JPH11118801A - 免疫分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 この発明は、従来の免疫分析装置における対
照領域を改良し、被検試料液の検出領域通過を被検試料
液のｐＨや被検試料液中の分析対象物の量に影響される
ことなく判定できる、クロマトグラフィストリップを有
する免疫分析装置を提供することを目的とする。 【解決手段】 分析対象物を含む可能性がある被検試料
液が添加される試料添加領域及び上記被検試料液中の上
記分析対象物を検出する検出領域を少なくとも有するク
ロマトグラフィストリップを有し、ビオチン又はビオチ
ン誘導体及び糖リガンド又は糖リガンド誘導体から選ば
れる化合物Ａとアビジン又は抗ビオチン抗体及び糖結合
性蛋白質から選ばれる化合物Ｂとからなり化合物Ａと化
合物Ｂは特異的に結合するものである結合対のいずれか
一方の化合物が固定されている対照領域を上記検出領域
の下流にさらに有し、かつ上記被検試料液中に着色微粒
子と上記結合対の他の一方の化合物との複合体が含まれ
るように設けられていることを特徴とする免疫分析装
置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、被検試料液中の
分析対象物の有無又は量を免疫反応を利用して検出又は
測定するための、クロマトグラフィストリップを有する
免疫分析装置に関する。詳しくは、被検試料液が分析対
象物の検出領域に到達したか否かを判定するためにクロ
マトグラフィストリップ中に設けられている対照領域の
改良に関する。

【０００２】

【従来の技術】よく知られているように、クロマトグラ
フィストリップを有する免疫分析装置は、クロマトグラ
フィストリップの一端に設けられた被検試料液が添加さ
れる試料添加領域と、その下流に設けられた被検試料液
中の分析対象物を検出するための検出領域とを、少なく
とも有する。また、クロマトグラフィストリップは、そ
の中を、試料添加領域に添加された被検試料液が後記ト
レーサー等の分析試薬と被検試料液中の分析対象物と共
に毛細管流により移動できるように、設けられている。

【０００３】検出領域は、そこに到着した被検試料液中
の分析対象物の有無又は量に応じて発色するように設け
られている。したがって、検出領域の発色程度に応じて
被検試料液中の分析対象物の有無又は量を検出又は測定
することができる。

【０００４】このような免疫分析用クロマトグラフィス
トリップは、特開昭６１−１４５４５９、特開昭６４−
３２１６９、特開平１−１１３６６２、特開平１−２４
４３７０、特開平１−６３８６５及び特表平１−５０３
１７４等に記載されていて、これらの記載も、本明細書
の記載の一部とする。

【０００５】上記免疫分析装置においては、もちろん、
検出領域に試料添加領域に添加された被検試料液が到達
しないと、被検試料液中に分析対象物が存在していても
検出領域は発色しない。そこで、被検試料液が検出領域
を通過したことを知るために、検出領域の下流に対照領
域を設けて、試料液体が対照領域に到達したら、対照領
域が発色するようにされている。例えば、対照領域には
ｐＨ指示薬を固定し、試料液のｐＨにより発色させる。
あるいは、対照領域にトレーサーが有する化合物と特異
的に結合する化合物を固定し、トレーサーを対照領域に
蓄積させ、対照領域を発色させる。

【０００６】しかし、従来の免疫分析装置においては、
例えば、ｐＨ指示薬を使用した場合、被検試料液のｐＨ
により、色合いが変動したり、あるいは発色しないこと
さえもある。また、トレーサーが有する化合物と特異的
に結合する化合物を固定した場合、被検試料液中の分析
対象物の量によって対照領域のトレーサーの蓄積量が変
動し、対照領域の発色が変動するという欠点があった。
このように、従来の対照領域は、改良する必要があっ
た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、したがっ
て、従来の免疫分析装置における対照領域を改良し、改
良された対照領域を有するクロマトグラフィストリップ
を有する免疫分析装置を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、対照領域
にビオチン又はビオチン誘導体及び糖リガンド又は糖リ
ガンド誘導体から選ばれる化合物Ａとアビジン又は抗ビ
オチン抗体及び糖結合性蛋白質から選ばれる化合物Ｂと
からなり化合物Ａと化合物Ｂは特異的に結合するもので
ある結合対のいずれか一方の化合物を固定し、かつ上記
被検試料液中に着色微粒子と上記結合対の他の一方の化
合物との複合体が含まれるようにすることにより、被検
試料液が検出領域を通過したか否かを、被検試料液のｐ
Ｈや被検試料液中の分析対象物の量に影響されることな
く、正確に判別できることを知った。

【０００９】すなわち、この発明は、分析対象物を含む
可能性がある被検試料液が添加される試料添加領域及び
上記被検試料液中の上記分析対象物を検出する検出領域
を少なくとも有するクロマトグラフィストリップを有
し、ビオチン又はビオチン誘導体及び糖リガンド又は糖
リガンド誘導体から選ばれる化合物Ａとアビジン又は抗
ビオチン抗体及び糖結合性蛋白質から選ばれる化合物Ｂ
とからなり化合物Ａと化合物Ｂは特異的に結合するもの
である結合対のいずれか一方の化合物が固定されている
対照領域を上記検出領域の下流にさらに有し、かつ上記
被検試料液中に着色微粒子と上記結合対の他の一方の化
合物との複合体が含まれるように設けられていることを
特徴とする免疫分析装置である。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の免疫分析装置のクロマト
グラフィストリップは、対照領域が従来のものとは異な
る以外は、知られているクロマトグラフィストリップと
異なるものではない。すなわち、クロマトグラフィスト
リップは、分析対象物及び後記トレーサー等の分析試薬
を、分析対象物を含む可能性がある被検試料液のクロマ
トグラフィーストリップ中の毛細管流による移動によ
り、下流に移動させることができるものである。また、
クロマトグラフィストリップは、試料添加領域、試料添
加領域の下流に配置された検出領域及び検出領域の下流
に配置された対照領域を必ず有する。さらに、試料添加
領域と検出領域との間に、トレーサーが毛細管流により
移動可能なように置かれている標識領域を有することが
ある。

【００１１】分析対象物は、通常、生体試料中等に含ま
れている抗原又は抗体である。

【００１２】よく知られているクロマトグラフィースト
リップと同様、試料添加領域は、クロマトグラフィース
トリップの一端（最上流）に設けられていて、被検試料
液が添加される領域である。

【００１３】検出領域は、試料添加領域の下流に配置さ
れている、分析対象物と特異的に結合する化合物Ｃが固
定されている領域である。

【００１４】化合物Ｃをクロマトグラフィー担体に固定
するには、微小ビーズに化合物Ｃを固定して、このビー
ズをクロマトグラフィー担体に固定したり、又は化合物
Ｃをクロマトグラフィー担体に直接あるいはリンカーを
介して結合させたりする、通常の方法が使用できる。

【００１５】化合物Ｃは、分析対象物と特異的に結合す
るものであるから、分析対象物が抗原である場合には、
その抗原と反応する抗体、又は上記抗体のフラグメント
であって分析対象物である上記抗原との特異的結合能を
維持しているような化合物である。分析対象物が抗体で
ある場合には、その抗体と反応する抗原、又は上記抗原
の誘導体、上記抗原のフラグメント若しくは上記フラグ
メントの誘導体であって分析対象物である上記抗体との
特異的結合能を維持しているような化合物である。

【００１６】クロマトグラフィストリップが標識領域を
有しない場合には、トレーサーは、試料液体と共に試料
添加領域に添加される。

【００１７】トレーサーは、分析対象物と特異的に結合
する化合物Ｄを着色微粒子Ａで標識したものである。着
色微粒子Ａとしては、セレニウムコロイド等の非金属コ
ロイド、金コロイド等の金属コロイド、着色樹脂粒子、
染料コロイド及び着色リポソーム等が知られている。

【００１８】化合物Ｄは、分析対象物と特異的に結合す
るものであるから、分析対象物が抗原である場合には、
その抗原と反応する抗体、又は上記抗体のフラグメント
であって分析対象物である上記抗原との特異的結合能を
維持しているような化合物である。分析対象物が抗体で
ある場合には、その抗体と反応する抗原、又は上記抗原
の誘導体、上記抗原のフラグメント若しくは上記フラグ
メントの誘導体であって分析対象物である上記抗体との
特異的結合能を維持しているような化合物である。ま
た、化合物Ｄは、化合物Ｃと同じものであっても良い
が、異なるもの、例えば、一方が抗体であって、他方が
その抗体フラグメントであってもよい。

【００１９】化合物Ｄを着色微粒子Ａで標識するには、
知られている通常の方法が使用できる。

【００２０】クロマトグラフィストリップはさらに、ビ
オチン又はビオチン誘導体及び糖リガンド又は糖リガン
ド誘導体から選ばれる化合物Ａとアビジン又は抗ビオチ
ン抗体及び糖結合性蛋白質から選ばれる化合物Ｂとから
なり化合物Ａと化合物Ｂは特異的に結合するものである
結合対のいずれか一方の化合物が固定されている対照領
域を、検出領域の下流に有する。

【００２１】結合対は、ビオチン又はビオチン誘導体と
アビジン又は抗ビオチン抗体との対か、糖リガンド又は
糖リガンド誘導体と糖結合性蛋白質との対である。これ
ら結合対の二つの化合物は、相手と特異的に結合する。

【００２２】ビオチン誘導体としては、アビジン又は抗
ビオチン抗体と特異的に結合するすべての化合物が含ま
れる。

【００２３】糖結合性蛋白質は糖リガンドと特異的に結
合するものであり、レクチン又はセレクチン等の蛋白質
である。

【００２４】糖リガンドとしては、ガラクトース、ガラ
クトサミン、マンノース、マンノサミン、シアル酸、フ
コース、グルコース等がある。

【００２５】糖リガンド誘導体は、上記糖リガンドの糖
を含み、上記糖結合性蛋白質と特異的に結合するすべて
の化合物が含まれる。

【００２６】上記結合対のいずれか一方の化合物をクロ
マトグラフィ担体に固定するには、微小ビーズに上記蛋
白質を固定して、このビーズをクロマトグラフィ担体に
固定したり、又は上記蛋白質をクロマトグラフィ担体に
直接あるいはリンカーを介して結合させたりする、通常
の方法が使用できる。

【００２７】また、本発明の免疫分析装置は、上記結合
対の他の一方の化合物と着色微粒子Ｂとの複合体が含ま
れるように設けられている。したがって、被検試料液が
検出領域を通過して対照領域に到着すると、対照領域に
固定されている上記結合対の上記一方の化合物と上記結
合対の上記他の一方の化合物とが結合し、対照領域に着
色微粒子Ｂが捕捉される。すなわち、被検試料液が対照
領域に到着すると、対照領域が着色微粒子Ｂにより発色
し、その結果、被検試料液が検出領域を通過したか否か
を知ることができる。

【００２８】被検試料液中に上記複合体が含まれるよう
に設けるには、上記複合体を、例えば上記標識領域等、
試料添加領域と検出領域との間に予め、被検試料液のク
ロマトグラフィストリップ中毛細管流により移動可能な
ように、配置しておいてもよい。また、上記複合体を、
被検試料液と共に試料添加領域に添加してもよい。

【００２９】着色微粒子Ｂとしては、セレニウムコロイ
ド等の非金属コロイド、金コロイド等の金属コロイド、
着色樹脂粒子、染料コロイド及び着色リポソーム等が、
用いられ、着色微粒子Ａと同じものであってもよいし、
異なるものであってもよい。

【００３０】上記複合体は、上記結合対の他の一方の化
合物を、着色微粒子Ｂに吸着させたり、あるいは着色微
粒子Ｂの表面に結合させたりすることにより得られる。
また、例えば、ビオチン等の低分子化合物を微小ビーズ
に一旦吸着させて後、この微小ビーズを更に着色微粒子
Ｂに吸着させるような、上記他の一方の化合物と着色微
粒子Ｂとの関接的結合によっても製造できる。

【００３１】本発明の免疫分析装置を用いて、分析対象
物を検出又は測定する方法は、上記の、被検試料液中に
上記複合体が含まれるようにする以外は、通常の方法で
よい。

【００３２】以下実施例を用いてさらに説明する。

【００３３】

【実施例】

実施例１ 装置の製造：セレニウムコロイドで標識した抗ＨＢｓ抗
体からなる標識試薬を次のように調製した。９１ｍＭの
Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムと３２ｍＭ酸化セレニウ
ムとを、約４℃で１５分、次いで約４２℃で約７０時間
撹拌して、セレニウムコロイドを調製した。得られたセ
レニウムコロイドを５５０ｎｍにおける吸光度が３．０
になるように１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）
で希釈した。この希釈液に抗ＨＢｓモノクローナル抗体
（０．０２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、これを室温で１時間
撹拌した。同様にセレニウムコロイドの希釈液（５５０
ｎｍにおける吸光度１．０）にビオチン化牛血清アルブ
ミン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、これを室温で１時
間撹拌した。得られたセレニウムコロイドで標識した抗
ＨＢｓモノクローナル抗体液及びビオチン化血清アルブ
ミンを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄
し、その等量混合物を標識試薬とした。

【００３４】標識領域を次のように調製した。抗ＨＢｓ
モノクローナル抗体のセレニウムコロイドコンジュゲー
トとビオチン化牛血清アルブミンのセレニウムコロイド
コンジュゲートからなる標識試薬を１％のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）及び２％のカゼインを含有する５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に入れ、波長５
５０ｎｍの吸光度が３．０になるようにして標識試薬懸
濁液を得た。この懸濁液中にガラス繊維膜（米国ＬＹＤ
ＡＬＬ社製、Ｌｙｐｏｒｅ９５２４）を浸し懸濁液を充
分しみ込ませた後、ガラス繊維膜を乾燥し、標識領域と
した。

【００３５】検出領域を次のように調製した。抗ＨＢｓ
抗体を、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中
に０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製した。一
方、クロマトグラフィー担体として０．４×４．５ｃｍ
の長方形の細孔５μｍのニトロセルロース膜（米国Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ社製）を、０．４×６．０ｃｍの水不透
性のストリップ支持体に長い辺を縦としたときに上端が
揃うように貼付した。ストリップ支持体に貼付したニト
ロセルロース膜の下端から約１ｃｍのところに線状に抗
ＨＢｓ抗体の溶液を滴下した後、充分乾燥させ、抗ＨＢ
ｓ抗体を固相化した。

【００３６】対照領域を次のように調製した。ニュート
ラアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製、コード３１０００）
を、５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に
０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製した。この
ニュートラアビジン溶液を上記のニトロセルロース膜の
検出領域から約１ｃｍ離れた上端側に線状に滴下した
後、充分乾燥させ、ニュートラアビジンを固相化した。

【００３７】クロマトグラフィーストリップを次のよう
に調製した。検出領域としたニトロセルロース膜の下端
側のストリップ支持体上に、０．４×０．４ｃｍの正方
形に切断した上記標識領域を、ニトロセルロース膜と僅
かに接するように貼付した。標識領域下端のストリップ
支持体上に試料添加領域として、０．４×１．３ｃｍの
不織布（米国デュポン社製ソンタラ８８０１）を標識領
域と接するように貼付した。更に、０．４×５．１ｃｍ
の長方形の保護フィルム（リンテック社製 ＰＥＴ２５
ＰＥ ＬＲ００７Ａ）を長い辺を縦としたときに上縁
がニトロセルロース膜の上端に揃うように貼付し、これ
をクロマトグラフィーストリップとした。

【００３８】実施例２ ＨＢｓ抗原の検出：実施例１で述べたようにして調製さ
れたクロマトグラフィーストリップを、被検試料液中の
ＨＢｓ抗原を検出するためのアッセイに使用した。５０
μＬの血清検体を試料添加領域に添加し、１５分後に検
出領域及び対照領域における発色の様子を観察した。被
検試料中に存在するＨＢｓ抗原は、標識領域中に存在す
るセレニウムコロイド標識抗ＨＢｓモノクローナル抗体
と反応しながら検出領域へ毛管流により移動する。検出
領域に達したＨＢｓ抗原とセレニウムコロイド標識抗Ｈ
Ｂｓモノクローナル抗体との反応生成物は、ＨＢｓ抗原
を介して検出領域上に固定化されている抗ＨＢｓ抗体と
反応し、検出領域に赤色の発色シグナルが現れる。一
方、標識領域中に存在するセレニウムコロイド標識ビオ
チン化牛血清アルブミンは、被検体試料液と共にストリ
ップ中を毛管流により移動し検出領域に結合することな
く対照領域へ達する。セレニウムコロイド標識ビオチン
化牛血清アルブミンは、対照領域上のニュートラビジン
と反応し、対照領域に赤色の発色シグナルが現れる。

【００３９】検出領域及び対照領域の両方に赤色の発色
が観察された場合とＨＢｓ抗原陽性、対照領域のみに発
色が観察された場合をＨＢｓ抗原陰性、対照領域に発色
が観察されなかった場合はアッセイ不良と判断した。

【００４０】

【発明の効果】以上述べたような従来の対照領域の改良
により、被検試料液が検出領域を通過したことを、被検
試料液のｐＨや被検試料液中の分析対象物の量に影響さ
れることなく、正確に判定できるようになった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 新井 宏育 千葉県松戸市稔台344 ダイナボット株式 会社総合研究所内 (72)発明者 武田 克道 千葉県松戸市稔台344 ダイナボット株式 会社総合研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分析対象物を含む可能性がある被検試料
   液が添加される試料添加領域及び上記被検試料液中の上
   記分析対象物を検出する検出領域を少なくとも有するク
   ロマトグラフィストリップを有し、ビオチン又はビオチ
   ン誘導体及び糖リガンド又は糖リガンド誘導体から選ば
   れる化合物Ａとアビジン又は抗ビオチン抗体及び糖結合
   性蛋白質から選ばれる化合物Ｂとからなり化合物Ａと化
   合物Ｂは特異的に結合するものである結合対のいずれか
   一方の化合物が固定されている対照領域を上記検出領域
   の下流にさらに有し、かつ上記被検試料液中に着色微粒
   子と上記結合対の他の一方の化合物との複合体が含まれ
   るように設けられていることを特徴とする免疫分析装
   置。