JPS6256862A - 免疫測定用不溶性担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ポリエチレンテレフタレートに、抗原又は抗
体を吸着固定化した免疫測定用不溶性押体に間する。

〔従来の技術〕

抗原抗体反応の高い特異性を利用して検体中に含まれる
特定の抗原あるいは抗体を検出、定量し、疾病等の診断
あるいは治療に役立たせることは広く行われている。＃
に、ラジオイムノアッセイやエンザイムイムノアッセイ
は臨床検査における微場分析手法として、その有用性は
益々高まって来ている。

この免疫測定法を実施するに当っては、測定精度あるい
は操作の簡便性等の観点から、一般に測定対象の抗原（
あるいは抗体）に対応する抗体（あるいは抗原）を予め
適当な不溶性担体に固定化しておき、この固定相に被検
抗原（あるいは抗体）を反応させるいわゆる固相法が用
いられている。固相法に於ては、不溶性担体への固定化
様式の点から、化学結合法、吸着法、および包括法によ
るものの３つが代表的なものとして挙げられるが、なか
でも吸着法によるものが汎用されている。

吸着法に於ては、従来、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩
化ビニル等が不溶性担体の素材として用いられているが
、不溶性担体の素材が分析の良否に大きな影響を及ぼす
ことが知られている。

即ち、担体素材により、抗原あるいは抗体の担体への吸
着固定化量及び免疫反応時に於ける抗原あるいは抗体又
はそれらの標識物の担体への非特異的な吸着に差がある
ため、担体素材の相違によって分析の精度Ｏ感度が左右
される。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者等はｈ記の点に鑑み、従来の担体素材にかわる
優れた素材を求めて種々検討を行った。

〔問題点を解決するための手段〕

未発用者等は種々検討した結果、ポリエチレンテレフタ
レートが、従来公知の素材に比して多量の抗原あるいは
抗体を吸着固定化することができ、又免疫反応時に於け
る非特異的な吸着も少ないことを見い出して、本発明を
完成した。

本発明で用いられるポリエチレンテレフタレートは、ポ
リエチレンテレフタレートを主成分とするものであれば
良く、例えば、ポリエチレンテレフタレートに２０重量
％未満のポリブチレンテレフタレート等の共重合成分、
あるいは２０重量％未満のポリエチレン、ポリブチレン
テレフタレート等の相溶性樹脂を混合することもできる
。又後述するように、二酸化チタン等の無機粉末を混合
することもできる。

本発明のポリエチレンテレフタレートは公知の東金法、
例えばエチレングリコールとジメチルテレフタ１／−ト
とのエステル交換上合法で得ることができる。

本発明の担体の形状は特に限定されないが、分離、洗浄
等の操作が容易なように直径１■以にの球状、円筒状、
角柱状、歯車状等が好ましい。

又、担体表面を粗面化することが好ましく、その場合に
は、例えば、神体素材を８０〜１５０℃、好ましくは９
０〜１２０℃で、通常１〜５時間加熱処理した後、アル
ミナ、金剛砂等の微粒子−と担体素材を混合してボール
ミルで処理する、あるいは同様な微粒子を高速でその表
面に吹き付ける等により行うことができる。

」−記粗面化を容易に行うため、二酸化チタン等の無機
粉末を０．０５〜２．０重罎％、好ましくは０−１−０
．５重量％担体素材に混合することが好ましい。

本発明の免疫測定用不溶性担体に吸着固定化しうる抗体
としては、ＩｇＧ　、　ＩｇＨ、ＩｇＡ等いずれのクラ
スも、又メブシン処理、パパイン処理、環元処理等によ
って得られる抗体フラグメントも用いることができる。

特に細胞融合法で得られるモノクローナル抗体を用いる
のが、感度、精度ないしは分離能を一層向−Ｈせしめる
ことができるなどの点で好ましい。又抗原としてはポリ
ペプチド系ホルモン、血清蛋白等が挙げられる。

抗原又は抗体の由来動物はヒト、マウス、ウマ、ヒツジ
、ラット、ラビット、ヤギ等から適宜選ぶことができる
。

抗原又は抗体の不溶性担体への吸着固定化は、抗原又は
抗体０１１度が１０　ｎｇ／　ａＱ　”　ｌ　Ｏｍｇ／
　ａＱ、好ましくは１４／−〜１蓮ｇ／−のＰＨ５〜１
０、好ましくはＰＨ７−９の緩衝水溶液中に通常θ〜４
０℃で１〜２４時間担体を浸漬すれば良い。

固定化処理した担体は洗浄した後、牛血清アルブミン、
ゼラチン等の蛋白緩衝水溶液（中性近辺）中に保存すれ
ば良いが、防腐剤を加えた蛋白緩衝水溶液中３０〜４０
℃で１〜７日間加熱すれば、免疫反応の感度を一層上昇
させることができるので特に好ましい。

本発明の免疫測定用不溶性担体は、ラジオイムノアッセ
イやエンザイムイト、ツアー・セイに好適に使用するこ
とができ、又測定方法と１７で競争反応法あるいはサン
ドイツチ法等の非競争反応法のいずれにも用いることが
できる。

本発明の免疫測定用不溶性担体を用いて測定しうる物質
としては例えば以下のようなものが珪体例として挙げら
れる。

■　インシュリン、絨毛性ゴナドトロピン、胎盤性ラク
トゲン、端棒形成ホルモンなどのポリペプチド系ホルモ
ン。

（防　ＩｇＧ　、　ＩｇＡ　、　ＩｇＭ　、ＩｇＥ　、
α−フェトプロティン、カルシノエンプリオニックアン
チゲン、ハプトグロビンなどの血清蛋白。

ｊ　大腸菌ｍ素、コレラトキシン、肝炎ウィルス、風疹
ウィルス、インフルエンザウィルスなどの毒素あるいは
ウィルス。

■　エストラジオール、プロゲスアロン、テストステロ
ン、フェニトイン、プロ力・インアミド、カナマイシン
、ペニシリン、バルビッール酸などのステロイドホルモ
ンあるいは薬剤。

〔発明の効果〕

本発明の免疫測定用不溶性担体は、以下の試験結果に示
すとおり、従来公知の担体素材に比して多量の抗原ある
いは抗体を均質に吸着固定化することができ、しかも免
疫反応時に於ける非特異的な吸着も少ないなどの優れた
特性を有している。

又、ポリエチレンテレフタレートは通常１．１〜１．４
の比重を有しており、反応液中に容易に浸漬することが
でき、ポリエチレンあるいはポリスチレンを主成分とす
る比重の小さい素材の場合に必須である高比重の添加剤
を用いる必要がない利点を有している。

試験例 １）供試試料 ボリエ千しンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリエ
チレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シ
リコンゴム、テフロン、６−ナイロン、キュプロファン
、ポリビニルアルコール、ガラス、ウレタン、アセチル
セルロース。

Ｌ記の各担体素材を夫々２ｄのフィルムとし。

以ドのように処理して供試試料とした。

ｆ４０ち、抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体（免疫動物
：マウス、モノクローナル抗体）の５０絽／椴溶液（０
、０２Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９
，０）ｌ−中にに２各フィルムを夫々１枚ずつ浸漬し、
４℃で２４詩間吸着操作を行った。次に各フィルムを水
洗した後、０．５％牛血清アルブミン水溶液（０，０１
Ｍリン酸緩衝生理食塩液、ｐＨ７，２）中に入れ３７℃
で２時間放首した。

２）試験方法 各フィルムを、抗マウス■ｇＧ抗体（免疫動物；家兎）
の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識物（Ｃａｐｐｅｌ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、製）ｌｏｇ／−水
溶液（０，１％牛而面アルブミン０．ＯＩＭリン酸緩衝
生理−１￥塩液、　ｐＨ７、２）　ｌａＱ中に入れ３７
℃で２時間反応した９次いで、各フィルムを３回木洗し
た後、別に＊備した内径１３罫■のガラス試験管に入れ
た。

次に、この試験管にＯ−フェニレンジアミンと過酸化水
素を夫々１６．７ｍＭおよび２．４５ｍにの濃度で含む
クエン酸緩衝液（クエン酸−リン酸ニナトリウム、ｐＨ
５，０）２−を入れ３７℃で５分間振盪１，２て酵素反
応を行わしめた後、３．６規定硫酸２ｄを加えて反応を
停止トさせた。この反応液について４９２ｎｍにおける
吸光度（Ａｂｓ４９２）を測定した。

父、上記各フィルムについて、夫々抗ヒト絨毛性ゴナド
トロピン抗体を含まない緩衝液中で２４貼間処理干る以
外は同様の操作を行ってブランク値を求め、非特異的吸
着の指標とした。

３）結果 第１表 Ａｂｓ４９２の値が大きい程、各フィル１、（で吸着さ
れた抗ヒトＭ毛性ゴナ１トロピン抗体の墨が多いことを
ポしており、従って、ポリエチレンテレフタレートから
なるフィルムは他の素材のフィルムに比較してはるかに
多くの抗体が固定化されていることがわかる。しかもポ
リエチレンテレフタｌ／　−トからなるフィルムは吸着
着のバラツキも少なく、又ブランク値から明らかなよう
に非特異的吸着も非常に少なかった。

〔実施例〕

以下に実施例および参考例を挙げて、本発明を更に旦体
的に説明する。

実施例１ １００ｉａｔ部のジメチルテレフタレート、５９重量部
のエチレングリコール、ｏ、ｉ＠墨゛部の酢酸カルシウ
ム及び０．４ｆｍ４部のニー酸化チタンの混合物を窒素
気流下１５５〜２２０℃で３時間加熱レメタノールを留
去後、ｏ、ｏａｉｉ部のリン酸トリメチルと０．３５重
量部の三酸化アンチモンを加え、２５０℃に昇温してエ
チレングリコールを留ＩＥ　Ｌだ。次いで、２８０〜２
８５℃にｄ湯上１０　ｍｍＨｚになるまで徐々に減Ｗに
し、その後−に減圧に１．て、０　、７ｍｍｌ（ｇで１
時間毛合を継続した。得られたポリエチレンテレフタレ
ートは耐α２６０℃、極限粘度０．６１４であり、これ
紮射出成型機により１α径６　、４℃閣のポールとした
。これを１１０℃で３時間熱処理後、アルミナ粉末（１
２０メツシユ）と共にボールミルで８時間粗面加［を行
なった。次いで、超音波洗浄機を用いてポールを水洗し
、抗ヒトＭ１．＠性ゴナドトロピン抗体（貧疫動物：マ
ウス、モノクローナル抗体）の４０　ｇ　／　ｄ溶液（
０、０１Ｍリン酸緩衝液、　ｐＨ７，２）中に浸漬し、
４℃で２４時時間前操作を行った７水洗後、０．５％牛
血清アルブミン水溶府〔０，ＯＩＭリン酸緩衝生理食塩
液（１）、Ｏ１＄　７ジ化すトリウム含有）、ｐＨ７，
２〕中に３７℃で３日［１浸漬し、抗ヒト絨毛性ゴナド
トロピン抗体を固定化した不溶性担体な得た。

実施例２ 抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体に代えて抗ヒトα−フ
ェトプロティン抗体（免疫動物：マウス、モノクローナ
ル抗体）を用いる他は実施例１と同様にして該抗体を固
定化した不溶性担体を得た。

実施例３ 抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体に代えて抗ヒトアルブ
ミン抗体（免疫動物：ヤギ、抗血清のＩｇＧ留分）を用
いる他は実施例１と同様にして該抗体を固定化した不溶
性神体を得た。

実施例４ 抗ヒ）Ｍ工性ゴナドトロピン抗体に代えて抗ヒ）　１ｇ
Ｇ抗体（免疫動物；ヤギ、抗血清のＩｇＧ留分）を用い
る他は実施例１と同様にして該抗体を固定化した不溶性
神体を得た。

参考例１〜４（定寸感度の測定） 実施例１〜４で得られた各不溶性担体を用いて末々に対
応する標準曲線を以下のようにして作成した。

■口ち、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの場合は、ヒト絨毛
性ゴナドトロピンを０〜３２０　ｍｌＵ／ｄの範囲の種
々の濃度で含有する０、１吃ψ％牛血清アルブミンを含
む０．０１Ｍリン＃緩衝生理ｎ塩液（ｐＨ７，２）０．
５社中に実施例１の各ポールを各々浸漬し、３７℃で１
時間反応した。次に水洗後１００　ｎｇ／　５ｆｆｌの
抗ヒ）Ｍ手性ゴナドトロピン抗体（象疫動物：家兎、抗
血清ＩｇＧ留分）の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識物
を含有した０、１セＶ％牛血清アルブミン０．ＯＩＭリ
ン酸緩衡生理食塩溶液０．５ｄ中に浸漬して３７℃で１
時間反Ｉ５１．た。各ポールを３回水洗後、別に？Ｆ備
Ｉまた内径ｔ３ｍｍのガラス試験管に移した。

次に、この試験管に０−フェニレンジアミンと過酸化水
素を夫々Ｌ６．７ｍＭおよび２．４５ｍにの濃度で含む
クエン酸緩衝液（クエン酸−リン酸二ナトリウム、ｐＨ
５、０）　０．５ｓＱを入れ、室温ド暗所で１時間酵素
反応を行わせた後、１規定硫酸２　ｍＱを加えて反応を
停＋１−．　した。この反応液について吸光Ｉ８′（Ａ
ｂｓＡ９２）を測定し、標準曲線（Ｍ１図本照）を作成
した。

他の抗原についても同様な操作によって標準曲線（第２
〜４図参照）を作成した。

但し、標識抗体として、ヒトα−フェトプロティンにつ
いてはモノクローナル抗体（固相の抗体とは認識部位の
異なるもの）の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識物を、
又、ヒトアルブミンとヒトＩｇＧについては抗血清から
得られたＩｇＧに西洋ワサビペルオキシダーゼを標識し
て用いた。

又、ヒトアルブミンの場合、牛血清アルブミンとの交差
反応を防１トするために牛血清アルブミンの代わりにゼ
ラチンを用いた。

各標準曲線から、最小検出濃度（感度）はヒト絨毛性ゴ
ナドトロピンで５ｍＩ■／−、ヒトα−フェトプロティ
ンで０　、５　ｎｇ／　ｓＱ、ヒトアルブミンで３ｒ＋
ｇ／ｄ、ヒトＩｇＧ　テ３　ｎｇ／　ｄであり、夫々の
抗原について、実用的な範囲での測定が検体の希釈を考
慮しても充分回部なことが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト絨毛性ゴナドトロピンの標準曲線を、第２
図はヒトα−フェトプロティンの標準曲線を、第３図は
ヒトアルブミンの標準曲線を、第４図はヒ）　ＩｇＧの
標準曲線を夫々表わす。 第１図 ｂｓ４９２ ヒト絨毛・陣ゴナドｌ〜ロビン（ｍＩ　Ｕ／ｍｕ）第２
図 ｂｓ４９２ ヒトα−フェｌ〜プロティン（ｎ　ｇ／＋ｎＱ）第３図 Ａｂ５４９２ ヒトアルブミン（ｎｇ／ｍｕ） 第４図 ｂ５４９２ ヒトエｇ０（ユｇ、／ｍ見）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ポリエチレンテレフタレートに、抗原又は抗体を吸着固
   定化した免疫測定用不溶性担体。