KR20040092255A - 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기존의 멤브레인 스트립 크로마토그래피 방법을 개량하여 멤브레인 패드 상에서 표지물질과 감응성분을 포함하는 콘쥬게이트의 부착 및 탈착을 조절함으로써 분석민감도를 증가시키는 새로운 분석방법 및 이를 이용한 분석시스템에 관한 것으로서 본 발명의 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템은 시료첨가용 멤브레인 패드(10), 표지물질과 탐지용 감응성분을 포함하며 자력에 의하여 고정될 수 있는 콘쥬게이트가 축적되는 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20), 포획용 감응성분이 고정화되어 있는 신호발생용 멤브레인 패드(30) 및 용액흡수용 멤브레인 패드(40)를 포함하며, 신호발생용 멤브레인 패드(30)의 세로방향 양끝에 길이로 패드(40)과 패드(20)이 부분적으로 포개어 고정되고 패드(20)의 끝에 길이로 패드(10)이 부분적으로 포개어 고정되는 세로배열을 가지면서, 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20) 상에 자석(23)이 위치하게 된다.

Description

고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템{High-Sensitivity Membrane Strip Chromatographic Assay System}

본 발명은 기존의 멤브레인 스트립 크로마토그래피 방법을 개량하여 멤브레인 패드 상에서 표지물질과 감응성분을 포함하는 콘쥬게이트의 부착 및 탈착을 조절함으로써 분석민감도를 증가시키는 새로운 분석방법 및 이를 이용한 분석시스템에 관한 것이다.

면역분석은 항체와 항원간의 특이적 부착반응을 이용하여 분석물질을 정성 또는 정량 분석하는 방법을 말한다. 면역분석은 비교적 분자구조가 복잡한 분석물질(예: 단백질, 호르몬, 세포 등)을 탐지함에 있어서 민감하고 특이한 시험방법으로 그 분석성능은 분석물질과 반응하는 항체의 특성에 의해 크게 좌우된다. 지난 40여 년 동안, 면역분석은 병원과 연구실 등에서 인간과 동물의 보건 향상을 위한연구 분야 등에 광범위하게 사용되어 지고 있다. 의료분야에서 면역분석에 의해 얻어진 정보는 질병의 확인 또는 진척 정도를 파악하게 해줌으로써 질병의 악화를 감소시키며 병원에서의 불필요한 입원기간을 단축시켜주고 있으며 생명과학 연구 분야에서는 단백질, 호르몬, 항체 등 생물학적 시스템의 연구에 사용되고 있다. 또한 산업분야에서 면역분석은 식품과 식수 등의 오염 탐지와 제품생산과정에서 특정물질의 모니터링과 같은 품질관리 등에 사용되고 있다(참고문헌: Ezan 등, 2000,Immunoassay, Page 1-17, Oxford University Press, London).

면역분석 방법 중 면역 크로마토그래피 분석으로 대표되는 속성 진단방법은 전문인력 뿐만 아니라 전문지식이 없는 일반인도 사용이 가능하여 임신, 배란, 전염성 질병, 급성 심근경색, 암 탐지 등 응용범위가 확대되고 있는 추세이다. 이 진단기술은 의료현장용 분석의 한 주요 분야로써 전통적인 방법과 비교하여 사용의 간편성과 분석시간의 단축을 제공하며 궁극적으로 의료비용의 절감이 가능하다(참고문헌: C. P. Price 등, 1997,Principles and practice of immunoassay, Page 1-12, Macmillan Reference Ltd., London). 지난 10 여 년간, 면역 크로마토그래피 방법을 이용한 다양한 체외진단용 분석시스템이 개발되고 있는데 임신진단을 목적으로 최초로 개발되었다. 그 후, 배란, 마약, 에이즈와 간염과 같은 전염성 질병, 말라리아, 위궤양 원인균, 급성 심근경색 등 다양한 질병과 증세의 진단을 위해 확대되고 있는 추세이다.

면역 크로마토그래피 방법은 대부분 정성분석(참고문헌: C. P. Price 등,Principles and Practice of Immunoassay, 1997, Page 579-603, Macmillan Reference Ltd., London)과 반정량 분석(참고문헌: S. C. Lou 등, 1993,Clinical Chemistry, Vol. 39, Page 619-624)의 형태로 응용되어지고 있다. 이와 같은 분석방법에서 신호발생을 위한 표지물질로써 콜로이드 골드(colloidal gold) 입자가 일반적으로 사용되며 이것은 항원-항체 반응에 의해 면역결합체가 형성된 고체표면에 붉은 발색신호를 발생시킨다. 이 신호는 육안으로 식별 가능하므로 시료 내 분석물질의 존재유무를 간편하게 결정할 수 있다(참고문헌: M. P. A. Laitinen, 1996,Biosensors and Bioelectronics, Vol. 11, 1207-1214; S. H. Paek 등, 1999,Analytical Letter, Vol. 32, 335-360).

전통적인 면역 크로마토그래피 분석시스템에서 표지물질(콜로이드 골드 입자, 유색 플라스틱 비드 등)과 중합된 탐지항체는 콘쥬게이트 패드 상에 건조상태로 축적되어 있으며 시료가 첨가되면 콘쥬게이트는 용해되어 분석물질과 액상에서 반응한다. 이와 같은 반응은 시료용액이 모세관 현상에 의해 발생하는 유체흐름에 따르는 이동상태에서 일어나며 콘쥬게이트와 분석물질(항원)간에 면역결합체가 형성된다. 이 면역결합체는 멤브레인 상부로 이동하여 분석물질과 특이적으로 반응하는 고정화된 항체(포획항체)에 의해 포획되어 분석물질 농도에 비례한 신호를 발생하게 된다. 이와 같은 신호발생 메커니즘에서 발색신호의 세기는 항원과 항체간의 특이적 부착반응의 결과로 나타나는 면역결합체의 농도에 의해 결정된다.

이와 같은 반응은 두 분자 간의 상호 확산에 의한 충돌이 전제되어야 하므로 시스템의 분석민감도를 극대화시키기 위한 한 조건으로 분석물질과 이를 탐지하는 특이항체와의 충돌확률을 높일 수 있도록 시스템을 고안하여야 한다. 이와 같은 관점에서 볼 때 전통적 분석시스템의 경우 멤브레인의 세공을 통한 모세관 현상에 의해 유발된 층류(laminar flow) 상태에서는 확산에 의한 항체와 항원간의 혼합 효율이 충분치 못하며 또한 신호발생원(예로써 골드-탐지항체 콘쥬게이트)의 효과적인 용해속도 조절에도 어려움이 있다.

한편, 분석물질과 신호발생원간의 반응효율성이 낮은 문제를 해결하기 위한 방안으로 콘쥬게이트의 이동성을 가역적으로 조절하는 가역고정화 방법이 도입될 수 있으며, 이러한 방법에는 핵산의 상보적 염기서열간의 특이적 접합반응(참고문헌: Kaplan 등, 1997,International Journal for Parasitology, Vol. 27, Page 1585-1593)을 이용하는 방법과 셀룰로우즈와 이것에 특이적 결합하는 단백질인 셀룰로우즈 결합 영역 단백질(cellulose binding domain protein, CBD)(참고문헌: Levy 등, 2002,Biotechnology Advances, Vol. 20, Page 191-213) 그리고 이중 황화결합을 사용하는 방법 등이 있으며 콘쥬게이트의 이동성을 제한하게 해주는 결합력을 절단하기 위해서는 극단적인 조건(예: 강산성 및 강알칼리성 조건)을 필요로 한다.

예로써, CBD는 셀룰로우즈에 특이적으로 결합하는 단백질로서 상호간의 주된결합력은 수소결합에 기인하며 알칼리성 용액을 가할 경우 결합체는 떨어지게 된다. 신호발생원으로 사용하기 위해 콜로이드 골드-항체 콘쥬게이트에 CBD를 추가 중합시킨 후 이것을 셀룰로우즈 멤브레인 상에 부착반응에 의해 고정화 시킨다. 시료용액을 가하여 셀룰로우즈 멤브레인 상에서 분석물질과 항체 간 1차 면역결합체를 형성시킨 후, 이 결합체를 포획항체가 고정화된 신호발생 멤브레인 패드의 하부로 이동시키고 하부로부터 염기성 용액(0.1 M NaOH 용액)을 가하여 점진적으로 탈착시킴으로써 농축시킨 후 상부로 이동시킨다. 탈착된 1차 면역결합체는 상부의 니트로셀룰로우즈 멤브레인 상에 고정화된 포획항체와 반응하여 2차 샌드위치 면역결합체를 형성함으로써 분석물질에 비례한 발색신호를 나타내게 된다. 문제점으로써, 셀룰로우즈 멤브레인 상에 포획된 1차 면역결합체의 탈착용액은 강 염기성으로써 제2차 면역반응의 저해제로 작용하며 결국 분석민감도의 손실이 발생할 수 있다.

상기한 가역고정화 방법들의 경우 분석물질과의 반응효율을 높이기 위하여 이동성을 제한하였던 신호발생원을 다시 시료의 흐름과 함께 상부로 이동하게 하여 주기 위해서는 강산 또는 강염기와 같은 면역반응에 부정적으로 작용하는 물질을 사용하여야 하는 문제점을 갖고 있다.

본 발명은, 상기에서 언급한 전통적인 면역 크로마토그래피 분석시스템 가지는 성능제한의 문제점과 이를 개선한 가역고정화 방법의 문제점을 일시에 해결하여면역결합체 형성율을 극대화시킴과 동시에 고감도 분석성능을 성취할 수 있는 새로운 면역 크로마토그래피 분석기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템의 구성과 그 배열을 나타내는 모식도이다(A:전면, B:측면).

도 2는 본 발명의 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템의 케이스 상판과 하판을 예를 들어 나타낸 모식도이다(A:상판, B:하판).

도 3은 케이스 하판에 위치하는 자석의 수직이동틀에 대한 모식도로써 A는 콘쥬게이트의 이동성을 제한하여 분석물질과의 1차 면역결합체를 형성 시킬 때의 자석의 위치를 예시한 것이며, B는 콘쥬게이트를 방출시켜 신호발생 멤브레인 패드로 이동 시킬 때의 자석의 위치 예시한 것이다.

도 4는 본 발명의 주안점인 신호발생원으로 사용하는 콘쥬게이트의 가역고정화를 이용한 분석원리를 보여주는 모식도이다. 도면에서 A는 시료의 흡수 및 면역반응 진행방향을 나타낸다. B는 신호발생원인 마그네틱 비드-탐지항체 콘쥬게이트가 자력에 의해 콘쥬게이트 축적용 패드 상에 고정된 상태에서 분석물질과의 면역결합체 형성과정을 나타낸다. C는 형성된 1차 면역결합체가 자석의 위치이동에 따른 자력의 해제로 인하여 시료용액의 흐름과 함께 멤브레인 상부로 이동하는 공정을 나타내며, D는 신호발생 멤브레인 패드 상에 고정화된 포획항체에 의해 2차 면역결합체가 형성되어 발색신호가 나타나는 공정을 나타낸다.

도 5는 신호발생원으로 사용한 마그네틱 비드와 항체의 중합방법 모식도이다.

도 6은 본 발명의 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템에 관한 실시예 5에 있어서, 분석물질(인간 혈청 알부민)의 농도에 따른 발색신호를 광학 색조밀도(optical density) 측정치로 변환하여 비교한 것이다.

도 7은 실시예 6에서 면역결합체 형성 효율 향상을 위해 시도한 콘쥬게이트 축적용 패드의 기하학적 형태에 따른 발색신호를 비교하여 나타낸 것이다.

도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

10 : 시료첨가용 멤브레인 패드

20 : 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드

21 : 표지물질

22 : 탐지항체

23 : 자석

30 : 신호발생용 멤브레인 패드

31 : 포획항체

40 : 용액흡수용 멤브레인 패드

50 : 케이스 상판

51 : 시료투입구

52 : 케이스 상판 앞면의 자석고정틀

53 : 결과표시창

60 : 케이스 하판

61 : 케이스 하판 내부의 멤브레인 스트립 고정틀

62 : 케이스 하판 뒷면의 자석의 수직이동틀

본 발명은 시료첨가용 멤브레인 패드(10), 표지물질과 탐지용 감응성분을 포함하며 자력에 의하여 고정될 수 있는 콘쥬게이트가 축적되는 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20), 포획용 감응성분이 고정화되어 있는 신호발생용 멤브레인 패드(30) 및 용액흡수용 멤브레인 패드(40)를 포함하며, 신호발생용 멤브레인 패드(30)의 세로방향 양끝에 길이로 패드(40)과 패드(20)이 부분적으로 포개어 고정되고 패드(20)의 끝에 길이로 패드(10)이 부분적으로 포개어 고정되는 세로배열을 가지면서, 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20) 상에 자석(23)이 위치하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템에 관한 것이다.

상기에서 자석(23)은 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20)의 앞면, 뒷면 또는 앞뒷면에 부착될 수 있다.

또한, 케이스가 있는 경우에는 세로배열로 고정된 멤브레인 스트립이 케이스의 내부에 고정되고 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20)가 위치하는 지점의 케이스 상판(50), 하판(60) 또는 상판(50)과 하판(60)에 자석(23)이 구비될 수도 있다.

구체적으로 본 발명은 세로배열로 고정된 멤브레인 스트립이, 케이스 상판(50)에 시료투입구(51)와 결과표시창(53)을 갖고 시료투입구(51)와결과표시창(53) 사이에 자석을 탈부착할 수 있는 자석고정틀(52)을 구비하며, 케이스의 하판(60) 내부에 멤브레인 스트립 고정틀(61)과 뒷면에 자석을 이동 또는 고정시킬 수 있는 수직이동틀(62)을 갖춘 케이스에 고정되고, 자석(23)이 자석고정틀(52) 및 수직이동틀(62)에 구비되는 시스템으로 구현될 수 있다.

상기에서 케이스 하판(60) 뒷면의 수직이동틀(62)에 구비된 자석(23)은 이동성 틀을 사용하기 때문에 케이스 내부에 고정된 시료첨가용 멤브레인 패드(10)에서 부터 용액흡수용 멤브레인 패드(40)에 이르는 멤브레인 스트립의 전범위에 걸쳐서 상하로 이동 또는 고정이 가능하며, 케이스 상판(50)의 자석고정틀(52)의 경우에도 자석의 탈부착이 가능하다.

따라서, 본 발명은 분석시스템에 부착하는 자석(23)의 갯수, 자력의 세기 및 자석(23)의 위치 중 어느 하나 이상을 조절함으로써 표지물질과 탐지용 감응성분의 콘쥬게이트의 이동성을 조절하여 면역결합체 형성 효율을 극대화 시킬수 있다.

상기에서 케이스에 설치되는 탈부착이 가능한 자석고정틀(52) 및 상하로 이동 또는 고정이 가능한 수직이동틀(62)은 일반적으로 알려진 기술을 채용하여 설치될 수 있다.

상기 패드들에 사용될 수 있는 재료는 각 패드의 목적에 부합되는 것이라면 어떠한 재료라도 사용할 수 있으며 그의 대표적인 예로서는 시료첨가용 멤브레인 패드(10) 및 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20)는 유리섬유 멤브레인을, 신호발생용 멤브레인 패드(30)는 니트로셀룰로우즈 멤브레인을, 그리고 용액흡수용 멤브레인 패드(40)는 셀룰로우즈 멤브레인을 사용할 수 있다.

상기에서 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20)는 전체(도 7, B) 또는 시료첨가용 멤브레인 패드(10)와 접하는 하부(도 7, A)가 시료의 흐름에 따라 점차 좁아지는 사다리꼴 형태로 구성될 수 있다. 이러한 형태는 분석물질이, 신호발생원(콘쥬게이트)이 축적된 지역을 통과할 때 폭이 점차 좁아지는 제한된 구역을 지나게 함으로써 분자간의 확산에 의한 충돌 빈도를 증가시키고 이에 의하여 면역결합체 형성을 극대화 시킬 수 있다.

상기에서 탐지용 감응성분은 분석물질과 특이적으로 반응하는 물질이며 그 예로는 항체, 효소, 수용체, DNA 등을 들 수 있다. 또한 포획용 감응성분은 분석물질과 특이하게 반응하거나, 분석물질을 포함하는 결합체에 포함된 어느 성분과 특이적으로 반응하는 물질이며 그 예로는 항체, 효소, 수용체, DNA 등을 들 수 있다. 따라서 본 발명의 분석원리와 이를 응용한 분석시스템은 항원-항체 반응에 기초한 면역 분석뿐만 아니라 효소반응과 핵산접합반응을 탐지하는 효소 및 유전자 분석시스템 개발에 적용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 콘쥬게이트는 자석에 의하여 고정될 수 있는 것이어야 하며, 이러한 성질은 콘쥬게이트에 포함되는 어느 한 성분이 그러한 성질을 가짐으로써 성취될 수 있다.

본 발명에서 콘쥬게이트로는 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트를 사용할 수 있다. 표지물질로 사용된 마그네틱 비드는 갈색의 색깔을 가지는 유색 표지물질로서 자석에 의해 고정될 수 있기 때문에 항체와 콘쥬게이트를 형성시키면 본 발명에서 사용하기에 적합한 성질을 가지는 콘쥬게이트가 된다. 다만, 마그네틱 비드는 전통적 표지물질인 콜로이드 골드에 비해 직경이 매우 크며 그에 따른 공간적 저해로 유체 측면 흐름 및 면역결합체 형성에 부정적 작용을 할 수 있다. 이와 같은 문제점을 극복하기 위해 본 발명에서는 마그네틱 비드 콘쥬게이트의 크기 조절과 신호발생패드의 세공크기를 고려한 선별, 그리고 콘쥬게이트의 이동성 향상을 위한 콘쥬게이트패드의 전처리 방법을 이용하였다.

본 발명에서는 표면에 아민(amine, -NH2), 카르복실(carboxyl, -COOH), 알데히드(aldehyde, -CHO) 또는 치올(thiol, -SH) 등 기능성 그룹을 가지며 중합방법의 선택에 따라 탐지용 감응성분(탐지항체, 효소, 수용체, DNA 등)과 다양한 화학반응을 이용하여 결합시킬 수 있는 마그네틱 비드를 사용한다.

또한, 마그네틱 비드는 분석장치 내에서의 이동성, 감응성 단백질과의 중합효율성 등을 고려하여 입자크기가 0.1-10 ㎛인 것이 사용될 수 있으며, 인공적으로 합성하거나 마그네틱 입자를 생산하는 세포(박테리아)로부터 얻을 수 있다.

상기에서 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트는 음파처리기(sonicator)로 균질화 처리하여 콜로이드 형태로 존재하게 함으로써 신호발생 멤브레인 패드(30)의 세공 내에서의 이동성 저하를 최소화 하게 할 수 있다. 또한, 콘쥬게이트의 이동성 효율을 높이기 위하여 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20) 또는 콘쥬게이트에 트레할로즈(trehalose), 슈크로즈(sucrose)등 당류 또는 카제인, 우혈청 알부민 등 단백질을 첨가처리 하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 표지물질과 탐지용 감응성분을 포함하며 자력에 의하여 고정될 수 있는 콘쥬게이트를 사용하고 콘쥬게이트의 이동성을 조절하기 위해 자석을 추가로 도입한 것 등을 제외한 전반적인 발명의 구성은 전통적 면역 크로마토그래피 분석시스템과 동일하다.

본 발명은 일정시간 내에 면역 반응성분들(항원-항체 반응 등)간의 충돌 확률을 증가시키도록 고안되었다. 표지물질과 탐지용 감응성분의 콘쥬게이트를 일정지역에 고정화 시키면 분석물질을 포함하는 시료가 멤브레인의 측면흐름을 따라 상부로 이동하면서 충돌에 의한 항원-항체 반응이 일어나도록 유도된다. 상기의 콘쥬게이트와 분석물질이 결합하여 면역결합체를 형성한 후 고정화를 위해 가한 힘을 제거하면 면역결합체는 시료용액에 의해 상부로 운반되고 기존 시스템에서와 같이 포획용 감응성분과 2차 면역결합체를 형성한다. 이와 같이 본 발명은 신호발생원인 콘쥬게이트(표지물질과 탐지용 감응성분)의 고정화(또는 부동화)와 이동성을 가역적으로 조절하는 것이 가능한 가역고정화 분석시스템을 제공한다.

종래의 가역고정화 방법들의 경우 분석물질과의 반응효율을 높이기 위하여 이동성을 제한하였던 신호발생원을 다시 시료의 흐름과 함께 상부로 이동하게 하여주기 위해서는 강산 또는 강염기와 같은 면역반응에 부정적으로 작용하는 물질을 사용하여야 하는 반면, 본 발명에서 제시하는 자석과 마그네틱 비드간의 자력을 이용한 가역고정화 분석시스템의 경우 콘쥬게이트의 고정화와 이동을 조절하는데 있어서 단지 자석의 위치이동 만을 이용하므로 방법이 간단하며 면역반응에 전혀 부정적인 영향을 미치지 않는다는 장점을 갖는다.

자력을 이용한 가역고정화 시스템

분석초기에 마그네틱 비드의 이동을 제한하기 위해 콘쥬게이트패드 뒤쪽에 자석을 위치시킨다. 분석물질을 포함하는 시료를 멤브레인 스트립의 하단에 가하면 모세관 현상에 의해 분석물질이 상부로 이동한다(도 4, A). 콘쥬게이트 축적용 패드에 도달하면 분석물질은 마그네틱 비드에 중합시킨 탐지항체와 특이적으로 결합하고 결국 시료용액 내의 다른 물질과는 분리된다(도 4, B). 탐지항체와 분석물질간의 결합반응에 의해 형성된 면역결합체는 콘쥬게이트 축적용 패드의 뒤쪽에 위치한 자석을 제거하면 시료용액의 흐름을 따라 상부로 이동한다(도 4, C). 면역결합체가 신호발생용 패드에 도달하면 이곳의 일정지역에 고정화된 포획항체와 반응하여 결국 샌드위치 형태의 면역결합체를 형성하게 된다(도 4, D). 포획된 면역결합체는 신호발생원으로 갈색의 색깔을 가지는 마그네틱 비드를 포함하고 있으므로 분석물질에 비례한 발색신호를 나타내게 된다.

신호발생원의 가역고정화를 위한 자석의 이동

항원과 항체간의 면역결합체 형성 효율을 극대화하기 위해 고정화한 콘쥬게이트는 이후 시료용액의 흐름과 함께 상부로 이동하여 포획항체와 2차 면역결합체를 형성하여 분석신호를 발생시키기 위해서 콘쥬게이트의 고정화를 위해 가하였던 자력의 해제가 필요하다. 이를 위해 본 발명에서는 자석의 수직이동틀을 제작하였으며, 콘쥬게이트 축적용 패드에 대해 일정시간 동안 자력을 적용한 후 자석을 이동시켜 자력의 영향에서 벗어나도록 제작하였다.

마그네틱 비드와 항체의 중합

면역분석용으로 마그네틱 비드는 직경 크기를 기준으로 0.1-10 ㎛ 범위의 것들이 사용될 수 있으며 단백질 등과의 중합을 위해 표면에 카르복실 또는 아미노 기능성 그룹 등 반응활성기를 가지고 있다. 면역분석에 마그네틱 비드를 사용하기 위해서는 항체와의 효과적인 중합이 필요하다. 중합방법의 선택에서 비드 표면의 기능성 그룹을 고려하여야 하며 다양한 중합방법들이 보고 되고 있다.

마그네틱 비드와 단백질(항체, 효소 등)을 중합하는 방법으로는, 물리적으로 항체와 마그네틱비드를 중합시키는 방법(참고문헌: Tokairin 등, 2002,Journal of Hepatology, Vol. 36, Page 725-733; Matsunaga 등, 1999,Journal of Magnetism and Magnetic Materials, Vol. 194, Page 126-131), 카르복실기 그룹을 가지는 마그네틱 비드에 EDC를 사용하여 항체를 화학 중합시키는 방법, 아민 그룹을 가지는 마그네틱 비드에 글루타알데히드를 사용하여 항체를 중합시키는 방법참고(참고문헌: Nakamura 등, 1991,Analytical Chemistry, Vol. 63, Page 268-272), 마그네틱 비드를 SPDP로 처리하고 항체는 20 mM DTT를 사용하여 환원처리 한 후 중합시키는 방법(참고문헌: Nakamura 등, 1993,Analytical Chemistry, Vol. 65, Page 2036-2039), 항체는 SMCC로 처리하고 아민 그룹을 가지는 마그네틱 비드는 SPDP로 처리한 후 중합하는 방법(참고문헌: Matsunaga 등, 1996,Analytical Chemistry, Vol. 68, Page 3551-3554), 그리고 아민 그룹을 가지는 마그네틱 비드에 비오틴을 중합시키고 이를 사용하여 항체-스트렙트아비딘 콘쥬게이트와 다시 결합시키는 방법(참고문헌: Yoshino 등, 2003,Biosensors and Bioelectronics, Vol. 18, Page 661-666) 등이 사용될 수 있다.

이와 같은 다양한 중합방법 중 콘쥬게이트의 응집이 최소화 되는 가장 안정된 방법으로 다음과 같은 방법이 이용될 수 있다.

먼저, 마그네틱 비드와 항체의 중합을 위한 연결 화학물질로 2개의 말레이미드(maleimide) 기능성 그룹을 가지는 SMCC를 사용하여 아미노 그룹을 가지는 마그네틱 비드와 1차 반응시키고, 중합할 항체는 환원제 처리에 의해 Fab' 형태로 절단시켜 황화수소 그룹(R-SH)이 노출되게 한 후 비드와 중합된 SMCC의 잔여 말레이미드(maleimide) 기능성 그룹과 결합시킨다(도 5 참조).

마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트의 균질화

면역 크로마토그래피 분석시스템에서 분석민감도와 분석시간을 좌우하는 주요 인자로는 신호발생패드의 세공크기 이다. 일반적으로 세공크기가 큰 신호발생패드의 경우 분석시간은 단축될 수 있으나 분석민감도는 감소한다. 본 발명에서 신호발생원으로 사용한 마그네틱 비드의 경우 전통적인 방법에서 많이 사용되고 있는 콜로이드 골드와 비교 시 직경의 크기가 훨씬 크므로 특히 탐지항체와 중합한 후 콘쥬게이트의 응집을 최소화 하고 크기를 균질화 할 필요가 있다. 이를 위해 중합이 완료된 콘쥬게이트를 음파처리기(sonicator)를 사용하여 콘쥬게이트를 균질화 처리하였다. 마그네틱 비드와 항체의 중합반응을 완료한 이후에 콘쥬게이트를 추가적으로 초음파 처리할 경우 콘쥬게이트의 응집에 의한 침전현상이 크게 개선되었으며 니트로셀룰로우즈 멤브레인 상에서의 전개과정에서 세공을 막히게 하는 등의 문제점이 발생하지 않는 것으로 나타났다.

본 발명의 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템 응용 및 전망

자석을 이용하여 신호발생원인 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트의 이동성을 조절하여 면역결합체 형성율을 증가시키면 분석성능이 현저히 향상된다. 일반적으로 면역 크로마토그래피 분석시스템에서 분석시간을 단축시킬 목적으로 세공의 크기가 큰 멤브레인을 사용하면 분석민감도의 희생이 발생하며 분석민감도를 향상시키기 위해 세공의 크기가 작은 멤브레인을 사용하면 분석의 지체를 유발하게 된다. 이의 해결방안으로써 본 발명에서 제시한 표지물질-탐지항체 콘쥬게이트의 가역 고정화 시스템을 도입할 경우 분석시간의 증가 없이 분석민감도의 향상이 가능하게 된다. 역으로, 분석민감도의 희생 없이 분석시간의 단축을 필요로 하는 분석시스템의 개발에도 유용할 것으로 전망된다. 그 응용분야로써, 질병 및 신체증세의 지표물질로 이용되는 생체성분(예: 호르몬, 단백질, 세포 등)의 분석뿐만 아니라 식품 위해인자(예: 농약, 항생제, 식중독균 등)와 환경호르몬(예: 제초제, 살충제, 다이옥신류 등) 등 거의 무제한한 분석물질의 탐지에도 적용될 수 있다.

다음의 실시예는, 상기에서 설명된 발명의 내용을 예로써 보완하고 그 유용성을 제시하기 위해서 신부전증 진단에 사용될 수 있는 뇨에서 검출되는 인간 혈청 알부민에 대해 본 발명을 실시한 것이다. 따라서, 하기의 실시예가 본 발명의 응용분야 혹은 제조조건을 제한하는 것은 아니다.

실시예에 사용된 재료

실시 예를 위해 사용된 재료 및 그 구입처는 다음과 같다. 아민 그룹 처리된 마그네틱 비드(amine-terminated magnetic bead), 인간 혈청 알브민(human serum albumin, HSA), 염화 골드(HAuCl4), 글루타알데히드, 카제인(sodium salt form, extracted from milk), 트레할로즈(trehalose) 등은 시그마(Sigma, 미국) 사로부터 구입되었다. HSA에 대해 특이한 염소 항혈청(IgG fraction, 8.3 mg/mL)은 클리니콰(Cliniqa, 미국) 사로부터 공급받았다. 니트로셀룰로우즈(NC) 멤브레인(5, 8, 12 ㎛ pore size, with polyester backing)은 와트만(Whatman, 싱가포르) 사로부터, 유리섬유 멤브레인(Quick release pad)은 밀리포어(Millipore, 미국) 사, 그리고 셀룰로우즈 멤브레인(3MM chromatography grade)은 와트만(Whatman, 싱가포르) 사로부터 구입되었다. 명시하지 않은 다른 시약들은 모두 분석용 등급으로 선택되었으며, 완충용액 등 모든 용액은 탈이온수를 이용하여 제조되었다.

실시예 1. HSA에 대한 항체의 정제

인간혈청 알브민(HSA) 특이 항혈청을 정제하기 위해 친화 크로마토그래피 방법을 이용하였다. 세팔로스(Sepharose) 4B 젤 상에 HSA를 고정화하였고. 제조된 젤은 유리칼럼(11 x 200 mm, 젤 부피 7 mL) 내에 채워졌다. HSA 특이 항혈청 3 mL를 칼럼에 주입하였고 정제공정은 액체 크로마토그래피 시스템(Model 210, Isco, Lincoln, NE, 미국)을 이용하여 수행되었다. 젤 상에 고정화된 HSA와 결합하지 않은 미반응 단백질은 15 mL/h의 속도로 유출되는 PBS에 의해 세척되었고, 반응한 HSA 특정항체는 0.1 M 글리신(glycine) 완충용액(pH 3.0)을 사용하여 유출되었다. 수집된 항체는10 mM PBS 내에서 투석되었다. 이와 같이 정제된 항체용액은 한외여과(ultrafiltration) 장치(Amicon, Beverly, MA, 미국) 과정에 의해 농축된 후 브렛퍼드(Bradford) 분석방법을 이용하여 정량되었고(참고문헌: M. M. Bradford, 1976,Analytical Biochemistry, Vol. 72, Page 248-254), 급속 냉동 후 사용 시까지 -20℃에서 보관되었다.

실시예 2. 항체-마그네틱 비드 콘쥬게이트 합성

신호발생원의 가역적 고정화를 위해 표지물질로 마그네틱 비드를 사용하여 정제된 HSA 항체와 중합을 수행하였다. 마그네틱 비드는 10 mM 인산 완충용액(pH7.4)을 사용하여 1 mg/mL 농도로 희석한 후(2 mL) 초음파세척기를 사용하여 10분씩 3회 초음파 처리하였다. 여기에 DMSO에 용해시킨 10 mg/mL SMCC를 50 ㎕를 첨가한 후 상온에서 1시간 반응하였다. 과량의 SMCC 제거를 위하여 자석을 사용하여 용액을 제거한 후 10 mM 인산 완충용액을 사용하여 재현탁하였고, 이를 2회 추가 반복하여 SMCC를 완전히 제거하였다. 마그네틱 비드에 중합할 항체(2 mg/mL, 200 ㎕)는 100 mM DTT(5 mM EDTA를 포함하는 10 mM 인산완충용액에 용해시켰음) 22 ㎕를 첨가하여 상온에서 2시간 환원처리 하였다. 과량의 DTT 제거를 위하여 세파덱스(Sephadex) G-15 젤 칼럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 0.25 mL씩 분획을 받은 후 브렛퍼드(Bradford) 분석방법을 사용하여 단백질 총 농도 분석을 수행하였고 활성분획을 SMCC 처리한 마그네틱 비드와 혼합하였다. 4 에서 10시간 반응하여 중합을 유도하였다. 마그네틱 비드의 잔여표면은 5% 카제인이 포함된 0.1 M 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.6, 5% 카제인-Tris) 1 mL를 가한 후 4 에서 15시간 동안 블로킹되었다. 반응액은 자석을 사용하여 제거되었고, 0.5 % 카제인-트리스가 다시 첨가되었다. 자력분리에 의해 마그네틱 비드와 항체의 콘쥬게이트를 다시 분리하여 용액을 제거하였다. 최종부피는 0.5% 카제인-트리스를 첨가하여 0.4 mL로 조절되었으며 콘쥬게이트를 콜로이드 상태로 유지시키기 위하여 음파처리기(sonicator)를 사용하여 10분씩 10회 음파처리(sonication) 하였다. 합성된 콘쥬게이트는 사용 시까지 4℃에서 보관되었다.

실시예 3. 신호발생패드 상에 항체 고정화:

HSA에 대해 정제된 항체는 NC 멤브레인 스트립(5 x 20 mm)의 미리 정해진 지점에 화학적으로 고정화되었다. 멤브레인을 0.5%(v/v) 글루타알데히드 용액에 담가 표면을 1시간 동안 처리하였고 10 mM 인산 완충용액을 사용하여 10분씩 3회 세척하였다. 37℃가 유지되는 항온기에서 30분간 건조시킨 후 멤브레인 상의 일정지역에 10 mM 인산 완충용액으로 희석한 1 mg/mL 항체 1 ㎕를 점적한 후 100% 습도를 유지할 수 있는 밀폐된 상자 안에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 잔여 반응기의 불활성화 및 고체표면의 블로킹은 0.5% 카제인 용액을 사용하여 1시간 동안 수행되었고 0.1% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 포함하는 0.1 M 트리스 완충용액을 사용하여 30분간 세척한 후 다시 건조되었다.

실시예 4. 콘쥬게이트패드 전처리 및 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트 축적

신호발생원의 이동성을 최적화하기 위해 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드를 전처리 하였다. 유리섬유 멤브레인(5 x 20 mm)에 0.1% 트로톤 X-100을 포함하는 0.5% 카제인 용액을 사용하여 10분 간 처리한 후 37℃ 가 유지되는 건조기에서 1시간 건조하였다. 신호발생원인 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트는 트레할로즈를 최종농도 10%가 되도록 첨가하였고 이를 10 ㎕씩 콘쥬게이트패드에 축적시켰다.

실시예 5. 자력을 이용한 가역고정화 분석시스템

새로운 개념의 가역고정화 분석시스템에 있어서 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트의 이동성을 조절하는 역할을 하는 자석의 자기장 세기에 따른 분석민감도의변화를 시험하였다(도 6). 시험에 사용한 신호발생패드로는 세공크기 8 ㎕의 NC 멤브레인을 사용하였으며 항체를 고정화 한 후 잔여표면은 0.5% 우혈청 알부민 용액을 사용하여 처리하였다. 시험방법으로 동일한 크기의 자석(5×10 mm)을 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드의 뒷쪽(단일자석, 도 6) 혹은 앞, 뒷 쪽(이중자석, 도 6)에 배치하여 콘쥬게이트의 이동성을 제한하는 정도에 따라 분석물질의 포획효과를 시험하였다. 시험결과 자석을 도입하여 가역고정화 시스템을 적용한 경우 전반적으로 전통적 방법에 비해 분석민감도가 50% 이상 향상된 것으로 나타났으며 특히, 자석을 1개만 배치한 것보다 2개를 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드의 앞과 뒤로 배치한 경우에 발색신호가 2배 이상 우수한 것으로 나타났다. 이는 보다 강한 자력으로 콘쥬게이트의 이동을 최소화시킴으로써 분석물질(항원)과의 충돌 반응 효율이 높아져서 면역결합체 형성이 증대되었기 때문으로 판단된다.

실시예 6. 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드의 기하학적 형태

면역결합체 형성 효율을 높임으로써 분석민감도를 높일 목적으로 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드의 하부를 상단보다 넓게 디자인 하여 항원-항체간의 혼합 향상을 시도하였다(도 7). 콘쥬게이트패드의 형태 및 길이에 따른 발색신호를 비교한 결과 사다리꼴 형태의 콘쥬게이트패드 디자인 도입 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이는 분석물질이 신호발생원 축적된 지역을 통과함에 있어서 폭이 점차 좁아지는 제한된 구역을 지나게 됨으로써 분자간의 확산에 의한 충돌 빈도가 증가하여 면역결합체 형성에 긍정적 작용을 하였기 때문으로 판단된다.

비교예 1. 가역고정화 분석시스템에서 신호발생원으로 CBD의 사용

CBD는 셀룰로즈에 특이적으로 결합하는 단백질로서 주된 결합력은 수소결합에 기인하며 알칼리성 용액을 가할 경우 결합체는 떨어지게 된다. 이를 응용하기 위해 신호발생원으로서 콜로이드 골드-항체 콘쥬게이트에 CBD를 추가 중합시킨 후 이것을 셀룰로즈 멤브레인 상에 부착반응에 의해 고정화 시켰다. 분석시료 수용액을 가하여 셀룰로즈 멤브레인 상에서 분석물질과 항체 간 1차 면역결합체를 형성시킨 후, 이 결합체를 포획항체가 고정화된 신호발생패드의 하부로 이동시켰고 하부로부터 염기성 용액(0.1 M NaOH 용액)을 가하여 점진적으로 탈착시킴으로써 농축시킨 후 상부로 이동시켰다. 탈착된 1차 면역결합체는 상부의 NC 멤브레인 상에 고정화된 포획항체와 반응하여 2차 샌드위치 면역결합체를 형성함으로써 분석물질에 비례한 발색신호를 나타내게 된다.

실시예 7. 광학색조밀도 측정방법을 이용한 발색신호의 정량 분석과정

상기한 바와 같이 제조된 면역스트립을 이용한 분석시스템의 HSA 표준용액에 대한 농도응답은 발생된 발색신호의 스캐닝 광학측정방법에 의해 구하였다. HSA 표준용액은 10 mM PBS 용액으로 제조되었고 각 농도별로 150 ㎕씩 마이크로웰(microwell)에 분주되었다. 각 마이크로웰 내에 면역스트립의 하단을 수직으로 담가 위치시킨 후 수용액을 약 15분에 걸쳐 모세관현상에 의해 스트립 내부로 흡수시켰고, 항체가 고정화된 영역에서 발색된 신호를 정량적으로 결정하기 위해 스캐너(HP ScanJet 6100C, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, 미국)를 이용하였다. 발색된 스트립을 스캐닝 한 다음 컴퓨터에 내장된 스캐닝 보드(board)와 소프트웨어(Biomed Instruments, 미국)를 이용하여 멤브레인 이미지를 포착하였다. 포착된 이미지 상의 발색부분은 이미지 분석프로그램(Multianalyst version 1.1, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, 미국)을 이용하여 발색부분이 모두 포함되도록 선택한 후 발색세기에 비례하는 적분치인 광학 색조밀도(optical density)로 전환되었다. 측정된 광학 색조밀도를 분석물질의 농도에 대해 도식한 결과 광학밀도는 전반적으로 육안으로 인지된 색조에 비례하였고 분석물질 농도에 대해서도 비례하는 것으로 관찰되었다.

본 발명은 전통적인 면역 크로마토그래피 분석시스템시스템이 가지는 성능제한의 문제점과 이를 개선한 가역고정화 방법의 문제점을 일시에 해결하여 면역결합체 형성율을 극대화시킴과 동시에 고감도 분석성능을 성취할 수 있는 새로운 면역 크로마토그래피 분석기술을 제공한다.

Claims (15)

1. 시료첨가용 멤브레인 패드(10), 표지물질과 탐지용 감응성분을 포함하며 자력에 의하여 고정될 수 있는 콘쥬게이트가 축적되는 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20), 포획용 감응성분이 고정화되어 있는 신호발생용 멤브레인 패드(30) 및 용액흡수용 멤브레인 패드(40)를 포함하며, 신호발생용 멤브레인 패드(30)의 세로방향 양끝에 길이로 패드(40)과 패드(20)이 부분적으로 포개어 고정되고 패드(20)의 끝에 길이로 패드(10)이 부분적으로 포개어 고정되는 세로배열을 가지면서, 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20) 상에 자석(23)이 위치하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
2. 제1항에 있어서, 자석(23)이 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20)의 앞면, 뒷면 또는 앞뒷면에 부착되는 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
3. 제1항에 있어서, 세로배열로 고정된 멤브레인 스트립이 케이스의 내부에 고정되고 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20)가 위치하는 지점의 케이스 상판(50), 하판(60) 또는 상판(50)과 하판(60)에 자석(23)이 구비되는 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
4. 제3항에 있어서, 시료투입구(51)와 결과표시창(53)을 갖고 시료투입구(51)와 결과표시창(53) 사이에 자석을 탈부착할 수 있는 자석고정틀(52)을 구비한 케이스 상판(50)과 내부에 멤브레인 스트립 고정틀(61)과 뒷면에 자석을 이동 또는 고정시킬 수 있는 수직이동틀(62)을 갖춘 케이스 하판(60)에 각각 자석(23)이 구비되는 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
5. 제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서, 분석시스템에 부착하는 자석(23)의 갯수, 자력의 세기 및 자석(23)의 위치 중 하나 이상을 조절함으로써 표지물질과 탐지용 감응성분을 포함하는 콘쥬게이트의 이동성을 조절하여 면역결합체 형성 효율을 극대화 시키는 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
6. 제1항에 있어서, 시료첨가용 멤브레인 패드(10) 및 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20)는 유리섬유 멤브레인이고, 신호발생용 멤브레인 패드(30)는 니트로셀룰로우즈 멤브레인이고, 용액흡수용 멤브레인 패드(40)는 셀룰로우즈 멤브레인인 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
7. 제1항에 있어서, 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20)는 전체(도 7, B) 또는 시료첨가용 멤브레인 패드(10)와 접하는 하부(도 7, A)가 시료의 흐름에 따라 점차 좁아지는 사다리꼴 형태인 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
8. 제1항에 있어서, 탐지용 감응성분이 분석물질과 특이적으로 반응하는 항체, 효소, 수용체, 또는 DNA인 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
9. 제1항에 있어서, 포획용 감응성분이 분석물질과 특이적으로 반응하거나, 분석물질을 포함하는 결합체의 어느 성분과 특이적으로 반응하는 항체, 효소, 수용체, 또는 DNA인 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
10. 제1항에 있어서, 콘쥬게이트가 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트인 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
11. 제10항에 있어서, 마그네틱 비드는 표면에 아민기, 카르복실기, 알데히드기 또는 치올(thiol)기를 가지고 중합방법의 선택에 따라 탐지용 감응성분과 다양한 화학반응을 이용하여 결합시킬 수 있는 것임을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
12. 제10항에 있어서, 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트는 마그네틱 비드와 항체의중합을 위한 연결 화학물질로 2개의 말레이미드(maleimide) 기능성 그룹을 가지는 SMCC를 사용하여 아미노 그룹을 가지는 마그네틱 비드와 1차 반응시키고, 중합할 항체를 환원제 처리에 의해 Fab' 형태로 절단시켜 황화수소 그룹(R-SH)이 노출되게 한 후 비드와 중합된 SMCC의 잔여 말레이미드(maleimide) 기능성 그룹과 결합시켜서 중합된 것임을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
13. 제10항에 있어서, 마그네틱 비드는 분석장치 내에서의 입자크기가 0.1-10 ㎛이며, 인공적으로 합성되거나 마그네틱 입자를 생산하는 세포(박테리아)에서 얻어진 것임을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
14. 제10항에 있어서, 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트는 음파처리기(sonicator)로 균질화 처리하여 콜로이드 형태로 존재하게 함으로써 신호발생 멤브레인 패드(30)의 세공 내에서의 이동성 저하를 최소한 것임을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.
15. 제10항에 있어서, 마그네틱 비드-항체 콘쥬게이트의 이동성 효율을 높이기 위하여 콘쥬게이트 축적용 멤브레인 패드(20) 또는 콘쥬게이트에 당류 또는 단백질을 첨가처리 하는 것을 특징으로 하는 고감도 멤브레인 스트립 크로마토그래피 분석시스템.