから種々検討
されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ＥＩＡに於いて、繰り返し測定に使用することができ、
且つ再現性に優れた新しいタイプの免疫センサーについ
て種々検討を加えた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は上記の点に鑑み種々検討した結果、抗体を
包括固定化したフィブロインフィルムを、酸素電極に装
着することを特徴とする特許ンサーが上記の目的に適う
ことを見出して本発明を完成した。

本発明の免疫センサーは、ガルバニ−型、ポーラログラ
フイー型等の酸素電極の酸素透過膜の外側に、抗体を包
括固定化したフィブロインフィルム（抗体固定化膜）を
装着することによって得られる。

本発明の免疫センサーは、第１図に示されるように反応
セルに組み込んで、免疫反応液、酵素基質液あるいは洗
浄液を順次反応セル中に導入するフロー式（第２図参照
）で、または夫々の溶液を入れた容器に順次浸漬するこ
とにより測定に使用される。

本発明の免疫センサーに用いられる抗体を包括固定化し
たフィブロインフィルムは、特開昭６０−１４２２５９
号公報又は特開昭６０−１５５１２９号公報に記載の方
法によって製造することができる。

酸素電極の酸素透過膜としては、ポリエチレン膜、テフ
ロン膜等が用いられる。

本発明の免疫センサーによって測定しつる抗原としては
、例えばインシュリン、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ
）　、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン等のポリペ
プチド系ホルモン及びＩｇＧ　、　ＩｇＡ。

ＩｇＭ　、　ＩｇＥ、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）
　、カルシノエンプリオニックアンチゲン、ハプトグロ
ビン等の血清蛋白が挙げられる。

上記抗原を測定する際には、夫々に対応する抗体を包括
固定化したフィブロインフィルムが用いられる。

測定はサンドイツチ法によって行うことが好ましい。

標識酵素としては、グルコースオキシダーゼ等の酸素を
直接消費する酸化酵素やカタラーゼを使用することがで
きるが、なかでも酵素活性が高く安定な酵素であるカタ
ラーゼが特に好ましい。

カタラーゼを標識酵素として利用するには、カタラーゼ
と抗体とを予め結合させる必要がある。

従来性われてきたグルタルアルデヒドによる架橋法は、
カタラーゼと抗体との結合が進行しすぎ高分子量化して
生成物が沈澱する、酵素活性や抗体活性を低下させる、
あるいは低収率で再現性が悪い等の欠点を有するため、
以下のようにして製造したカタラーゼ標識抗体を使用す
ることが好ましい。

即ち、上記カタラーゼ標識抗体は、カタラーゼに一般式
（Ｉ）ＮＨＨ８−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ−ＯＲ”　　　　　　（Ｉ　）
（式中、Ｒ１は０１〜Ｃ３のアルキル基を表わし、ｎは
２〜４の整数を表わす。）で示されるメルカプトイミデート化合物を反応させ、　
　　　ＮＨＨ８−（ＣＨ２）。−Ｃ−（ｎは前記に同じ。）をカタ
ラーゼのアミノ基に導入し、次いで、抗体に一般式（式
中、Ｒ２は脂肪族炭化水素又は芳香族炭化水素の二価残
基を表わす。）で示されるスクシニルマレイミド化合物を反応させ、アミノ基に導入後、得られたチオール化カタラーゼとマ
レイミド化抗体とを反応させ、（ｎ、Ｒ２は前記に同じ。）でカタラーゼと抗体とを結
合させることによって製造することができる。

上記製造法は、次のようにして行うことができる。

チオール化カタラーゼは、カタラーゼとメルカブトイミ
デート化合物（Ｉ）とを、窒素、アルゴン等の不活性ガ
ス雲囲気下、又は、エチレンジアミン四酢酸又はその塩
の存在下に、弱アルカリ性の緩衝液、例えば、０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）中で００Ｃ〜４０°Ｃで
０．５〜２０時間反応させることによって得られる。

カタラーゼに導入されるチオール基は、カタラ−ゼ標識
抗体たり２〜６分子が好ましく、そのためカタラーゼに
対するメルカプトイミデート化合物（Ｉ）のモル比は、
１：１０〜１：５００が好ましく、又カタラーゼの濃度
は０．０１〜１　ｍＭが好ましい。

メルカプトイミデート化合物（Ｉ）としては、例えば、
メチル４−メルカプトブチルイミデート、メチル３−メ
ルカプトプロピオイミデート等が挙げられる。

エチレンジアミン四酢酸又はその塩の添加量は１０′″
４Ｍ〜１０−２Ｍが好ましい。エチレンジアミン四酢酸
の塩としてはその２ナトリウム塩が好ましい。

カタラーゼは動植物由来のいずれてもよいが、動物、特
にその肝臓由来のものが好ましい。

このようにして得られるチオール化カタラーゼは、透析
、ゲルクロマトグラフィー、限外濾過によって精製する
ことができるが、特に、限外濾過が好ましい。

チオール化カタラーゼは不活性ガス雰囲気下、あるいは
エチレンジアミン四酢酸又はその塩を１０−’　Ｍ〜１
０−２Ｍ含有する中性の緩衝液中で保存することが好ま
しい。

次に、マレイミド化抗体は、前記測定対象の抗原に対す
る抗体とスクシニルマレイミド化合物（ＩＩ）とを、中
性の緩衝液、例えば０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）中で０°Ｃ〜４０°Ｃで０．５〜２０時間反応させ
ることによって得られる。

抗体に導入されるマレイミド基は、抗体１分子当たり５
〜２０分子が好ましく、そのため抗体に対するスクシニ
ルマレイミド化合物（ＩＩ）のモル比は、１：５〜１：
３００が好ましく、又抗体の濃度は０．００５〜０．１
　ｍＭが好ましい。

スクシニルマレイミド化合物（ＩＩ）としては、一般式
（ＩＩ）に於けるＲ２がプロピレン、ベンチレン等の脂
肪族炭化水素の二価残基、あるいはｌ、３−フェニレン
、１，４−フェニレン等の芳香族炭化水素の二価残基で
ある化合物を挙げることができる。

このようにして得られるマレイミド化抗体は、透析、ゲ
ルクロマトグラフィーによって精製することができる。

最後に、カタラーゼ標識抗体は、このようにして得られ
たチオール化カタラーゼとマレイミド化抗体とを、窒素
、アルゴン等の不活性ガス雲囲気下、又は、エチレンジ
アミン四酢酸又はその塩の存在下に、中性の緩衝液、例
えば、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中でｏ０
ｃ〜４０°Ｃで１〜２０時間反応させることによって製
造することができる。

チオール化カタラーゼに対するマレイミド化抗体のモル
比は、１：１〜６：１が好ましい。

エチレンジアミン四酢酸又はその塩の添加量は１０−’
　Ｍ〜１０−２Ｍが好ましい。エチレンジアミン四酢酸
の塩としてはその２ナトリウム塩が好ましい。

反応終了後、未反応のマレイミド基、チオール基をブロ
ックすることが、カタラーゼ標識抗体の安定性を向上さ
せる上で好ましい。マレイミド基をブロックするには、
システィン、メルカプトエタノール等のチオール化合物
を、又、チオール基をブロックするにはＮ−エチルマレ
イミド等のマレイミド化合物あるいは５，５′−ジチオ
ビス（２−ニトロ安息香酸）　（ＤＴＮＢ）等が用いら
れる。

更に、得られたカタラーゼ標識抗体はゲルクロマトグラ
フィーによって精製することができる。

本発明の免疫センサーを繰り返し使用するためには、測
定後、−旦、固定化抗体膜をｐＨ約２〜４の緩衝液に浸
漬すればよい。

ｐｌ（約２〜４の緩衝液としては、例えば夫々濃度０．
０５〜０．２Ｍのグリシン−塩酸緩衝液又は酒石酸−水
酸化ナトリウム緩衝液が用いられ、この緩衝液に通常１
０〜４０°Ｃで３〜１０分間固定化抗体膜を浸漬するこ
とによって、結合した抗原及び標識抗体を、フィブロイ
ンフィルムに固定化した抗体から容易にその結合能を損
うことなく解離させることができる。

ｐＨが上記範囲を越えると結合が解離しにくくなり、ま
た逆に低くなると固定化抗体が変性し易くなるなど好ま
しくない。

又、上記緩衝液に塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム等の中性塩を０．５〜１０重量％含有させる
と解離操作を一層容易に行うことができる。

〔発明の効果〕

本発明の免疫センサーは、以下の試験結果に示すとおり
、繰り返しＥＩＡに使用することができ、且つ再現性に
も優れており、例えば、連続自動測定装置に適用して多
数のサンプル処理を簡便に行うことができる。

試験例１ヒトＡＦＰの繰り返し測定試験（ヒトＡＦＰの標準曲線
の作成）：実施例１で作成した免疫センサーを用い、第２図に示す
ようなフロー式の測定装置を組み、ヒ）ＡＦＰ　０．２
．５．５．２０ｎｇ／ｍｌの各濃度夫々について４回ず
つ以下のようにして繰り返し測定し、ヒトＡＦＰの標準
曲線を作成した。

反応セル（容量０．２ｍｌ　）に蒸留水を満たし、これ
に標準ヒトＡＦＰ各々０．２．５．５．２０ｎｇ／ｍｌ
、馬血清１０重量％及び製造例１で得られたカタラーゼ
標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体１μｇ／ｍｌを含
有する０、１重量％牛血清アルブミン生理食塩液０．２
　ｍｌを導入し、３０分間静置後、２０ｍ１／ｍｉｎの
流速で１分間蒸留水を流して反応セルを洗浄した。次い
で、２６．５　ｍＭの過酸化水素を含む０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）０．２ｍｌを反応セルに導入し、
酸素電極の酸素濃度に比例した電流値を求めた。続いて
、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，５，ＮａＣ
１２重量％含有）を２０ｍ１／ｍｉｎの流速で３０秒間
流した後、３．５分間静置して結合した抗体と抗原とを
解離させ、更に２０ｍ１／ｍｉｎの流速で１分間蒸留水
を流して反応セルを洗浄した。次に、再び上記の標準Ａ
ＦＰ溶液を反応セルに導入して同様な操作を各濃度夫々
４回ずつ繰り返してヒトＡＦＰの標準曲線（第３図）を
作成した。（なお、操作は、免疫反応は３７°Ｃ１他は
室温で行った。）試験例２ｈＣＧの繰り返し測定試験（ｈＣＧの標準曲線の作ｒｉ
Ｌ）　：実施例２で作成した免疫センサーを用い、第２図に示す
ようなフロー式の測定装置を組み、ヒトＡＦＰの代わり
にｈＣＧ及び製造例２で得られたカタラーゼ標識モノク
ローナル抗ｈＣＧ抗体を用いる以外は試験例１と同様に
して、ｈＣＧ　０．２５．５０゜１００、２００　ｍＩ
Ｕ／ｍｌの各濃度夫々について４回ずつ繰り返し測定し
てｈＣＧの標準曲線（第４図）を作成した。

〔実施例〕

以下に実施例および製造例を挙げて、本発明を更に具体
的に説明する。

カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の製造
：（１）チオール化カタラーゼの製造：カタラーゼ（牛肝臓由来、シグマ社製）　１５ｍｇを０
．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）２．５ｍｌに溶解
し、窒素曝気（６０ｍｌ／ｍ１ｎ）を１０分間行い、次
に、メチル４−メルカプトブチルイミデート１ｍｇを加
え、窒素雰囲気下に４°Ｃで２時間反応させた。反応終
了後、ダイアフローメンブラン■（アミコン社製）を用
いて窒素雰囲気下に限外濾過し、０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）　３ｍｌを加え、再度限外濾過を行っ
た。この操作を３回繰り返し、未反応のメチル４−メル
カプトブチルイミデートを除去した後、チオール化カタ
ラーゼ溶液３ｍｌを得た。

以下の方法によって求めたチオール基の導入量は、カタ
ラーゼ１分子に対して４分子であった。

チオール基の定量：チオール化カタラーゼ１ｍｌ　（５ｍｇ）にＤＴＮＢ　
１ｍｇを加えて１時間反応後、限外濾過によって、未反
応のＤＴＮＢ等の低分子化合物を除去した。

２ｍｌの蒸留水を加え、ジチオスレトール又は２−メル
カプトエタノールで還元し、５−メルカプト−２−二ト
ロ安息香酸を遊離させ、５０％　トリクロロ酢酸を０．
０５ｍ１加えて解舒後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、
５分間）により沈澱物を除去した。ＩＮ　ＮａＯＨでｐ
Ｈ８にした後、全量を５ｍｌとして４１２ｎｍの吸光度
より遊離した５−メルカプト−２−二トロ安息香酸の量
を求め、カタラーゼへのチオール基導入量を算出した。

（２）マレイミド化モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の
製造：モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体（免疫動物；マウス、
但し、実施例１（２）で用いたモノクローナル抗体とは
認識部位の異なるもの。）　１０ｍｇを０．０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）５．０ｍｌに溶解し、Ｎ−（’
ｙ−７レイミドブチロキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ
）０．５ｍｇをジオキサン０．５ｍｌに溶解して加えた
。

４°Ｃで２時間反応させた後、０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）　１０１００Ｏで透析（２時間）を２回
行ってマレイミド化モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体溶
液６ｍｌを得た。

以下の方法によρて求めたマレイミド基の導入量は、抗
体１分子に対して１０分子であった。

マレイミド基の定量：マレイミド化抗体０．５ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で全量を１ｍｌとした後、１３．４ｍＭ
のシスティン１０μＱ及び０．１Ｍ　ＥＤＴＡ溶液１０
μＱをを加え、窒素雰囲気下３７°Ｃで３０分間反応さ
せる。０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　１ｍｌ
を加えた後、０．６７ｍＭ　ＤＴＮＢ溶液０．２ｍｌを
加え、未反応のシスティンを、５−メルカプト−２−二
トロ安息香酸の４１２ｎｍの吸光度を測定することによ
って定量し、消費されたシスティンの量を求め、抗体１
分子当たりの消費されたシスティンの量から導入された
マレイミド基の量を求めた。

（３）カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体
の製造：上記チオール化カタラーゼ溶液２ｍｌ　（１０ｍｇ）と
マレイミド化モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体溶液３ｍ
ｌ　（５ｍｇ）とを窒素雰囲気下で混合し、４°Ｃで１
６時間反応させた。未反応のマレイミド基をブロックす
るためシスティン１ｍｇを加え、４°Ｃで３０分間反応
させた後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１０
００　ｍｌで透析（２時間）を行った。更に、未反応の
チオール基をブロックするためＮ−エチルマレイミド１
ｍｇを加え、４°Ｃで３０分間反応させた後、０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１０００　ｍｌで透析（
２時間）を行った。次いで、遠心分離（１２０００ｒｐ
ｍ、５分間）により、沈澱物を除去した後、高速液体カ
ラムクロマトグラフィー〔カラム；　５ｅｐｈａｄｅｘ
　Ｇ−３０００ＳＷ（東洋ソーダ社製）、溶出液；　０
．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　）に付し、最初
の画分を集めカタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦ
Ｐ抗体溶液１２ｍ１を得た。

製造例２カタラーゼ標識モノクローナル抗ｈＣＧ抗体の製造：製造例１のモノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の代わりに
モノクローナル抗ｈｃＧ抗体（免疫動物；マウス）を用
いる以外は製造例１と同様にしてカタラーゼ標識モノク
ローナル抗ｈＣＧ抗体溶液１２ｍ１を得た。

実施例１ヒトＡＦＰ測定用免疫センサーの作成：（１）フィブロ
イン水溶液の調製：生糸１００ｇを１．０重量％のマルセル石けん水溶液５
０００ｍｌ中に浸漬し、８０°Ｃで３時間精練した。水
洗後、更に０．５重量％のマルセル石けん水溶液５００
０ｍｌに浸漬して８０°Ｃで３時間精練し、セリシン等
を実質的に除去したフィブロイン原料７２ｇを得た。

水１００ｇとエチルアルコール８０ｇの入ったニーダ−
中に塩化カルシウム１５０ｇを溶解し、７５°Ｃに昇温
後、上記のフィブロイン原料７０ｇを投入、攪拌下に１
時間溶解した。次いで１８０ｇの温水（７５°Ｃ）を加
えて希釈混合した。フィブロインの溶解液を冷却した後
、ホローファイバー型の透析器を用いて、流水に対して
透析脱塩し、５．７重量％のフィブロイン水溶液１２０
０ｍ１を得た。塩化カルシウムの残留量は０．０８重量
％であった。

（２）モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体固定化フィブロ
インフィルムの製造：モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体（免疫動物；マウス）
を生理食塩液に溶解し、２５０μＱ／ｍｌの抗体溶液を
調製した。次にこの溶液を四方を仕切ったガラス板上に
抗体量が１０μｇ／ｃｍ２となるように流延し、１５°
Ｃで３時間乾燥した。上記フィブロイン水溶液にグリセ
リンをフィブロインに対して３０重量％になるように加
えた溶液をその上から流延し、２０°Ｃで１０時間乾燥
することによって皮膜化させ、次いで直径０．５ｃｍの
円形に裁断し、厚さ６０μｍの表記モノクローナル抗ヒ
トＡＦＰ抗体固定化フィブロインフィルムを得た。

（３）ヒトＡＦＰ測定用免疫センサーの作成：第１図に
示すように、反応セルに上記（２）で得られたモノクロ
ーナル抗ヒトＡＦＰ抗体固定化フィブロインフィルム、
酸素透過膜（ポリエチレン膜）、０−リング及びガルバ
ニ−型酸素電極（ＡＮ型、オリエンタル電気林製）を順
次装着してヒトＡＦＰ測定用免疫センサーを作成した。

実施例２ｈＣＧ測定用免疫センサーの作成：（１）ポリクローナル抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロイン
フィルムの製造（特開昭６０−１５５１２９号公報参照
）：ポリクローナル抗ｈＣＧ抗体（免疫動物；ヤギ）を生理
食塩液に溶解し、２５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製し
た。次にこの溶液を、四方を仕切ったガラス板上に抗体
量が１０μｇ／ｃｍ２となるように塗布し、２０°Ｃで
３時間乾燥した。次いで実施例１（１）と同様にして得
たフィブロイン水溶液を濃縮して１５．７重量％のフィ
ブロイン水溶液とし、更にグリセリンをフィブロインに
対して３０重量％になるように加えた溶液をその上から
流延し、２０°Ｃて８時間乾燥することによって皮膜化
させ、次いで直径０．７ｃｍの円形に裁断し、厚さ９０
ＩＵのポリクローナル抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロイン
フィルムを得た。

（２）　ｈＣＧ測定用免疫センサーの作成：（１）で得
られたポリクローナル抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロイン
フィルムを、実施例１（３）と同様にしてガルバニ−型
酸素電極（ＡＮ型、オリエンタル電気林製）に装着して
ｈＣＧ測定用免疫センサーを作成した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１．２で作成した免疫センサーの概略図
を表わす。第２図は試験例１．２で用いたフロー式の測定装置の概
略図を表わす。第３図は試験例１のヒト八ＦＰの標準曲線を表わし、第
４図は試験例２のｈＣＧの標準曲線を表わす。

Claims

【特許請求の範囲】

抗体を包括固定化したフィブロインフィルムを、酸素電
極に装着することを特徴とするエンザイムイムノアッセ
イ用の免疫センサー。