JPS60142259A - 固定化抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化抗体に関するものであり、より詳細には
フィブロインマトリックス中に抗体を包括固定化してな
る固定化抗体に関するものである。

ｋＡ原抗体反応の高い特異性、Ｉ８１根性を利用して検
体中に含まれる特定の抗原あるいは抗体を検ｉ１ｉ、同
定し、疾病等の診断あるいは治療に役１’／たせること
は占〈から行われている。特に近年、ランオイｔ１ノア
ッセイ、エンザイ１、イムノアッセイあるいは化学発光
免疫判定法なとの微品分析手法か実用化され、ト記の免
疫化学的特異反応に基づく側力“υ：の感度ならびに精
度が飛躍的に向Ｉ−するに至って、医療分野例えば臨床
検査における該測定法の有用性は益々高まって来ている
。

この免疫化学的測定法を実施するに当っては、７１ｉｌ
＋定精度あるいは操作の簡便性等の観点から、一般に測
定対象の抗原（あるいは抗体）に対応する抗体（あるい
は抗原）を予め適当な不溶性担体に固定化しておき、こ
の固定相に被検抗原（あるいは抗体）を反１４＼：させ
るいわゆる同相法が用いられており、固定化抗体はかか
る手法を抗原の１１１１１１定に適用する場合における
に記固定相として使用される。

また、このような免疫化学的測定法への応用とは別に、
固定化抗体は例えば抗原を分離・精製するためのアフィ
ニティクロマトグラフィーにおける固１′相としても有
用である。

しかして、固定化抗体としては、抗体の不溶性Ｊｌｊ体
への固定化様式の点から大別して、抗体をグルタルアル
デヒド、９化シアンなどを用いて担体に共有結合させる
化学結合法によるもの、抗体を物理的あるいはイオン的
な結合力によって担体に吸着固定化させる吸着ノノ二に
よるもの、および抗体を適当なｊ留分イマトリックス中
に包括固定化する包括法によるものの３つが代表的なも
のとして挙げられ、それらのうち前二者、なかでも吸着
法によるものは、臨床検査用試薬等として汎用され、既
に一定の評価を受けているが、これに対して包括法によ
るものは、吸着法あるいは化学結合法の場合に比べ、一
般に抗体の表面固定化ら１（固定化抗体の表面部に分布
する抗体の平ないしは活性。

抗原に対する結合能に関係する。）に劣るという難点が
あることに加え、従来公知の包括型置に化抗体には、以
トに述べる如きそれらに固イ１の問題点があって、末だ
実用化の域に達［７ていない。

即ち、包括法による同定化抗体としては、ポリアクリル
アミドおよび酢酸セルロースをそれぞれ包括用ポリマー
として用いたものが公知であるが〔クリニカル・ケミス
トリイ（Ｃ１ｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）第１８
巻、１３４１頁（１９７３イ［）；ジャーナルφ才ブ・
ンリットーフェイス・パイオケミヌトリイ（Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆ５ｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＢｉｏ−ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）第４巻、２５頁（１９７９年）参照〕、前渚の
ポリアクリルアミドの場合は、その特性ト免疫化学的反
応に基づかないいわゆる非特異的な蛋白吸着が生じ易い
という難点があるばかりでなく、ゲル状物であるため機
械的強度に劣り該非特異的吸着物を十分洗浄除去するこ
とも困難であって、それら吸着物に起因する定４１４′
阻害ないしは分離阻害が甚だしく、実際−１−かかるも
のを免疫化学的測定あるいはアフィニティクロマトグラ
フィーに適用することは困難である。−ノｊ、後渚の酢
酸セルロースの場合は、該本村が水に不溶性であるので
、これをアセトン、テトラハイドロフランなどの有機溶
媒に溶解して使用するが、一般に水溶性である抗体はそ
れら有機溶媒溶液への分散が不良であるため、この方法
では均質な固定化抗体は得難く、また表面固定化ｊ−も
一層低ドする傾向にある。

かかる状況下にあって本発明者らは、包括法によって実
用に供し得る固定化抗体を調製することの１１［面性に
つき鋭ズｆ、４’ｉ！ａ’ｌを行った結果、包括１）１
ポリマーとしてフィブロインを用いて得られる固定化抗
体が高い表面固定化１６を有し、しかも非特異的吸ノｊ
による定ｊ３阻害、分離阻害も少なく、免疫化学的Ａｌ
ｌ＋定等に適用して実用１−十分満足１．得る高いＡ１
１１定感度・精度ないしは分離能を惧えることを知り、
本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、抗体がフィブロインマトリックス中に
包括固定化されていることを特徴とする固定化抗体であ
る。

以下、本発明の実施１ハ；様について詳細に説明する。

本発明の固定化抗体は、フィブロイン水溶液に抗体を溶
解（あるいは場合によっては分散）させ、この水溶俺か
らフィブロインを抗体と共に凝固不溶化（マ１リンク東
形成）させて、フィルム状、粉末状等とすることによっ
て製造ネれる。また、マＩ・リックス形成を何らかの基
体１〕で行わしめ、該基体と一体となった形態としても
よく、かかるものも本発明に包含される。

フィブロイン水溶液としては、生糸、絹紡糸、ノー１糸
屑、キキ、ビス、〈ずまゆ、ブーレント等の絹あるいは
絹原料から常法に従ってセリシンを除去して得られる実
質的にフィブロインのみからなる繊維を、５ｋｌ−アン
モニア水溶液、水酸化銅−エチレンシアミン水溶液、ロ
タン酸塩水溶液、臭化リチウト水溶液、塩化カルシウム
水溶液、硝酸カルシウム水溶液、硝酸マグネシウム水＃
液などに１１’／ＭＬ、次いでこの溶液を透析法等によ
って脱塩１７たものか好適に使用される。

ノイブロイン水溶液の濃度は、一般に２〜２０東１１％
の範囲であり、好ましくは５〜１５重量％の範囲である
。この場合、固定化抗体の形態を−Ｉ―記のノ１（体と
一体となった形とするのであれば、該濃度はさらに低く
てもよく、通常０１〜５屯ｈｉ＝％程度のものが使用さ
れる。

フィブロイン水溶液に溶解（あるいは場合によっては分
１１ｔ）せしめるｂ’ｌ；体のＲ＞、即ちフィブロイン
？トリックス中に包括固定化する抗体の蔭は、固定化抗
体の使用目的あるいは抗体の種類等によって異なり一概
には云えないが、一般にはフィブロイン（固形分）に対
して０．１〜４０重量％、Ｉｌｆましくは０．５〜３０
屯品％、特に好ましくは１〜２０重量％の範囲であり、
かかる範囲から使用１」的等に応じ適宜のものが選択さ
れる。なお、この場合前記の基体と一体となった形態の
固定化抗体とするのであれば、必要に応じて抗体のフィ
ブロインに対する使用比をト、記の範囲より大とする（
例えば１００重品％程度まで増大せしめる）ことがｉｉ
ｆ能であり、これによってより高い表面固定化４ｉ１゛
をボす固定化抗体を得ることができる。

未発Ｑ＋４で用いる抗体としては特に限定はなく、固定
化抗体の使用１」的等に応じて多様なものが選択できる
。免疫動物もマウス、ラント、ウサギ、ヒツジ、ヤキ、
ヒＩ−等のいずれであってもよい。

ただ、・競には、細胞融合法によって得られるモノクロ
ーナル抗体であることが好ましく、かかる抗体を使用す
ることにより、固′Ａ！化抗体の感Ｉｒｅ、精度ないし
は分離能を一層向卜せしめることができる。

ここで、抗体の具体例を挙げると、例えは以下のような
ものがあるが、勿論これらに限定されるわけではない。

１、インシュリン、絨毛性ゴナＦトロヒン、ＩＭ＋盤性
うクトゲン、黄体形成ホルモンなどのホルモンに対する
抗体。

２、イムノグロブリンＧ（以−ト、イムノグロブリンを
Ｉｇで表わす）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、α−フェ）
・プロティン、ハプトグロビンなどの血清蛋白に対する
抗体。

３、大腸菌毒素、コレラトキシン、肝炎ウィルス、風疹
ウィルス、インフルエンザウィルス客のｌＩｉ素あるい
はウィルスに対する抗体。

４、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロ
ン、フェニトイン、プロ力インアミト、カナマイシン、
ペニシリン、バルビッール酸等のハプテンに対する抗体
。

これらの抗体を含むフィブロイン水溶液からフィブロイ
ンを凝固不溶化（マトリックス形成）せしめて本発明の
固定化抗体を得る方法としては、該溶液を風乾、加温乾
燥、噴霧乾燥など適宜の手段によって乾燥する方法、あ
るいは該溶液を、硫酸アンモニウム水溶液、酢酸ナトリ
ウム水溶液、硫酸ナトリウム水溶液などの塩類溶液もし
くはメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルア
ルコール、アセトン富の水混和性有機溶媒と混合または
接触せしめてフィブロインを凝固析出せしめる方法が好
適に使用される。また、場合によっては超音波処理、ズ
リ変形処理（例えば激しい攪拌など）を用いることもで
きる。

これら凝固不溶化処理によって、一般にフィブロインは
後に定義する結晶化度で約３０％以１−１通常は約３０
％以上のイ１＾を示す結晶性の耐水性マトリックスを形
成する。ただ乾燥１人を用いた場合のみは、条件によっ
てはフィブロインが無定形ないし低結晶性の凝固物を形
成して十分な耐水性を示さなくなることがあるので、１
−記の結晶化度（約３０％以上）を満足するような条件
、具体的には湿１對６０％以りの雰囲気ドに室温〜４０
’（３で乾燥を行うことが肝要である。また、乾燥法に
おける結晶化不充分を補うために、フィブロイン水溶液
に、予めエチルアルコール、エチレンクリコール、グリ
セリンなどのアルコール類、あるいは硫酸ナトリウム、
塩化マグネシウム、硫酸アンモニウム象の凝固性１１３
を添加したトで乾燥を行うのも好ましい方法であり、か
くすることにより、１．記の温湿度調整を伺ら黄するこ
となく、例えば中なる風乾あるいは通風乾燥によって、
さらにはまた凍結乾燥のような低温度下に於てすら、」
−記の結晶化度をｇ４Ｍするフィブロインマトリックス
を形成せしめることができる。特に、グリセリンなどの
多価アルコール類を用いた場合には、これによってフィ
ブロインに望ましい＋１［塑性が伺す−され、機械的物
性のより良好な固定化抗体が得られるとの利点もあって
一層好ましい。

これらの添加物を用いる場合、その添加星はアルコール
類であれば、フィブロイン（固形分）に勾して２〜５０
重品％、ｂｆましくはｌＯ〜４０セ早％の範囲であり、
また凝固性塩であれば同じく２〜２０弔ｌ、（％、Ｉｆ
ましくは５〜１０屯ｔ；％の範囲である。

こねら添加物は、乾燥絆ｒ後必要ならば水洗除去される
。

・力、フィブロインの凝固不溶化法として、フィブロン
水溶液を塩類溶液または水混和性有機溶媒と混和もしく
は接触させてフィブロインを析出凝固せしめる方法（以
トこれを析出法という）を用いる場合には、前記した通
りフィブロインの結晶化度は自ずと２０％を越え、一般
に結晶化度が２５〜４０％の好ましい耐水性を示すフィ
ブロインマトリックスか形成される。

この方法で用いる塩類溶液の濃度は、−１１Ｑに１５〜
５０＋ｌ’を都％の範囲であり、また水混和性有機溶媒
であれば、前記した如き溶媒を単独であるいは５０％程
度までの水を含む水混和物として使用する。

これ」う１オフイブロイン木溶液に対して、フィブロイ
ン＋Ｖ固イＪ［出せしめるにＩ・分なＩＩｆだけ用いら
れる。

本発明の固定化抗体の形状としては、その使用目的等に
応して、フィルム状、粉末状、顆粒状、繊Ｍｔ状等適宜
のものが選択されるが１本発明に於てはＩ−記の如く包
括用ポリマーのフィブロインが乾燥、１月枡などの簡便
かつ温和な操作を施すだけで凝固不溶化することから、
それら任意の形状とすることが容易である。

例えば、免疫化学的測定法に用いる場合には、反応液か
らの分離あるいは洗浄等の操作の簡便さ、容易さの点か
らフィルム状であることか好ま１、＜、このフィルム状
の固定化抗体は、例えばガラス板、テフロン板、アクリ
ル板等の平板りに、抗体（および々ｒましくはさらにフ
ィブロインの結晶化を促進するためのアルコール類ある
いは髪ＩＭ用してフィブロンを凝固不溶化した後ここに
生成するフィルムを１１７：板から剥離することによっ
て容易に製造することかできる。

他方、抗原を分離精製するためのアフィニティクロマト
グラフイーにおける固定相として用いる場合には、カラ
ム容積当りの抗体品を多くし、また液との接触効率を上
げるため、粉末状ないしｉ〔１粒状、あるいは繊維状の
形態が好ましい。粉末状ないし顆粒状の固定化抗体は、
抗体−フィブロイン混合溶液から析出法によって抗体含
有フィブロインを凝固析出させ、これを分取、乾燥し、
さらに必要ならば粉砕することによって得られる。また
、繊維状の固定化抗体は、抗体−フィブロイン混合溶液
を適当なノズルを用いて凝固浴、例えば析出法で用いる
のと同様の塩類溶液中に紡出して凝固せしめ、必要に応
じてさらに延伸処理等を施すことによって製造される。

さらに、本発明の固定化抗体は、前記した通りフィブロ
インマトリックスを何らかの基体トに形成せしめ、該）
、（体と一体となった形１ルのものとすることもできる
。

かかる同定化抗体は、例えば適当な基体にフィブロイン
−抗体混合溶液をコーティングし、前記の乾燥法、析出
法等を適用してフィブロインを凝固不溶化（マトリック
ス形成）せしめる方Ｊノーによって′！１８！造できる
。基体としては、例えばカラス、ポリスチレン、ポリ塩
化ビニル、ポリエチレン、ポリエステル、ポリメタクリ
ル酩メチル等からなる成型物（フィルム、シート、平板
、ビーズ、ポール、ロッドなど）が挙げられる。才だ、
未反応抗原、非特異的吸着物などの洗浄除去が可能な範
囲内であれば、比表面積の大きな多孔質体を基体として
用いるのも抗体の表面固定化量の観点からは好ましく、
かかるものとしては、例えば多孔性シリカ、多孔性メタ
ケイ酸アルミン酸マグネジウドなどの無機多孔質体、１
−記のポリマー成型物の表面粗面化処理物、あるいは不
織布、濾紙などの繊維集合体等がある。

これらノ、（体と一体となった形態の固定化抗体とする
場合、フィブロインマトリックスの機械的強度は、該マ
トリックスを中独で用いる場合はどには委求されないの
で、ブトリンクス層の厚みあるいは抗体に対するフィブ
ロインの使用比等を低減せしめることがｉｉ）能であり
、そのためフィブロインマトリックスの表面部に分１４
４する抗体のｊ、１あるいは比率か増し、抗体の表面固
定化量がより増大するという利点かある。従って、かか
る基体と一体化された形１，１；からなる固定化抗体は
、本発明の実施！Ｅ、様中最もＩｆましいものの一つと
いうことができる。

以下、本発明の固定化抗体の特長ないし利点ついて述へ
る。

ます、本発明の固定化抗体は、包括用ポリマーと１７で
フィブロインを用いたことによって他のポリマーを用い
た場合に比べ虞かに高い表面固定化ｊ−を示す（試験例
１参照）。これは、フィブロインが＋ｉｉｉ記した如く
極く温和な条件で凝固不溶化するため、包括時に抗体の
変性、失活が殆んど生しないということによるほか、さ
らにフィブロンの特性にノ１（づく該マドす、ラス中で
の抗体の分子ｌｊの問題等種々の要因が関与しているも
のと思われる。ただいずれにせよ、高い表面固定化ｒ１
１を実現し得たことは、抗原の免疫化学的測定あるいは
分＃精製、特に微１−の抗原や抗体との親和力の弱い抗
原の測定、分離に際し、＋１！ｌｌｌ’ｉｆ′感度・精
度ない１゜は分離効率を高め得るという意味で有利であ
り、次に述べる非特異的吸着に基づく定１ｖｊ−１！１
４害、分離ｔｉ１１害か少ないことと相俟って、本発明
の固定化抗体によれば、微量の抗原の定性、分離精製に
も適１１し１丁能な高感度、高精度を達することができ
る（例えば試験例３参照）。

本発明の固定化抗体の第二の、そして重要な特長の・つ
は、検液中の夾雑蛋白とかあるいは免疫反応検出のため
の標識抗体などを非特異的に吸着することが少なく、か
つまたこれを有効に抑１１＝、Ｌイ１するということで
ある。Ｊ１特異的吸着が生じ易いと、例えば抗原の免疫
化学的１１１１１１定に関して云えは、プランクイ＋ｔ
ｉが火となって測定感度が低下したり、あるいは反応温
；■、時間をある程度厳密に管埋しないと４１１１定値
の再現性に乏しくなるなど種々の難点ないし制約を生ず
ることとなるが、本発明の固定化抗体の場合には、包括
用ポリマーとして用いたフィブロインの特性（本発明名
等の実験の結果によれば、フィブロインはポリスチレン
、テフロン等の１７３〜１／４の蛋白吸着Ｈ４Ｈ，Ｌか
示さない、）によるものと思われるが、もともと非特異
的吸着を生し難いということに加えて、若干生し得る非
特異的吸着についても、血清アルブミン等を用いる通常
の吸着防１１−（プロ、ツキ、ング）処理によってこれ
を容易に抑１１−できることは勿論のこと、４１ＩＡ′
ｌ（すべきこととして、その際のプロ・ンキンク効果が
他のポリマーの場合とは異なり極めて高濃度の被吸着物
（例えば酵素標識抗体）の存在下でも殆んど損われるこ
とがないという特長があり（試験例１あるいは試験例３
参照）、かくして本発明の固定化抗体によれば、前記し
た如き非特異的吸着に基づく定Ｉ−阻害等を実際」−何
ら心配することなく、しかも高濃度標識物溶液の使用が
可能となったことから高い測定感度・精度を以て測定を
行うことかできる。

また、この高濃度標識物溶液の使用がｒｆ［能となった
ことは、免疫化学的測定におけるイ（川な測定ｒ法の−
・つである−・段サンドイッチ法（Ｓｉｍｕｌｔ−ａｎ
ｅｏｕｓＳａｎｄｗｉｃｈＡＳｓａｙ）を実施する際に
も大変有利であり、例えば被検抗原のイ・想される最高
濃度にも十分対応し得る高濃度の標識物溶液を検出試薬
として用いることにより、仮りに被検抗原の濃度が大幅
に変動するようなことかあったとしても、従来のように
試薬濃度が足りないために検液の稀釈、再４１す定等が
必要となるといったような面倒がなく、これに対処する
ことができる。

なお、以トに述べた非特異的吸着が少ないことは、アフ
ィニティクロマトグラフィーの１−３１定相として用い
る場合にも、分離効率の向上と精製の容易さに役立つこ
とは云うまでもない。

本発明の国定化抗体のさらに他の特長として、包括用ポ
リマーのフィブロインが、凝固不溶化に際して、機械的
強度にすぐれたマトリックスを形成し、抗体を強固に包
括ないし固着することから、その抗体固定化強度が良好
であるということを挙げることができる。この結果、例
えば吸着法によるもののように、抗体固定化強度が弱く
抗体が１（−１体かＩ−１＋遊離、脱落し易いために使
用条件（ｐＨ、イオン強度等）がある程度限定されたり
、あるいは取扱いに細心の注意を要するなどの制約を受
けるようなことがない。また、この抗体固定化強度にす
ぐれるとの点は、本発明の固定化抗体の場合に非特異的
吸着物による定柚阻害等が少ないということにも寄怪し
ており、前記の如く本発明の固定化抗体の場合、もとも
と非特異的吸着が生し難くかつ有効なプロンキングが可
能であるとの特長をイ１するＩ−に、たとえ若干の吸着
物が生じたとしても、固定化された抗体の脱落を何ら心
配することなく該吸着物を強い条件ドに洗詐除去するこ
とが可能であるので定￥阻害等は最小限度にまで抑止さ
れる。そしてこれらの利点を煩雑な化学的結合法によら
ずして達し得ることは、実際面からみて極めてイ１用で
ある。

さらに、本発明の固定化抗体は保存安定性にもすぐれて
おり１例えば吸着法による固定化抗体が、４５°Ｃ×６
５％ＲＨの条件ド３）ｒ月の保存で大１１」な活性低ド
を来すのに対して、本発明の固定化抗体は同様の条件ド
に６ケ月保存しても殆んど活性低小を来さない（試験例
４参照）。

本発明の固定化抗体を免疫学的１１１１１定法に基づく
抗原の足れ（に適用する場合、Ｊｌｌｌ定Ｖ：としては
、競争反応法、サンＩＳイッチ法等によるラジオイムノ
アッセイあるいはエンザイムイムノアッセイなど通常用
いられる方法のいずれもが使用可能である。また、アフ
ィニティクロマトグラフィーの固定相として用いる場合
にも、少くとも抗体の失活か生じない範囲内であれば、
ｐＨ、イオン強度等の使用条件に特に制限はない。

これらの用途への適用に際して、本発明の固定化抗体は
必要ならば吸着型固定化抗体等で通常用いられている方
法、例えば０．５％牛血清アルブミン生理食■Ａ１水溶
液を用いる方法等によって予めブロッキング処理される
。ただ、例えば免疫化学的測定の場合であれば、一般に
免疫反応検出試薬として用いる標識抗体溶液中に該抗体
の安定化剤として添加されている血清蛋白によって、ま
た免疫化学的測定、アフィニティクロマトグラフィーの
いずれの場合も検体が血清である時には該血清由来の蛋
白によって、それぞれブロッキングは実際１−はぼ完全
と看做し得る程度にまで進行するので、かかる場合には
り）前のプロンキング処理は必ずし≠）必要ではない。

しかしそのような場合にも、勿論車前のプロンキング処
理を行うことは伺ら差１２支えなく、またこれによって
しばしばよりＩＩ（ましい結果が４■）られる。

以１・に、製造例、実施例および試験例を挙げて、本発
明をさらに具体的に説明する。

なお、以下の説明に於て、濃度に関する限り％はすべて
重量％を意味する。また、本明細書に於て、結晶化度と
は次の如く測定され、かつ定義されるものである。

結晶化度を測定しようとするフィブロインフィルム（被
検フィルム）と、対照として４℃×５５％ＲＨの条件で
フィブロイン水溶液から乾燥成膜化した略々無定形のフ
ィブロインフィルム（対照フィルム）にそれぞり、、Ｃ
ｕＫα線を照射し赤道方向の回折強度を記録してｆｌｆ
られるＸ線広角回折チャート（第１図）に於て、２０＝
＋５°と３０°の強度を直線で結ひ、この直線と被検フ
ィルムの回折強度曲線（ａ）とで囲まれた部分の面積を
Ａ、また１−記直線と対照フィルムの回折強度曲線（ｂ
）とで囲まれた部分の面積をＢとすると、結晶化度（％
）は次式で表わされる。

結晶化度（％）−Ｎ：ＢＸ１００ なお、１−記に於てはフィルムを例にとって説明を１１
つだが、粉末状あるいは顆粒状など他の形態のフィブロ
インの結晶化度も上記に準じて測定される。

製造例１．フィブロイン水溶液の調製 生糸１００ｇを１．０％のマルセル石けん水溶液５交中
に浸漬し、８０°Ｃで３時間精練した後、０．５％のマ
ルセル石けん水溶液３文中同温度でさらに３時間精練を
行い、次いで水洗、乾燥して、セリシン等が除去され′
実質的にフィブロインのみよりなる＃ｈ都７１ｇを得た
。

別に、水７５ｇとエチルアルコール８０ｇをニーグーに
入れ、これに塩化カルシウムｌｏｏｇを添加して混和・
溶解し、この溶液を７５°Ｃに昇温した後、１−記のフ
ィブロイン繊維５０ｇを投入し、１時間攪拌溶解した。

ここで得られたフィブロイン溶解液を、７５°Ｃの温水
１５０ｇで稀釈し、室温まで放冷した後、ホロファイバ
ー型の透析器を用いて流水に対して透析１１免Ｉｔ、！
Ｌ、、濃度５．５％のフィブロイン水溶液８３０ｍ、Ｑ
をｔＩＩた。この水溶液の塩化カルシラｌ、の残＋ＶＩ
’ｉ″−は０．０８％であった。

以トーの試験例１および各実施例に於ては、この製造例
１によりあるいはそれと同様にして得られた５、５％フ
ィブロイン水溶液（またはその稀釈液もしぐは濃縮液）
を用いてそれぞれフィブロインフィルムおよび固定化抗
体を製造］７た。

試験例１．フィブロインによる蛋白（ｆ？’素標識抗体
）の非特異的吸着 （１）供試試料 （イ）フィブロインフィルム ５．５％フィブロイン水溶液を濃縮して得られた１３．
５％フィブロイン水溶液１００＝’［ｉ一部にグリセリ
ン４重騎部を混合した液をアクリル板ヒに流延し、２２
℃で風乾して厚さ１２０ｐｌのフィブロインフィルムを
得た。このフィブロンフィルトについて前述の方法（但
し、理学を機輛製Ｇｅ１ｇｅｒＦｌｅｗ２０２７使用。

ＣｕＫａａ４０ＫＶ、２０ｍＡ、以下の各実施例に於て
も同様）によりその結晶化度をめたところ３７％であっ
た。ここで得られたフィブロインフィルムを、０５％生
血清アルブミンノを理食塩水溶１合中に２２°Ｃで６０
分間浸漬してブロッキングを行った後試験に供した。

（ロ）酵素標識抗体 モノクローナル抗ヒトα−フェトフロティン抗体（免疫
動物：マウス）の西洋ワサビペルオキシターゼ標識物（
酵素標識は、ジャーナル−オプーヒストケミストリー・
エンド壷すイトケミヌトリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＲｉ
ｓｔｏｃｈｅ−ｍＩｓｔｒｙａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）第２２巻、１０８４頁（，１９７４年）に記
載の方法に準じて過ヨウ素耐酸化法により行った。以下
の各実施例５試験例に於ても同様〕 （２）試験方法 ヒト血清１０％を含む０．１％牛血清アルブミン生理食
塩水溶液に、酵素標識抗体を、０．０．０４８．０．２
４．１．２、８．０、マタハ３０＃Ｌｇ／ｄノ濃度とな
るように溶解した溶液のそれぞれ０．５ｄを、内ｆＭ８
ｍｍのガラス試験管に入れ、これに１ｃｍＸＯ，５ｃｍ
の大きさに裁１断したフィブロインフィルムを１枚ずつ
浸漬し、２２°Ｃで２時間静置した。

次に溶液を吸引除去し、０．１％牛血１＾アルブミン生
理食塩水溶液ｌ−を入れ、十分振り混ぜた後、これを再
び吸引除去した。この操作を４回繰り返した後、フィル
ムをイオン交換水で３回洗節し、別に準備した内径１５
ｍｍのガラス試験管に入れた。

次いでこの試験管に、０−フェこレンジアミンと過酸化
水素をそれぞれ］Ｂ、７ｍＭおよび２．４５ｍ片の濃度
で含むクエン酸緩衝液（クエン酸−リン酸ニナ）・リウ
ム、ｐＨ５，５）１ｍＵを入れ、２２℃で１１１’１所
に１時間静置して酵素反応を行わしめた後、１規定硫酸
１ｍ９を加えて反応を停止１−させた。この反応液につ
いて４９２ｎｍにおける吸光度Ａｔ＋ｓ４９２（フィル
ムの酵素活性、従って酵素標識抗体の非特異吸着着品を
反映するイヒ（）を測定した（ｎ＝３）。

（３）結果 結果を第１表に示した。

第１表 ］１表に於て、標識抗体濃度０．０４８ｇ／ｍＱは、通
常の吸着型固定化抗体な用いた免疫化学的測定に於て一
般的に採用されている標識抗体の濃度に相当するもので
あるが、ブイプロインの場合、該濃度域からその数百倍
以りに及ぶ高濃度域に至るまで特に箸しい吸光度（Ａｂ
ｓ４９２）の増加は認められず、また後に述べる試験例
３の結果とも考え併せれば、高濃度域、例えば３０戸ｇ
／ｍ９、における吸光度（Ａｂｓ４９２）もＡ１１ｌ定
感度に何らの影響も及ぼ５ない程の僅少なものであるこ
とか明らかであって、非特異吸着Ｒがノドじ難い（ない
しはその抑１１−が有効に行われている）ことがわかる
。

なお比較のため、吸着型固定化抗体の押体として汎用さ
れているポリスチレン（粗面加［−をした直径６．３５
ｆｆ１ｍのポールを０．５％牛血清アルブミン牛理食１
４４水溶液でブロッキングしたものを使用）について、
Ｉ記と同様の吸着試験を行った結果では、標識抗体濃度
１．２ｇｇ／−以１゜で著しい吸光１＆（Ａｂｓ４９２
）の増加がみられ、６および３０戸ｇ／ｍ！ｌにおける
イｊ／ｉはそれぞれ０．１２１および０．４９６にも達
することが明らかとなった。

実施例１゜ モノクローナル抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体（免
疫動物：マウス。以下、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを
ｈｃｃと表記する）１００ｍｇ、５．５％フィブロイン
水溶液９．１ｇおよびグリセリン１７５ｍｇを充分混合
し、この混合液をガラス板上に流延し、１５°Ｃで１５
時間風乾して皮膜化した。

ここで世られたモノクローナル抗ｈＣＧ抗体固定化フィ
ブロインフィルムは、厚さ４０戸の柔軟性に富むフィル
ムであり、その結晶化度は３７％であった。

この実施例１の本発明固定化抗体を用いて以下の各試験
を行った。

試験例２．表面固定化部の１１１１１定（１）供試試料 実施例１の本発明固定化抗体および北較のため調製した
以下の比較例１〜３の固定化抗体。

〔比較例１〕 実施例１で１０いたのと同様のモノクローナル抗ｈｃｃ
抗体を２０ｍｇ／ｎｃＱの濃度で含む生理食塩水溶液５
ｌＩＤと濃度５％の酢酸セルローステトラハイドロフラ
ン溶液１０ｇとを混合した。

この１１４合液をアクリル板上に流延し、１５°ＣでＩ
５Ｉｔ！？１ｌｉｌ風乾し皮膜化して、モノクローナル
抗ｈｃＧ抗体を含む酢酸セルロースフィルム（厚さ４５
戸）を得た。

〔比較例２〕 比較例１と全く同様のモノクローナル抗ｈＣＧ抗体生理
食塩水溶液５−と５％ポリビニルアルコール水溶液１０
ｇとを混合した。

この１１シ合液をアクリル板■二に流延１２．１５°Ｃ
で１５時間風乾して皮膜化し、さらに２００°Ｃで５分
間熱処理を行ってモノクローナル抗ｈＣＧ＋ｉε体を含
むポリビニルアルコールフィルム（厚さ５５戸）を得た
６ なお、」−記の１５°Ｃでの乾燥を行った直後のフィル
ムは、水（約２５°Ｃ）浸漬時速やかに溶解し、全く耐
水性を示さなかった。

（比較例３〕 アクリルアミド１．８ｇおよびＮ、Ｎ′−メチレンビス
アクリルアミド０．２ｇを水８−に溶解した溶液に、実
施例１で用いたのと同様のモノクローナル抗ｈｃＧ抗体
４００ｍｇを加えて溶解し、次いで過硫酸カリウム４ｍ
ｇと亜硫酸水素ナトリウム２ＩＩ１ｇとを含む水溶液１
ｇを話加混合した後、この４４合液をアクリル板にに流
延したところ、約１０分後に爪台が始まりゲル化した。

これをそのまま−・晩装置してゲル状の固定化抗体（厚
さ０．２５ｍｍ）を得た。

（２）試験方法 試料をＩＣ…Ｘ０．５ｃｍの大きさに裁断し、生理食塩
水で洗浄した後、この試料片の１枚宛を、抗マウスＩｇ
Ｇ抗体（マウスのＩｇＧで免疫した家兎の血清よりＩｇ
Ｇ画分として精製したコンベンショナル抗体）の西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識物を５０μｇ／−の濃度で含
む０．１％牛而面アルフミ７／−１−理食塩水ＡｕＱ中
に浸漬し、４°Ｃで２４１＋！ｒ間反応させた（ｎ＝４
）。次いで、この試料）１を７１−即食塩水で充分洗浄
して未反応の抗マウスＩｇＧ抗体−ペルオキシターゼ桧
識物を除去した後、ノ、（質としてＯ−フェニレンジア
ミンと過酸化水素とをそれぞれ１ｆｉ、７ｍＭおよび２
．４５ｍＭの濃度で含むクエン酸緩衝液（クエン醇−リ
ン酪二ナトリウム混合液、ｐ）１５．５）４−中に入れ
て２５°Ｃで５分間酵素反応を行わしめ、３．４規定の
硫酸２−を加えて反応を停止させた。この反応液につい
て４９２ｒ＋ｍにおける吸光度を測定し、該吸光度と別
に作成した検に線とから試料に結合したベルオキシダー
セ品をめ、この酵素１１をさらに抗体−品に換算した。

（３）試験結果 結果を第２表に示した。

第２表 （，１Ｆ）ペルオキシダーゼ標識物の非特異的吸着によ
るデーターのバラツキが大きく、信頼性のあるイ１ａは
得られなかった。

第２表の結果から明らかな通り、フィブロインを包括用
ポリマーとして用いる本発明の固定化＋７＋体は、他種
ポリマーによって包括固定化したものに比べて表面固定
化量が火であって、免疫化学的測定あるいはアフィニテ
ィクロマトグラフィーに適用した場合、高いＪｌｌｌｌ
ｌｌ定精度あるいは分副効率を達することが可能である
。

なお、第２表に於ける表面固定化量は、抗マウスＩｇＧ
抗体（免疫動物：ウサギ）に対する固定化抗体の結合能
からめたものであるが、該ｈｍとｈｃＧそれ自体に対す
る固定化抗体の結合能とが良い相関を示すことは別に行
った実験によって確かめられた。

試験例３感度の７１１１定 （１）イＪ）試試料 実施例１の本発明固定化抗体 （２）試験方法 試料をｌｃｍＸＯ，５ｃｍの大きさに裁断し、この試料
片を、ｈｃａをＯ〜１０００ｍｌＵ／ｍｆｌの範囲の種
々の濃度で含有する０、１％牛血清アルブミン生理食ｆ
ｉｉ水溶液のそれぞれ０５−中に１枚宛浸漬しく但し、
同一濃度についてｎ＝５）、２５℃で１時間反応せしめ
た。次いで、各試料片を生理食塩水で充分に洗浄して未
結合のｈＣＧを除去した後、抗ｈｃｃ抗体（ｈＧＧで免
疫した家兎の血清よりＩｇＧ画分として精製したコンベ
ンショナル抗体）の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識物
を１０μｇ／−の濃度で含有する０、１％牛血清アルブ
ミン生理食塩水溶液０．５蔽中に浸漬し、２５°Ｃで１
時間反応後、未結合のペルオキシダーゼ標識物を生理食
塩水で洗浄除去した。

この試料片について、試験例２と同様の酵素反応を行い
、反応液の４９２ｎｍにおける吸光度をＡｌ１定した。

（３）試験結果 被検液のｈＣＧ濃度（ｍＩＵ／ｍｕ）と吸光度（Ａｂｓ
４９２）との関係を第２図に示した。

第２図の結果から１本発明の実施例１の固定化抗体の場
合、ｈＣＧ１Ｍ度１０ｍ１ｌＪ／ｍＱにおいて吸光度は
平均０．１０５になる値を示し、ブランク（ｈｃＧ濃度
Ｏｍ１ｌＪ／Ｊ）の吸光ＩＩ（平均０．０５４）との間
に８８％の信頼限界で有意差が認められ、ｈｃＧの最小
検出濃度（感度）が１０ｍｌυ／ｄもしくほそれより低
連１ル域にあることがわかる。

ｈｃｃの１１１１１定感度については、通常の妊娠診断
に対しては１０００ｍｌＵ／Ｊ＃度が、また早期妊娠診
断には１０ｍｌＵ／Ｊ程度がそれぞれ必要と云われてい
るが、本発明の実施例１の固定化抗体は、前者は勿論の
こと後者のＶ期妊娠診断にも使用可能である。

なお、１１１１記試験例２で用いたポリビニルアルコー
ルを包括用ポリマーとする固定化抗体（比較例２）につ
いて同様に測沖′）み度を調べた結果では、該固Ｗ化抗
体はＩｐ期妊娠１珍断には到底適用困難な低い感度しか
示さなかった。

試験例４保イｒ安定性試験 （１）供試試料 実施例１の本発明固定化抗体（ｌｃｍＸＯ，５ｃｍの大
きさに裁断して使用）および比較のため調製１７た下記
の比較例４（吸着法）の固定化抗体。

〔比較例４〕 ポリ１スス化ビニルフイルム（厚さ１２０戸）を１ｃｍ
Ｘｏ、５ｃｍに裁断し、天施例１で用いたのと同様のモ
ノクローナル抗ｈＣＧ抗体をＩＯｕｇ／ｍ９の濃度で含
む生理食塩水溶液２殿中に浸漬し、４°Ｃで２４時間放
置して抗体を吸着させた後、未吸着の抗体を生理食塩水
で洗浄除去して吸着型の固定化抗体を得た。

（２）試験方法 試料を４°Ｃ×６５％Ｒ）ｌまたは４５°Ｃ×８５％Ｒ
Ｈ（７）雰囲気中に放置し、経時的にサンプリングして
、表面固定化７−の変化と、濃度１００ｍ１Ｕ／−の標
準ｈＣＧ溶液（０，１％牛血清アルブミンイ１．理食塩
水溶液）の８度測定における吸光度（見則けのｈｃＧ濃
度測定イぽ１に相当）の変化を追跡した。

表面固定化量および吸光度（Ａｂｓ４９２）の７１１１
１定は、それぞれ試験例２および試験例３と同様にして
行った。

（３）試験結果 結果を第３表に示した。

１−表から明らかな通り、吸着法による固定化抗体（比
較例４）は、４５°ｃ×３ケ月の保存で活性が急減し、
４°Ｃにおいてさえ６ケ月後には大ＩＩな活性低下を来
すが、−・力木発明のＩＩ、ｌ定化抗体（実施例１）は
、４５°Ｃで６ケ月経過後も初期の活性を保持しており
、保存安定性に極めてずくれている。

試験例５抗体固定化強度 実施例１の固定化抗体をｌｃｍＸＯ，５ｃｍに裁断し、
この試料片をｐＨ５，３、６，８、および８１の３種の
０．２Ｍリン酸緩衝液のそれぞれ５蔽中に１枚ずつ浸漬
し２５°Ｃで２４時間振盪した後、試験例２と同様にし
て表面固定化量を測定し、浸漬前の蛸と比較したところ
、いずれのｐＨの場合も表面固定化ｊ−の減少は認めら
れず、本発明の内定化抗体が、通常の免疫学的測定ある
いはアフィニティクロマトグラフィーの条件下では抗体
のＭＲ１脱落等の惧れのないすぐれた抗体固定化強度を
有することが確認された。

また、実施例１のＷ定化抗体を、荷ＮＴＣｉＫｇ／ｄで
畝紙間で３回擦過した後表面固定化量を測定したところ
、擦過による該数イ１１′１の低下（抗体の脱落）は殆
んど認められなかった。なお、前記の試験例４で調製し
た比較例４の固定化抗体（吸着型固定化抗体）について
、−上記と同様の試験を行ったところ、疲紙間での擦過
によって吸着抗体の８０％以Ｉ−が脱落してしまい、ま
た緩衝液中での振關試験でもかなりの脱落が認められ、
特にｐｏｅ、ｓおよび８，１ではいずれも２５％以１−
の抗体が脱落した。

実施例２ ５５％フィブロイン水溶液を水で桃釈して濃１店１．０
％としたものに、モノクローナル抗ｈＣＧ抗体（実施例
１に同じ）をフィブロイン（同形分）に対して１００重
（ｔ％の割合で溶解し、この溶液に（θＶ￥ｆｉ、３５
ｎ＋＋１１のポリスチレン製ポール（重量約１４５ｍｇ
／個ンを添加し、３０″Ｃ×７０％ＲＨの雰囲気下に充
分攪拌しつつ乾燥して、ポール表面にモノクローナル抗
ｈＣＧ抗体を含むフィブロイン皮膜（マトリックス）を
形成せしめた。コーティング終了後、ポールの一部をサ
ンプリングし、絶乾して屯１１１増加率をめたところ０
．６５％であった。

ここで得られた固定化抗体について、試験例２に準じて
有効固定化ｊψをめ、０．１３２重ｇ、／ｃｉなる値を
得た。この結果から、本実施例の固定化抗体の場合、実
施例１のそれと比較して、約半分の抗体使用量で約１．
５倍の表面固定化量が得られることがわかる。

実施例３ モノクローナル抗ｈＣＧ抗体に代えてモノクローナル抗
ヒトα−フェトプロティン抗体（免疫動物・マウス）を
用いるほかは実施例２と同様にして、ポリスチレン製ポ
ールの表面にモノクローナル抗ヒトα−フェトプロティ
ン抗体を含むフィブロイン皮膜（マトリックス）を形成
せしめた固定化抗体を得た。この１．！４定化抗体の有
効固定化量を試験例２に準する方法により測定したとこ
ろ０゜１２９重ｇ／ａｔであった。

また、試験例３と同様にして（但し、ｈＣＧに代えてα
−フェＩ・プロティンを、また抗ｈｃＧ抗体−ペルオキ
シターゼ標識物に代えて固定化した七ツクローナル抗体
と認識部位の異なるモノクローナル抗ヒトα−フェトプ
ロティン抗体のベルオキシターセ標識物をそれぞれ使用
した）α−フェロプロティンに対する４１１１定感度（
最小検出濃度）をめたところｌｏｎｇ／Ｊｊ以下であっ
た。

この測定感度はヒト血清中のα−フェトプロティンの異
常値を検出するのに充分なものである。

実施例４．５．６ 第４表に示す抗体のいずれか１種ｌｏｏｍｇ、５．５％
フィブロイン水溶液１４．５ｇおよびグリセリン２４０
ｍｇを充分４ｒ＋’、合して得られた混合液をカラス板
１、に流延し、２５°Ｃで１０時間風乾して皮膜化し、
第４表に示す３種の固定化抗体を得た。

試験例６アフィニティクロマトグラフィーへの１心川。

実施例３の固定化抗体（ボール）を、α−フェＩ・プロ
ティンを３００ｎｇ／−の濃度で含むヒト面清中に、血
清０．５ａＱ当りボール１個の割合で浸漬し、２５°Ｃ
に３時間放置してα−フェトプロティンを結合せしめた
。この時のα−フェトプロティンの結合量を、＋ｆｕＷ
’ｉ中の残存α−フェトプロティンｂｉからめたところ
、ボール１個につき９０ｎｇであった。

次に、α−フェトプロティンを結合したボール５０個を
カラムに充填し、カラムＬ部よりＯ，１Ｍクリシン−Ｉ
Ｑ４酸緩衝液（ｐ）１３．０）を０．５ｍΩ／ｍｉｎの
流速で流し、溶出した液を１Ｍグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ１１）でｐ）１７前後に中和した。こ
の溶出液中のα−フェトプロティン；１１を、実施例６
の固足化モノクローナル抗α−フェトプロテイン抗体（
フィルム）を用いてＡｌ１１定したところ、結合α−フ
ェトプロティンの８０％が回収されたことがわかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、フィブロインの結晶化度測定のためのＸ線広
角回折チャートの一例をンＨｅすものであり、ａは被検
フィソロインフィルムの、才たｂは対照の無定形フィブ
ロインフィルムの回折強度曲線である。 第２図は、本発明の固定化抗体（実施例■）を固定相と
するサンドイツチ法を用いエンザイムイムノアンセイに
よりｈＣＧを測定した場合に於ける検イｆり中のｈＣＧ
濃度と対応する酵素反応液（発色液）の吸光度Ａｂｓ４
９２との関係を示す線図である。 出願人鐘紡株式会社 第１図 １’Ｅ］抑角ＩＸ（２θ） 第２図 Ａｃｅ１１（ｍＩＵ／ｒｎす

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗体がフィブロインマトリックス中に包括固定化
   されていることを特徴とする固定化抗体。
2. （２）フィブロインの結晶化１隻が約２０％以ｌ−であ
   る特許請求の範囲第１項記載の固定化抗体。
3. （３）形状がフィルｌ、状である特許請求の範囲ε＋Ｓ
   ｌ’１４または第２項記４＆、の固定化抗体。
4. （４）形状が粉末状または顆粒状である特許請求の範囲
   第１イ１または第２ダｌ＋ｉ［！載の同定化抗。 体。
5. （５）形状か繊維状である特許請求の範囲第１ＪＳ＋ま
   たは第２ｔｒ＋記載の１−２１定化抗体。
6. （６）抗体を包括固定化したフィブロインマトリックス
   か不溶性のＪ、％体にｌこ形成され、該基体と一体化さ
   れている特許請求の範囲第１項または第２項記載の固定
   化抗体。
7. （７）不溶性の基体がカラスまたは有機高分子の成型物
   である特許請求の範囲第６項記載の固定化抗体。