KR100416490B1 - 면역멤브레인스트립의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비오틴-비반응성 단백질 중합체를 멤브레인 표면에 일정지역 물리흡착 부동화시키고, 비반응성 단백질을 이용하여 잔여표면을 처리한 후, 스트렙트아비딘 또는 아비딘 용액을 스트립의 하단 끝으로 부터 기흡착된 비오틴 단백질 지역으로 전달하여 제 1차 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응시키고, 비오틴-항체 중합체 용액을 다시 순차적으로 전달하여 동일한 지역에서 기부동화된 (스트렙트)아비딘과 제 2차 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응에 의해 항체를 부동화시키고, 세척시킴을 특징으로 하는 면역 멤브레인 스트립의 제조방법에 관한 것이다.

Description

면역 멤브레인 스트립의 제조방법{A process for preparing immuno membrane strip}

본 발명은 아비딘 또는 스트렙트아비딘-비오틴 반응을 이용하여 세공성 멤브레인 스트립(membrane strip) 표면에 항체를 부동화하는 효율적 방법 및 그를 이용한 면역분석시스템에 관한 것이다.

항원과 항체 간의 부착반응을 이용한 면역학적 측정방법은 그 특이성과 민감성이 매우 높아 다양한 분석물질의 검출에 널리 사용된다. 그 방법은 의료분야에서 혈액 내 단백질과 호르몬 등의 적정농도를 검사하거나 치료용 약물의 체내 대사속도를 측정하는데 이용될 뿐만 아니라 질병과 증세의 진단에 필수적이다. 또한, 면역 측정방법은 식품과 환경에 매우 낮은 농도로 존재하는 오염물질들의 정량에 응용되고 있고 더욱이 동식물 관리와 국방분야에서도 그 중요성이 인정되고 있다.

일반적으로 보급된 면역측정시스템의 구성성분은 마이크로웰과 같은 반응용기 내부표면에 부동화된 항체와 신호발생원으로 구성된다. 부동화된 항체는 분석물질 분자를 특이하게 인지하여 고체상에 그 분자를 포획하는 역할을 한다. 신호발생원은 전형적으로 제 2항체와 신호발생용 효소가 결합된 중합체이며, 이 항체는 포획항체와는 다른 분석물질 상의 부위(epitope)에 특이 부착한다.

그 두 성분을 이용한 분석과정으로써, 분석물질을 부동화된 항체와 반응시키면 그 분자는 고체상에 포획되고, 용기를 세척 후 효소 중합체를 가하여 반응시키면 포획된 분석물질분자 위에 중합체가 부착되므로 결국 분석물질을 중심으로 샌드위치 형상의 반응결합체가 형성된다. 다시 세척 후, 효소에 대한 특이기질을 가하면 효소반응에 의해 발생된 발색세기에 따라 분석물질을 정량 혹은 정성 측정한다. 분석물질이 항체인 경우 그에 특이한 항원이 부동화되는 것을 제외하고는 수행과정은 동일하다. 이와 같은 과정에 의한 소요시간은 보통 2시간을 초과한다.

상기한 바와 같이 마이크로웰을 이용한 측정시스템은 과정이 복잡하고 시간이 오래 걸려 전문지식이 없는 일반인이 사용하기 매우 어렵다. 이와 같은 문제점은 세공성 멤브레인 스트립을 이용한 면역 크로마토그라피 방법[참고문헌 : 미국특허 제5,096,837호, 유럽특허공개 제3491,215 A1호, PCT 국제특허공개 제WO 88/08534호S. C. Lou 등 Clinical Chemistry, volume 39, pp 619-624 (1993) : S. Bimbaum 등 Analytical Chemistry, volume 206, pp 168-171 (1992)]의 사용에 의해 해결될 수 있다. 이 멤브레인 스트립 시스템의 주요 구성 성분은 그 스트립의 일정지역에 부동화된 항체 그리고 제 2항체와 신호발생물질이 결합된 중합체이다. 분석물질이 포함된 시료를 중합체와 혼합한 다음 스트립의 하단으로 부터 흡수시키면 수용액은 모세관 현상에 의해 항체가 부동화된 지역으로 전달된다.

이 지역에서 위에서 언급된 바와 같이 항원-항체 반응에 의해 샌드위치 결합체가 형성되고 반응하지 않은 성분들은 유체의 흐름에 따라 분리된다. 샌드위치 결합 부위로 부터 육안으로 확인가능한 발색신호를 발생시키기 위해 신호발생물질로써 효소, 콜로이달 골드(colloidal gold), 혹은 유색 라텍스 비드(latex bead)가 주로 사용된다. 이 방법은 시약의 첨가나 제거 혹은 분리과정이 포함되지 않으므로 1단계 수행이 가능하고 10분 이내에 측정을 완료할 수 있다.

항체의 부동화모체로 이용되는 멤브레인 스트립의 재질로써 니트로셀룰로오스 혹은 합성 폴리머인 나일론과 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)등이 주로 사용되고 항체의 부동화는 단백질과 멤브레인 표면 간의 소수성 상호작용을 이용한 물리흡착방법에 의해 간편하게 수행될 수 있는 반면에 항체분자가 무작위로 부동화되어 항원포획에 참여하는 분자의 비율이 낮을 뿐만 아니라 분석 중 부동화되었던 항체분자가 탈착될 수 있다. 더우기 항체분자가 고체표면에 직접 부동화되므로 단백질 구조변화가 야기될 수 있고, 이 경우 포획능력은 더욱 감소된다. 결국 물리흡착에 의한 항체의 부동화는 특정신호의 감소화 비특정반응의 증가에 따른 측정민감도(측정 가능한 분석물질의 하한농도)의 저하를 초래할 수 있다.

마이크로웰을 부동화모체로 사용하는 경우, 이와 같은 문제점들은 생물학적 부착반응 중 가장 강한 것으로 알려진 아비딘- 혹은 스트렙트아비딘-비오딘 반응(부착상수, Ka = 10 L/mol)을 이용하면 해결될 수 있는 것으로 보고되고 있다[참고문헌 : M. Suter 등, Immunology Letters, volume 13, pp 313-316 (1986) : J. E. Butler 등, Federation Proceedings, volume 46, pp. 2548-2556 (1987) : M. Suter 등, Molecular Immunology, volume 26, pp 221-230 (1989) : V. S. Ivanov 등, Jorunal of Immunological Methods, 153, pp 229-233 (1992)]. 예를 들어, 아비딘을 고체표면에 물리흡착시킨 후 비오틴이 화학결합된 항체를 가하면 아비딘-비오틴 반응에 의해 항체부동화가 유도된다. 한 분자의 아비딘은 4개의 비오틴 부착자리를 갖고 있을 뿐만 아니라 비오틴-항체의 중합비가 일반적으로 2이상이므로, 흡착된 아비딘 분자들은 비오틴-항체 중합체에 의해 상호 연결되어 안정한 항체부동화가 성취될 수 있다. 이러한 방법에 의해 부동화된 항체분자들의 항원-항체 반응참여비는 단순한 물리흡착에 의한 방법에서 보다 현저히 높고 따라서 신호 증폭효과를 얻게된다.

유사한 응용으로써, 아비딘을 고체표면에 직접 흡착시킬 경우 아비딘 분자 상의 비오틴 부착자리가 손상될 수 있으므로 보바인 세럼 알부민(BSA)과 같은 비반응성 단백질이 비오틴과 중합된 단백질-비오틴 중합체를 표면에 물리흡착시킨 후 아비딘을 가하여 부동화 시킨다. 잇달아 비오틴-항체 중합체를 가하면 아비딘 분자에 의해 흡착된 단백질과 중합체는 상호연결되어 항체부동화가 성취된다고 생각하며, 본 발명자들은 멤브레인 스트립의 일정지역에 항체를 부동화시키기 위해 아비딘-비오틴 반응수율이 극대화되도록 최적방법 및 조건을 결정하였다.

위에서 언급된 바와 같이 (스트렙트)아비딘-비오틴 부착반응은 매우 강하고 빠르기 때문에 항체 부동화와 신호발생물질의 표지 등에 폭넓게 이용된다. 이러한반응을 항체가 부동화된 멤브레인 스트립 (이하, 면역 스트립)의 제조에 이용하기 위해 먼저 (스트렙트)아비딘을 니토로셀룰로오스 멤브레인의 일정지역에 스포트 형태로 가하였다(1∼2 ㎕/spot). 흡착되지 않은 잉여분을 제거한 후, 비오틴-항체 중합체를 고체상에 존재하는 아비딘과 반응시키기 위해 일반적으로 고려될 수 있는 방법은 다음과 같다.

첫째로, 블로팅 과정에서와 같이 멤브레인을 중합체용액에 담아 반응을 유도하는 방법이다. 그러나 이 방법은 많은 양의 중합체가 낭비될 뿐만 아니라 시간이 오래 걸려 매우 비효율적이다. 둘째로, (스트렙트)아비딘이 부동화된 지역에 적은 양의 중합체를 스포팅(1∼2 ㎕/spot)한 후 100% 습도가 유지되는 상자 내에서 배양하는 방법이다. 이 방법은 반응이 일어나는 국부지역에만 반응물을 고농도로 유지시킬 수 있는 장점이 있다. 그러나, 예기치 않게 반응수율이 매우 낮아 항체를 직접 고체표면에 부동화시키는 방법에 비해 신호발생량이 현저히 감소되었다.

이와 같이 낮은 반응수율을 초래한 원인은 다음과 같이 추론될 수 있다. 마이크로웰과 같은 용기와 비교하여 멤브레인은 동일한 투사면을 기준으로 약 100배 더 넓은 표면적을 갖는 반면에 사용되는 용액부피는 반비례하여 100배 정도 적다. 이 최소부피의 용액이 멤브레인 표면에 스포팅되면 세공 내 수분함량은 표면 장력에 의한 포집력과 모세관형상에 의한 분산력에 의해 결정된다. 일반적으로 수분이 세공을 모두 포화시킬 수 없을 뿐만 아니라 더우기 적은 양의 수분이 공기중에 노출된 표면으로 부터 증발될 정부 세공 내 수분함량은 더욱 감소된다. 용액이 세공 내에 부분적으로 잔존하게 되면 용액 내 분자들의 확산은 제한되고 따라서(스트렙트)아비딘-비오틴 부착반응이 저해될 수 있다.

실제로, 세공 내 고체표면 상에서의 부착반응은 다음과 같은 3 과정으로 이루어진 확산운동의 결과로써 일어나는 후속과정이다[참고문헌 : O. G. Berg 등, Annual Review in Biophysics and Biophysical Chemistry, volume 14, pp 131-160(1985) : S. H. Paek 등, Analytical Biochemistry, volume 196, pp 319-325 (1991)]. 먼저 용액 내 비오틴-항체 중합체는 분자확산(molecular diffusion)에 의해 (스트렙트)아비딘이 부동화된 고체표면까지 전달된다. 이 중항체 분자는 고체표면 상에서 부동화된 (스트렙트)아비딘 분자 방향으로 측면확산(lateral diffuasion)이 일어나고 연이어 두 반응분자 상의 부착자리가 상호 마주보도록 적절히 회전확산(rota-tional diffusion)이 일어나야만 비로서 부착반응이 야기될 수 있다. 이러한 확산과정은 액상과 고상의 계면에서 일어날 수 있으므로 멤브레인 세공이 모두 용액에 의해 포화되지 않을 경우 전체 확산속도는 매우 느리거나 혹은 극단적인 경우 확산자체가 일어날 수 없게 된다. 이 경우, (스트렙트)아비딘-비오틴 부착반응이 부분적으로 일어나게 되어 그 수율이 현저히 감소된다.

액상과 고상 계면에서의 확산속도는 블로팅 장치를 사용하거나 크로마토그라피 흐름방식에 의해 가속될 수 있다. 블로팅 장치는 멤브레인의 표면을 통해 용액을 세공 내로 강제공급하기 위해 사용되는데 이때 용액이 부동화지역 외로 번짐을 막기위해 멤브레인을 사이에 두고 상하평판을 단단히 조여야 한다. 이러한 조임에 의해 멤브레인 단면이 입착되므로, 실제로 이와 같은 방법에 의해 제조된 면역 스트립을 이용하여 측정시 단면을 통한 유체의 측면흐름(lateral flow)에 영향을 줄수 있는 단점이 있다.

본 발명자들은 이러한 단점을 개선하고자 측면흐름을 이용한 크로마토그라피 방식에 의해 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응을 수행하므로써 항체부동화를 성취하였다. 먼저 (스트렙트)아비딘을 물리흡착에 의해 멤브레인 스트립 표면의 일정지역에 부동화시킨 후 비오틴-항체 중합체를 그 스트립 하단으로 부터 흡수시키면서 모세관 현상에 의해 측면흐름이 발생되어 중합체는 아비딘이 부동화된 지역에 전달된다. 전달된 중합체는 기흡착된 (스트렙트)아비딘과 반응하므로써 항체가 효율적으로 부동화되는 공정이 개발되었다.

이와 같은 공정을 이용한 항체 부동화 효율은 위에서 언급된 바와 같이 BSA 등 비반응성 단백질-비오틴 중합체를 매개로 (스트렙트)아비딘을 부동화시키므로써 증진되었다. 한 분자의 (스트렙트)아비딘은 4개의 비오틴 부착자리를 포함하므로 이를 이용하여 흡착된 비오틴-BSA 분자와 비오틴-항체 분자가 상호 연결될 수 있었다. 먼저 비오틴-BSA 중합체를 멤브레인 표면에 흡착시킨 후 크로마토그라피 측면흠름방식에 의해 아비딘과 비오틴-항체 중합체를 순차적으로 연속공급하므로써 항체부동화가 수행되었다. 이 방법에 의해 제조된 면역 스트립은 (스트렙트)아비딘이 직접 부동화된 스트립과 비교하여 단위 면적 당 신호세기가 현저히 증가되었다. 이와 같은 결과는 BSA 분자를 매개로 (스트렙트)아비딘을 부동화시키므로써 (스트렙트)아비딘이 직접 고체표면에 흡착되어 야기될 수 있는 구조적 변화와 비오틴 부착자리의 가림현상이 방지되기 때문인 것으로 해석된다.

또한, 멤브레인 표면에서의 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응수율은 적절한 반응물의 선택과 잔여표면처리에 사용되는 블로킹용 단백질(BSA, 카제인, 젤라턴 등)의 종류에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다. 비오틴 부착 단백질인 아비딘은 비교적 높은 산성도에서 동전기점을 갖으며 당을 포함하고 있어 이온성 상호작용에 의해 혹은 당 부착단백질과의 상호 작용에 의해 비특이반응이 존재할 가능성이 높다. 반면에, 미생물로 부터 생산되고 같은 부착성질을 지니는 스트렙트아비딘은 약산성의 등전기점을 갖고 당을 포함하고 있지 않으므로 비교적 양호한 면역화학적 조건을 제공한다.

따라서 본 발명의 목적은 면역 크로마토그라피 분석시스템의 민감도를 향상시키고자 아비딘- 또는 스트렙트아비딘-비오틴 반응을 이용하여 멤브레인 스트립 표면에 항체를 부동화시키는 공정을 개발하고 또한 그 부동화된 항체를 이용한 측정 시스템을 제공하는 것 이다. 즉 비오틴-비반응성 단백질 중합체를 멤브레인 표면에 일정지역 물리흡착 부동화시키고, 비반응성 단백질을 이용하여 잔여표면을 처리한 후, 스트렙트아비딘 또는 아비딘을 스트립의 하단 끝으로 부터 기흡착된 비오틴 단백질 지역으로 전달하여 제 1차 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응시키고, 비오틴-항체 중합체를 다시 순차적으로 전달하여 동일한 지역에서 기부동화된 (스트렙트)아비딘과 제 2차 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응에 의해 항체를 부동화시키고, 세척시킴을 특징으로하는 면역 멤브레인 스트립의 제조방법을 제공하는 것이다.

실제로, 크로마토그라피 방식에 의한 항체 부동화시 스트렙트아비딘온 아비딘에 비해 일정농도에서 낮은 비특이반응을 나타냈을 뿐만 아니라 더 높은 특이반응성을 보였다. 더우기, 멤브레인 표면에서의 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응은 완충 용액에 포함된 블로킹용 단백질의 종류에 따라 민감하게 영향을 받았다. 면역분석 시 블로킹용 단백질은 BSA와 카제인이 일반적으로 사용된다. 우유단백질인 카제인은 특히 아비딘-비오틴 반응을 극단적으로 저해하는 것으로 나타났는데 이는 양전하를 주로 띤 아비딘과 음전하를 주로 띤 카제인이 이온성 상호작용을 하기 때문이다. 이러한 카제인에 의한 반응저해 현상은 다소 완화되기는 했지만 스트렙트아비딘-비오틴 반응에서도 관찰되었다. 반면에, 블로킹용 단백질을 BSA로 대체할 경우 반응수율은 매운 높은 것으로 나타났다. 이와 유사한 현상으로(스트렙트)아비딘을 부동화시키기 위한 매개체로써 비오틴-카제인 보다 비오틴-BSA가 더 우수하게 기능하는 것으로 결과가 얻어졌다.

상기한 최적조건 하에서 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응을 이용한 면역 스트립의 주요 제조 공정은 다음과 같다(제 1도 참조).

1) 멤브레인의 일정지역에 물리흡착에 의한 비오틴-단백질 중합체의 부동화

이 공정은 0.1∼10 mg/mL 중합체 용액을 멤브레인 스트립 (폭 5 x 길이 50 mm)하단으로 부터 15 mm 표면에 1∼2 ㎕ 스포팅하여 수행되거나 (제 1도 (가)) 혹은 상업적 생산 시 제트 시스템 시약(reagent jet system), 마이크로프로세서로 조절되는 시린지(miroprocessor-controlled syringe), 혹은 공기 브러쉬(air brush)와 같은 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 중합체가 가해진 스트립은 100% 습도가 유지되는 상자 내에서 10분∼1시간 배양된다. 중합 단백질로써 BSA가 선호되고 카제인과 젤라틴 등 다른 비반응성 단백질들이 이용될 수 있지만 신호세기의 변화가초래될 수 있다.

2) 비반응성 단백질을 이용한 잔여표면 처리 및 건조

표면처리를 위해 0.5∼5% BSA등 비반응성 단백질이 포함된 인산 버퍼 생리식염수(PBS)와 같은 중성 완충용액 내에 스트립을 담가 상온에서 0.5∼2시간 배양한다. 대체 단백질로 카제인과 젤라틴 등이 사용될 수 있지만 일반적으로 공정 1에서 사용된 단백질과 동일한 종류가 선호된다. 블로킹 후 PBS 등 중성 완충용액으로 3번 세척한 다음 건조는 공기 중 혹은 진공 하에서 수행될 수 있다.

3) (스트렙트)아비딘-비오틴 반응을 이용한 다단계 항체 부동화

항체부동화 공정은 다음과 같은 4단계로 나누어 수행될 수 있다. 1차로 BSA가 포함된 완충용액으로 (스트렙트)아비딘을 0.1∼2 mg/ml 농도로 희석한 후 그 희석 용액 4㎕를 마이크로웰 같은 소형 용기에 가한다. 이 용기 내에 공정 2에서 건조된 멤브레인 스트립의 하단을 담거세워 (스트렙트)아비딘 희석용액을 모세관현상에 의해 모두 멤브레인 내부 흡수시킨다(제 1도(나)). 2차로 흡수완료 후 BSA 완충 용액 3㎕를 용기내에 가하여 그 멤브레인 하단으로 부터 흡수시킴으로써 (스트렙트)아비딘을 상단으로 이동시킨다(제 1도(다)). 3차로 같은 용액으로 희석된 0.1∼5 mg/ml 비오틴-항체 중합체 4㎕를 용기내에 가하여 연속적으로 흡수시킨다(제 1도(라)). 마지막으로 중합체의 흡수가 완료되면 BSA 완충용액 20㎕를 추가로 흡수시켜 (스트렙트)아비딘과 중합체를 상단으로 이동시키므로써 부동화된 비오틴-BSA 지역에서 모두 반응될 수 있도록 한다(제 1도(마)). 위에서 언급된 각 성분들이 포함된 용액부피는 멤브레인 스트립의 크기에 따라 변화될 수 있다. 참고로, 플라스틱 등으로 지지되어 있지 않은 멤브레인을 사용 시 본 공정 3을 시작하기 전에 양면 테이프를 사용하여 멤브레인을 플라스틱 지지판에 접착시켜야 한다.

4) 세척 및 세척제 흡수

항체가 부동화된 면역 스트립을 0.1∼1% 트윈-20과 0.5% 카제인 등 비반응성 단백질이 포함된 완충용액에 담가 5∼60분 배양한 다음 PBS 완충용액으로 3번 세척한다. 세척 시 단지 완충용액으로 스트립 표면을 닦아내는 정도로 간략히 수행한다. 이는 세척제인 트윈-20이 멤브레인 세공 내에 잔존하도록 하여 실제 진단 시 수용액의 일정유속을 유지하기 위함이다. 세척 후 깨끗한 장소에서 건조시키고, 사용시 까지 건조제와 함께 4℃에서 보관한다.

상기 공정에서 면역 스트립으로 사용되는 멤브레인은 니트로셀룰로오즈, 글라스 파이버 또는 나일론과 PVDF 등 합성수지와 같은 세공크기가 0.1∼20 ㎛인 재질을 사용하는 것이 바람직하다.

또한 상기 공정에서 비오틴-비반응성 단백질 중합체는 관능그룹을 갖는 비오틴과 보바인 세럼 알부민, 카제인 또는 젤라틴과 같은 특정 항원-항체 반응에 관여하지 않는 단백질을 화학반응시켜 합성되며, 단백질 한 분자 당 반응된 비오틴의 분자수가 2 이상임을 특징으로 한다. 한편 제 1공정에서 멤브레인 일정지역에 물리흡착에 의한 비오틴-단백질 중합체의 부동화시 비오틴-비반응성 단백질 중합체의 물리흡착 시 농도는 0.1∼10 mg/mL이고 중합체 용액을 멤브레인 표면에 가한 후 100%의 습도가 유지되는 밀폐된 공간에서 10분∼1시간 배양하는 것이 바람직하다.

또한 스트렙트아비딘 또는 아비딘의 희석용액으로는 보바인 세럼 알부민 또는 산성도 6∼8을 지닌 완충용액을 사용하는 것이 바람직하며, 특히 용액내에 포함된 비반응성 단백질과 동일한 산성도를 지닌 완충용액을 사용하는 것이 바람직하다. 마지막으로 제조된 면역 멤브레인 스트립은 0.1∼1%의 트윈-20과 0.1∼5%의 카제인 등 비반응성 단백질이 포함된 완충용액에 담아 5∼60분간 배양한 후 중성완충 용액으로 세척함으로써 트윈-20이 멤브레인 세공내에 잔존하도록 한다.

이와 같은 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응공정에 의해 제조된 면역 스트립은 항체가 직접 흡착된 경우와 비교하여 다음과 같은 장점을 지닌다.

첫쩨로, 신호증폭효과이다. 면역반응성을 유지하는 항체의 수가 증가되어 항원(분석물질) 포획능력이 향상되므로 이로 부터 발생되는 신호량이 증가된다. 따라서 면역 스트립의 분석민감도가 높아진다.

둘째로, 부동화된 항체의 안정화이다. 물리흡착된 비오틴-BSA 분자들이 (스트렙트)아비딘과 비오틴-항체에 의해 상호 연결되어 결국 항체의 부동화상태가 안정화된다. 이에 따른 부가적인 효과로써 진단측정 시 수용액의 유속을 조절하기 위해 트윈-20과 같은 세척제의 도입이 용이하다.

세째로, 가늘고 선명한 신호발생이다. 항체부동화는 멤브레인의 하단으로 부터 측면흐름방식에 의해 유도되므로 항체는 대부분 비오틴-BSA 흡착부위의 하부가장자리에 부동화된다(제 1도(마)참조). 결국 항원-항체 반응의 결과로써 나타나는 신호선은 가늘고 선명하며 또한 신호선의 두께는 반응물의 농도에 의해 조절될 수 있다. 이는 육안으로 결과를 판독하는 진단시스템의 경우 매우 중요하며 더우기 제트 시스템 시약, 마이크로프로세서로 조절되는 시린지, 혹은 공기 브러쉬 등 특별한 장치없이 제작할 수 있는데 그 의미가 있다.

위에서 제조된 면역 스트립을 이용한 측정시스템의 주요 구성성분은 그 스트립과 신호발생 시스템 그리고 분석시료이다. 신호발생시스템으로 효소, 골드 콜로이드 혹은 유색 라텍스 비드 등과 같은 신호발생물질과 제 2항체가 결합된 중합체가 일반적으로 사용된다. 제 2항체는 스트립 상에 부동화된 항체(포획항체)가 인지하는 분석물질분자 상의 부위와는 다른 부위에 특정부착한다.

분석을 위해 시료와 신호발생시스템을 혼합하면, 시료 내 분석물질이 존재할 경우 분석물질분자와 제 2항체-신호발생물질 중합체 간에 부착반응이 일어난다. 이 반응물이 포함된 수용액을 면역 스트립의 하단으로 부터 흡수시키면 모세관현상에 의해 포획항체가 부동화된 지역으로 이동되고 그 반응물은 포획되어 분석물질을 중심으로 샌드위치 형상의 결합체가 형성되고 나머지 성분들은 유체와 흐름에 의해 분리된다. 샌드위치 결합체는 신호발생물질을 포함하므로 그 자체색 혹은 효소-기질반응에 의해 육안으로 확인가능한 발색이 발생된다. 그 발색세기는 분석물질의 농도에 비해 총 수행시간은 10분 내외이다.

또한, 분석과정을 간편하게 수행하기 위해 1단계 측정시스템이 고안될 수 있다. 이를 위해 제 2항체-신호발생물질 중합체용액을 글래스 파이버 멤브레인(glass fiber membrane) 상에 가한 후 공기 중 건조 혹은 냉동건조시키면 중합체가 고체상태로 글래스 파이버 표면에 축적된다. 중합체가 축적된 글래스 파이버 멤브레인은 면역 스트립의 하단에 테이프 혹은 다른 수단에 의해 물리적으로 접합시킨다. 이와 같은 시스템의 운영 시 단지 분석시료를 글래스 파이버 멤브레인의 하단으로 흡수시키면(즉, 1단계 수행)이 수용액은 축적되었던 제 2항체-신호발생물질 중합체를 용해시켜 용액 내에서 항원-항체 반응이 유도되고 이 반응물은 면역 스트립으로 이동하여 위에서 설명한 바와 같은 분석물질 농도에 비례한 발색신호가 발생된다.

면역 스트립을 이용한 측정대상은 매우 광범위하지만 주요 응용분야를 예로써 열거하면 다음과 같다.

첫째로, 가정용 진단시약분야로써 임신(분석물질 : human chorionic gonadot-ropin)과 배란(leutenizing hormone)의 진단 및 알르레기를 일으키는 다양한 알레르겐 그리고 세균성 위궤양의 원인균(H. pyloris)에 대한 항체의 측정 등이 포함된다. 둘쩨로, 전염성 질병분야로써 AIDS 바이러스에 대한 항체 그리고 B, C형 등 간염 바이러스 항원 및 그에 대한 항체의 측정 등이다. 특히, AIDS 진단의 경우 공항이나 항만관리국 사무소에서 의심되는 사람에 대한 즉석진단에 그 응용이 중요하게 평가된다. 세째로, 동식물류에 대한 진단응용으로써 젖소 임신진단과 우유 내 항생제의 존재감식 그리고 감자등 바이러스 감염에 대한 측정 등을 들수 있다. 네쩨로, 식품 및 환경 진단분야로써 식중독 진단(Salmonella 및 Listeria 항원)과 식수 내 포함될 수 있는 살충제와 제품제의 존재여부 및 폐수 측정 등이다. 다섯째로, 국방분야로써 유독화학물질 및 전염성 생물학적 물질들의 속성측정에 응용될 수 있다.

다음의 실시예는 위에서 설명된 발명의 내용을 예로써 보완제시하기 위해 면역 스트립의 이용을 식중독 진단에 사용될 수 있는 Salmonella 항원 측정에 대해 실시하는 것이지 그 응용 분야 혹은 제조 조건에 제한을 두는 것은 아니다.

(실시예 1) 비오틴-단백질 중합체 합성 및 정제

구입된 Salmonella 특정 복합클론항체(염소항체, 미국 KPL) 1mg을 0.3 M 인산나트륨 완충용액(산성도 7.4) 1mL로 용해시켰다. 이 항체용액에 10 mg/mL N-히드록시석신이미드-LC-비오틴(미국 Pierce) 36㎕(단백질을 기준으로 100물 과량)를 가하여 혼합한 다음 20∼25℃가 유지되는 암실에서 4시간 동안 반응시켰다. 생성된 중합체를 겔 익스클루젼 클로마토그라피 방법에 의해 분리하고자 Sephadex G 50-80 겔(미국 BioRad) 20 mL가 채워진 글래스 칼럼이 제작되었다. 이 칼럼은 140mM NaCl과 0.02%(w/v) 티메로살이 포함된 10 mM 인산나트륨 완충용액(PBS)으로 충분히 세척되었고, 반응물 1 mL를 가한 후 PBS를 공급하여 유출시켰다. 중합체가 포함된 유출용액은 Bradford 분석법(참고문헌 : D. M. Bollag 등, Protein Methods, (1991), Wiley-Liss, pp 50-55)에 의해 탐지되었고, 이 용액을 합하여 황산 암모늄 침전법(참고문헌 : D. M. Bollag 등, Protein Methods (1991), Wiley-Liss, pp 79-81)에 의해 5배 농축시켰다. 농축액 중 저분자 성분들은 PBS 용액 내에서 투석과정에 의해 제거되었다. 이와 같이 정제된 비오틴-항체 중합체는 4℃ 혹은 얼린 후 -20℃ 에서 보관되었다. BSA와 비오틴 간의 중합체도 위와 동일한 합성 및 정제과정에 의해 합성되었다.

(실시예 2) 면역 스트립의 제조

스트렙아비딘-비오틴 반응을 이용한 면역 스트립의 제조를 위해, 먼저 PBS로 희석된 1 mg/mL 비오틴-BSA 중합체용액 1.5 ㎕를 니트로셀룰로오스 멤브레인(5 × 50 mm, 5㎛ poresize, 미국 Millipore) 하단으로 부터 15 mm 표면에 스포팅한 후100% 습도가 유지되는 상자 내에 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 잔여표면 처리를 위해 1% BSA가 포함된 PBS(BSA-PBS)에 스트립을 담가 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 멤브레인을 PBS 완충용액으로 3번 세척한 다음 공기 중에서 2시간 동안 건조하였고, 스트립의 지지를 위해 양면 테이프를 이용하여 폴리에틸렌 필름 위에 접착되었다. 이와 같이 준비된 스트립 상에 항체의 부동화는 측면흐름공정에 의해 수행되었다(제 1도 참조). 비오틴 BSA가 부동화된 스트립의 하단으로 부터 BSA-PBS로 희석된 0.5 mg/mL 스트렙트아비딘 용액 4㎕를 흡수시켰다. 용액이 모두 흡수되자마자 곧 3㎕ BSA-PBS를 가하여 세척하였고, 0.4 mg/ml 비오틴-항체 중합체 용액 4㎕를 순차적으로 흡수시켰다. 흡수완료 후 다시 20㎕ BSA-PBS를 흡수시켜 세척하였다. 이와 같이 항체가 부동화된 면역 스트립을 0.5% 트윈-20과 0.5% 카제인이 포함된 PBS에 담가 30분 배양한 다음 PBS로 간략히 3번 세척하였다. 그후 깨끗한 장소에서 건조시키고, 사용시 까지 건조제와 함께 4℃에서 보관하였다.

또한, 스트렙아비딘-비오틴 반응을 이용하여 제조된 면역 스트립의 성능을 평가하기 위해 항체가 직접 멤브레인 표면에 물리흡착된 스트립이 제조되었다. 항체용액(1 mg/mL) 1.5 ㎕를 위에서와 같이 고체표면에 가하여 배양한 후 0.5% 카제인이 포함된 PBS에 담가 잔여표면 처리를 수행하였다. 세척과 건조과정 및 지지대 접착방법은 위에서 언급된 바와 같다.

(실시예 3) 항체-골드 콜로이드 중합체 합성

Salmonella 항원 측정 시 신호발생시스템으로 사용하기 위해 항체와 골드 콜로이드가 결합된 중합체가 합성되었다. 먼저 1 mg/mL Salmonella 특정 복합클론항체를 10 mmM 인산나트륨 완충용액(산성도 7.4) 내에서 투석시킨 후 0.1 M 탄산완충용액 (산성도 9.6)으로 산성도 9.0으로 조절하였다. 또한, 같은 방법으로 직경 20 nm 골드 콜로이드 용액(0.01%, w/v, 미국 Sigma)외 산성도를 9.0으로 조절하였다. 산성도가 조절된 용액들은 이용하여 중합반응을 위해 골드 콜로이드 용액 8 mL에 0.1 mg/mL 항체용액 0.8 mL를 혼합한 다음 실온에서 30분 동안 흔들면서 배양하였고, 이 혼합액에 10% BSA가 포함된 PBS 0.8를 추가한 후 30분 더 반응시켰다. 과잉으로 존재하는 항체를 제거하기 위해 반응물을 원심력 25,000g에서 30분간 초고속 원심분리시킨 다음 상등액을 제거한 후 0.5% 카제인이 포함된 PBS를 넣고 다시 같은 원심분리과정을 반복하였다. 상등액을 제거한 후, 최종 분리된 항체-골드 중합체의 부피가 초기 골드 콜로이드 용액부피의 1/20이 되도록 0.5% 카제인-PBS를 넣어 조절하였다. 합성된 중합체는 -4℃에서 사용시 까지 보관되었다.

(실시예 4) 면역 크로마토그라피 방법에 의한 Salmonella 항원의 측정

위에서 제조된 성분들을 이용하여 열처리된 Salmonella typhimurium 항원(5 x 10 cells/mL, 미국 KPL)의 측정이 수행되었다. 마이크로웰 진단용기 내에 1 ㎕ 항체-골드 중합체를 넣고 2.5% 카제인-PBS로 희석된 Salmonella 항원을 추가하여 최종농도를 1.25 x 10 -1.25 x 10 cells/mL로 조절하였다(총 40 ㎕/스트립). 이 용기 내에 위에서 제조된 면역 스트립을 항원용액과 접촉되도록 꽂아 세워 스트립의 하단 끝으로 부터 모세관현상에 의한 용액의 흡수를 유도하였다. 수용액은 위로 이동하여 항체가 부동화된 지역을 통과하였고 10분 이내에 상단 끝에 도달하였다.

항체가 부동화된 지역에 분석물질의 농도에 비례하여 발생된 발색신호를 정량하기 위해 비디오 이미지 애널라이져을 이용하였다. 발색된 멤브레인을 비디오 사진기 아래 놓고 모니터 화면을 보면서 위치와 촛점을 조절한 다음 개인 컴퓨터에 내장된 스캐닝 보오드와 소프트웨어(미국 Biomed Instruments)를 이용하여 멤브레인 이미지를 포착하였다. 포착된 이미지 상의 발색부분은 이미지 분석 프로그램에 의해 발색세기에 비례하는 수치인 오팁컬덴시티(optical density)로 전환되었다. 이와 같은 측정된 오팁컬 덴시티를 Salmonella 세포농도의 합수로 표현한 표 1의 농도응답결과를 얻었다.

[표 1] 면역 스트립을 이용한 농도응답결과

제 1도는 세공성 멤브레인 스트립을 통한 측면호를 방식에 의해 아비딘 또는 스트렙트아비딘-비오틴 반응을 유도하여 그 스트립의 표면에 항체를 부동화하는 공정을 나타낸 원리도이다.

Claims (7)

1. 비오틴-비반응성 단백질 중합체를 멤브레인 표면에 일정지역 물리흡착 부동화시키고, 비반응성 단백질을 이용하여 잔여표면을 처리한 후, 스트렙트아비딘 또는 아비딘 용액을 스트립의 하단 끝으로부터 기흡착된 비오틴 단백질 지역으로 전달하여 제1차 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응시키고, 비오틴-항체 중합체 용액을 다시 순차적으로 전달하여 동일한 지역에서 기부동화된 (스트렙트)아비딘과 제2차 (스트렙트)아비딘-비오틴 반응에 의해 항체를 부동화시키고, 세척시킴을 특징으로 하며,

   상기 비오틴-비반응성 단백질 중합체는, 관능그룹을 갖는 비오틴과 보바인세럼 알부민, 카제인 또는 젤라틴과 같은 특정 항원-항체 반응에 관여하지 않는 단백질로 합성되며, 단백질 한 분자 당 반응된 비오틴의 분자수가 2이상임을 특징으로 하는 면역 멤브레인 스트립의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 면역 스트립으로 사용되는 멤브레인은 니트로셀룰로오즈, 글라스 파이버 또는 나일론과 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 등 합성수지로서 세공크기가 0.1∼20㎛인 재질임을 특징으로 하는 면역 멤브레인 스트립의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 멤브레인 일정지역에 물리흡착에 의한 비오틴-단백질 중합체의 부동화시 비오틴-비반응성 단백질 중합체의 물리흡착 시 농도는 0.1∼10mg/mL 이고, 중합체 용액을 멤브레인 표면에 가한 후 100%의 습도가 유지되는 밀폐된 공간에서 10분∼1시간 배양하는 것임을 특징으로 하는 면역 멤브레인 스트립의 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 세척시 제조된 면역 멤브레인 스트립은 0.1∼1%의 트윈-20과 0.1∼5%의 카제인 등 비반응성 단백질이 포함된 완충용액에 담아 5∼60분간 배양한 후 중성완충용액으로 세척함을 특징으로 하는 면역 멤브레인 스트립의 제조방법.
5. 제 1항에 있어서, 스트렙트아비딘 또는 아비딘 용액은 보바인 세럼 알부민 또는 산성도 6∼8을 지닌 완충용액으로 희석된 스트렙트아비딘 또는 아비딘 용액임을 특징으로 하는 면역 멤브레인 스트립의 제조방법.
6. 제 1항의 방법에 따라 제조된 면역 멤브레인 스트립.
7. 제 6항의 면역 멤브레인 스트립을 임신 배란 알레르기 등의 가정용 진단 시약, AIDS 바이러스 진단, 간염 바이러스 진단, 식중독 진단 등의 전염성 질환 등의 식품 및 환경 진단 또는 동식물류에 대한 면역학적 진단물질로 사용하는 방법.