CN113970635A - 一种免疫层析试纸及其制备方法和应用 - Google Patents
一种免疫层析试纸及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113970635A CN113970635A CN202111256747.XA CN202111256747A CN113970635A CN 113970635 A CN113970635 A CN 113970635A CN 202111256747 A CN202111256747 A CN 202111256747A CN 113970635 A CN113970635 A CN 113970635A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- quality control
- pad
- solution
- conjugate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 102
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 75
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 38
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 38
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 68
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 62
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 33
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims description 17
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 15
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 14
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 claims description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 claims description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 37
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 20
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 abstract description 19
- 239000011616 biotin Substances 0.000 abstract description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 76
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 14
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 13
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 12
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 12
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 11
- 102100036859 Troponin I, cardiac muscle Human genes 0.000 description 10
- 101710128251 Troponin I, cardiac muscle Proteins 0.000 description 10
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 3
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 108010067755 dinitrophenyl-bovine serum albumin Proteins 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种免疫层析试纸及其制备方法和应用，涉及免疫层析检测技术领域，本发明使用链霉亲和素进行检测线划膜，将生物素化抗体转移到结合垫上，使得抗原、抗体从结合垫上就开始双抗夹心反应，增加反应时间以提高反应效率，且生物素化抗体在硝酸纤维素膜上可以流动，与抗原反应能力强于固定在检测线上的抗体，提高双抗夹心复合物产生的效率，提升灵敏度。同时，硝酸纤维素膜上的捕获反应从抗原‑抗体反应转换成链霉亲和素‑生物素的反应，反应效率提高3‑4个数量级，提高膜上检测线的捕获效率，从而提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体而言，涉及一种免疫层析试纸及其制备方法和应用。
背景技术
免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，标记抗体或抗原固定于结合垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动，待分析物与包被抗体或抗原、标记抗体或抗原在检测线上形成免疫复合物，检测线上标记物信号与待分析物存在一定关系，进而抗原通过检测线上信号获得待分析物浓度。
免疫层析技术具有操作简单、现场快速检测、成本低等优点，已广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域。但是，相较于化学发光检测技术，其灵敏度仍存在较大差距，限制了免疫层析技术在诊断领域中的应用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫层析试纸及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种免疫层析试纸，其包括：底板以及依次搭接并承载于所述底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上固定有检测线与质控线，所述结合垫上包被有：生物素化抗体，抗体与标记物的偶联物以及质控信号物质；所述生物素化抗体以及所述偶联物中的抗体均为能够结合待测物的抗体；所述检测线上包被有链霉亲和素；所述质控线上包被有能够结合质控信号物质的质控线抗体。
第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的免疫层析试纸的制备方法，其包括：在底板上依次搭接样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；在所述结合垫上包被：生物素化抗体，抗体与标记物的偶联物以及质控信号物质；所述生物素化抗体以及所述偶联物中的抗体均为能够结合待测物的抗体；在所述检测线上包被链霉亲和素，在所述质控线上包被能够结合质控信号物质的质控线抗体。
第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的免疫层析试纸或如前述实施例所述的制备方法制备的免疫层析试纸在免疫层析检测中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的免疫层析试纸或如前述实施例所述的制备方法制备的免疫层析试纸在制备免疫层析检测试剂盒中的应用。
第五方面，本发明实施例提供了一种免疫层析检测试剂片或试剂盒，其包括有：如前述实施例所述的免疫层析试纸或如前述实施例所述的制备方法制备的免疫层析试纸。
本发明具有以下有益效果：
本发明使用链霉亲和素进行检测线划膜，将生物素化抗体转移到结合垫上，使得抗原、抗体从结合垫上就开始双抗夹心反应，增加反应时间以提高反应效率，且生物素化抗体在硝酸纤维素膜上可以流动，与抗原反应能力强于固定在检测线上的抗体，提高双抗夹心复合物产生的效率，提升灵敏度。同时，硝酸纤维素膜上的捕获反应从抗原-抗体反应转换成链霉亲和素-生物素的反应，反应效率提高3-4个数量级，提高膜上检测线的捕获效率，从而提高检测灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中试剂片结构图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
为解决现有技术存在的免疫层析技术检测灵敏度不高等技术问题，本发明使用链霉亲和素进行检测线划膜，将生物素化抗体转移到结合垫上，使得抗原、抗体从结合垫上就开始双抗夹心反应，增加反应时间以提高反应效率，且生物素化抗体在硝酸纤维素膜上可以流动，与抗原反应能力强于固定在检测线上的抗体，提高双抗夹心复合物产生的效率，提升灵敏度。同时，硝酸纤维素膜上的捕获反应从抗原-抗体反应转换成链霉亲和素-生物素的反应，反应效率提高3-4个数量级，提高膜上检测线的捕获效率，从而提高检测灵敏度。
具体地，本发明实施例提供了一种免疫层析试纸，其包括：底板以及依次搭接并承载于所述底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上固定有检测线与质控线。
可选地，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫与底板的制备均可以参照现有的免疫层析试剂的制备方法。本文中的“依次搭接”是指样品垫和结合垫相互搭接、结合垫和硝酸纤维素膜相互搭接、硝酸纤维素膜和吸水垫相互搭接。自底板的上表面起往上依次为：硝酸纤维素膜、吸收垫、结合垫和样品垫。通过在底板上先后贴上硝酸纤维素膜、吸收垫、结合垫和样品垫，之后切割成固定宽度，装入试剂卡中，合上压片。
所述结合垫上包被有：生物素化抗体，以及抗体与标记物的偶联物。本文中的“生物素化抗体”是指修饰有生物素的抗体。“标记物”是指能够发出检测信号的物质，包括但不限于：荧光素、荧光微球、彩色乳胶微球和胶体金中的至少一种。
所述生物素化抗体以及所述偶联物中的抗体均为能够结合待测物的抗体。
所述检测线上包被有链霉亲和素。
所述质控线上包被有能够结合质控信号物质的质控线抗体。所述质控信号物质选自：所述抗体与标记物的偶联物，或其他独立质控体系抗体(如鸡抗、DNP-BSA等)与标记物的偶联物。当所述质控信号物质为独立质控体系抗体与标记物的偶联物时，所述结合垫上还包被有独立质控体系抗体与标记物的偶联物。当所述质控信号物质为抗体与标记物的偶联物时，所述结合垫上包被的抗体与标记物的偶联物则可以直接作为质控信号物质。
优选地，部分所述链霉亲和素上连接有所述生物素化抗体，能够进一步捕获标记物与待测物的复合物，再次提升检测灵敏度。
本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的免疫层析试纸的制备方法，其包括：在底板上依次搭接样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
步骤1：在所述结合垫上包被：生物素化抗体，以及抗体与标记物的偶联物；所述生物素化抗体以及所述偶联物中的抗体均为能够结合待测物的抗体。
在优选实施方式中，所述结合垫的包被方法如下：在释放液中添加生物素化抗体，以及抗体与标记物的偶联物，获得结合垫溶液；所述结合垫溶液中的生物素化抗体的终浓度为1～5μg/mL，具体可以为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL或5μg/mL。抗体与标记物的偶联物的终浓度为0.1～2mg/mL，具体可以为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL或2mg/mL。相对于其他浓度的结合垫溶液，在该设定范围内获得的试纸或试剂片，检测灵敏度更好。
当所述质控信号物质为独立质控体系抗体与标记物的偶联物时，还包括在所述结合垫上包被独立质控体系抗体与标记物的偶联物，独立质控体系抗体与标记物的偶联物的终浓度为0.05～1mg/mL，具体可以为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL或1.0mg/mL。
步骤2：在所述检测线上包被链霉亲和素。
优选地，所述检测线划膜液中，链霉亲和素的终浓度为1～4mg/mL，具体可以为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL或4mg/mL。生物素化抗体的终浓度为0.1～0.5mg/mL，具体可以为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL或0.5mg/mL。相对于其他浓度的链霉亲和素和生物素化抗体的结合垫溶液，在该设定范围内获得的试纸或试剂片，检测灵敏度更高。
步骤3：在所述质控线上包被能够结合质控信号物质的质控线抗体。
具体地，在所述质控线上包被抗体的步骤包括：采用质控线划膜液在硝酸纤维膜上划膜，所述质控线划膜液中包括有能够结合质控信号物质的抗体。
优选地，所述质控线划膜液中，能够结合质控信号物质的抗体的终浓度为1～4mg/mL，具体可以为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL或4mg/mL。
优选地，所述释放液包括：0.005～0.15M硼酸，质量分数为1％～5％蔗糖、质量分数为0.1％～1％牛血清白蛋白以及质量分数为0.5％～1.5％聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
需要说明的是，在其他实施例中，步骤1～3的顺序可随意调换或同时进行，步骤的顺序不对最终的结果造成影响。
步骤4：采用所述结合垫溶液浸湿玻璃纤维膜，干燥后，获得所述结合垫。
本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的免疫层析试纸或如前述任意实施例所述的制备方法制备的免疫层析试纸在免疫层析检测中的应用。
本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的免疫层析试纸或如前述任意实施例所述的制备方法制备的免疫层析试纸在制备免疫层析检测试剂盒中的应用。
此外，本发明实施例还提供了一种免疫层析检测试剂片或试剂盒，其包括有：如前述任意实施例所述的免疫层析试纸或如前述任意实施例所述的制备方法制备的免疫层析试纸。
本发明提供的免疫层析试纸的检测原理为：采用免疫荧光双抗体夹心法进行定量检测。将待测样本与临床稀释液混匀后，吸取一定量的混合液，从测试孔滴到样品垫上，在层析作用下，样本从样品垫先流过结合垫，复溶出抗体与标记物的偶联物以及生物素化抗体，样本中若存在待测物，则它会与抗体与标记物的偶联物和生物素化抗体形成双抗夹心复合物，或分别与抗体与标记物的偶联物以及生物素化抗体单独形成复合物，之后到达硝酸纤维素膜，含生物素的双抗夹心复合物被检测线上的链霉亲和素捕获，标记物与待测物的复合物被检测线上的抗体捕获，样本中待测物的浓度与标记物信号成正比，同时以质控线信号强度校正检测线的信号强度，从而实现更高灵敏度的定量检测。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明实施例提供了一种免疫层析检测试剂片，以待测物为心肌肌钙蛋白I(cTnI)为例，其制备方法如下。
(1)硝酸纤维素膜的包被方法
配制检测线划膜液：将链霉亲和素与生物素化抗体(Ab-biotin)在划膜液中进行混合，以获得检测线划膜液，链霉亲和素的终浓度为2mg/mL，生物素化抗体的终浓度为0.2mg/mL。
将羊抗鼠抗体或羊抗鸡、DNP-BSA等独立质控线抗体配制成1mg/mL的质控线划膜液。
将检测线划膜液以及质控线划膜液以条带状1.0mm用喷金划膜仪分别固定于硝酸纤维素膜上，通过真空干燥或室温、37℃烘干制成硝酸纤维素包被膜。
(2)结合垫的制备方法
配制结合垫溶液：将cTnI抗体与标记物的偶联物(终浓度为0.1mg/mL)与生物素修饰的cTnI抗体(终浓度为4μg/mL)分别添加或混合添加到合适的释放液中，以获得结合垫溶液。
释放液包含0.01M硼酸，2％蔗糖、0.5％牛血清白蛋白、1％聚乙烯吡咯烷酮等。
结合垫溶液混合均匀后，铺陈至玻纤上，通过真空干燥或37℃烘干制成结合垫。
(3)试剂片的制备方法
在PVC底板上先后贴上硝酸纤维素膜、吸收垫、结合垫和样品垫，之后切割成3.2mm宽，装入试剂卡中，之后将试剂卡合上压片。试剂片结构见图1。本体系包含两种抗原检测路径：(1)样本中抗原与结合垫中抗体-标记物偶联物以及生物素化抗体形成双抗夹心复合物，经过膜上检测线被SA捕获；(2)样本中抗原与结合垫中抗体-标记物偶联物结合，经过膜上检测线被SA与生物素化抗体复合物捕获。
实施例2
本发明实施例提供了一种免疫层析检测试剂片，大致与实施例1相同，区别在于，检测线划膜液的不同，区别如下：
将链霉亲和素(SA)加入划膜液，以获得检测线划膜液，链霉亲和素的终浓度为2mg/mL。
实施例3
一种免疫层析检测试剂片，大致与实施例1相同，区别在于，采用不同浓度的检测线划膜液，区别如下：
(1)硝酸纤维素膜的包被方法
配制检测线划膜液：将链霉亲和素与生物素化抗体(Ab-biotin)在划膜液中进行混合，以获得检测线划膜液，链霉亲和素的终浓度为1mg/mL，生物素化抗体的终浓度为0.1mg/mL。
实施例4
一种免疫层析检测试剂片，大致与实施例1相同，区别在于，采用不同浓度的检测线划膜液，区别如下：
(1)硝酸纤维素膜的包被方法
配制检测线划膜液：将链霉亲和素与生物素化抗体(Ab-biotin)在划膜液中进行混合，以获得检测线划膜液，链霉亲和素的终浓度为4mg/mL，生物素化抗体的终浓度为0.5mg/mL。
实施例5
一种免疫层析检测试剂片，大致与实施例1相同，区别在于，采用不同的抗体以及结合垫溶液，区别如下：
(1)生物素化抗体以及抗体与标记物的偶联物中的抗体为抗肌酸激酶同工酶(CK-MB)的抗体。
(2)配制结合垫溶液：将CK-MB抗体与标记物的偶联物(终浓度为0.2mg/mL)与生物素修饰的CK-MB抗体(终浓度为6μg/mL)分别添加或混合添加到合适的释放液中，以获得结合垫溶液。
实施例6
一种免疫层析检测试剂片，大致与实施例5相同，区别在于检测线划膜液的不同，区别如下：
将链霉亲和素(SA)加入划膜液，以获得检测线划膜液，链霉亲和素的终浓度为2mg/mL。
对比例1
一种免疫层析检测试剂片，大致与实施例1相同，区别在于，检测线划膜液、结合垫溶液的不同，区别如下：
(1)配制检测线划膜液：抗体(Ab)直接加入划膜液，以获得检测线划膜液，抗体的终浓度为2mg/mL。
(2)cTnI抗体与标记物的偶联物(终浓度为0.1mg/mL)添加到合适的释放液中，以获得结合垫溶液。
对比例2
一种免疫层析检测试剂片，大致与实施例5相同，区别在于，检测线划膜液、结合垫溶液的不同，区别如下：
(1)配制检测线划膜液：抗体(Ab)直接加入划膜液，以获得检测线划膜液，抗体的终浓度为2mg/mL。
(2)CK-MB抗体与标记物的偶联物(终浓度为0.2mg/mL)添加合适的释放液中，以获得结合垫溶液。
对比例3
一种免疫层析检测试剂片，以待测物为心肌肌钙蛋白I(cTnI)为例，其制备方法如下。
(1)硝酸纤维素膜的包被方法
配制检测线划膜液：将抗体(Ab)在划膜液中进行混合，以获得检测线划膜液，抗体的终浓度为2mg/mL。
将羊抗鼠抗体或羊抗鸡、DNP-BSA等独立质控线抗体配制成1mg/mL的质控线划膜液。
将检测线划膜液以及质控线划膜液以条带状1.0mm用喷金划膜仪分别固定于硝酸纤维素膜上，通过真空干燥或室温、37℃烘干制成硝酸纤维素包被膜。
(2)标记物与抗体通过链霉亲和素-生物素偶联。
①、标记物联链霉亲和素：通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化标记物，加入链霉亲和素和活化的标记物反应，反应完成后，离心去除上清液，保存在荧光保存液中，保存浓度为0.5mg/ml。
②抗体生物素化：将cTnI抗体与NHS酯化的生物素以1:5-1:100的摩尔比例混合反应，反应完成后通过超滤除去游离的生物素，保存在PBS缓冲液中，保存浓度为2mg/ml。
③SA-标记物与生物素化抗体偶联：将偶联链霉亲和素的标记物与生物素化抗体以10:1-5:1的质量比例混合，反应完成后，离心去除上清液，保存在荧光保存液中，保存浓度为0.5mg/ml。
(3)结合垫的制备方法
配制结合垫溶液：将(2)中cTnI抗体与荧光微球的偶联物(终浓度为0.1mg/mL)添加到合适的释放液中，以获得结合垫溶液。
释放液包含0.01M硼酸，2％蔗糖、0.5％牛血清白蛋白、1％聚乙烯吡咯烷酮等。
结合垫溶液混合均匀后，铺陈至玻纤上，通过真空干燥或37℃烘干制成结合垫。
(4)试剂片的制备方法
在PVC底板上先后贴上硝酸纤维素膜、吸收垫、结合垫和样品垫，之后切割成3.2mm宽，装入试剂卡中，之后将试剂卡合上压片。试剂片结构见图1。
试验例1
验证不同划膜体系的检测效果。
采用实施例1(SA+生物素化抗体划膜)、实施例2(SA划膜)以及对比例1(抗体划膜)的制备方法进行试剂片的制备，检测结果如表1所示。
表1检测结果
注：SA/Ab RD表示SA划膜产生的信号与Ab划膜产生的信号差异(实施例2与对比例1数据的相对偏差)，SA+Ab/Ab RD表示SA与生物素化抗体共同划膜产生的信号与Ab划膜产生的信号差异(实施例1与对比例1数据的相对偏差)。
由结果可知，使用链霉亲和素划膜相较抗体直接划膜的信号整体高30％以上，而在划膜液中加入链霉亲和素与生物素化抗体的信号较抗体直接划膜低值信号高1.5倍以上。使用链霉亲和素划膜，将生物素化抗体转移到结合垫上，使得抗原、抗体从结合垫上就开始双抗夹心反应，增加反应时间以提高反应效率，且生物素化抗体在硝酸纤维素膜上可以流动，与抗原反应能力强于固定在检测线上的抗体，提高双抗夹心复合物产生的效率，提升灵敏度；同时将硝酸纤维素膜上的捕获反应从抗原-抗体反应转换成链霉亲和素-生物素的反应，反应效率提高3-4个数量级，提高膜上检测线的捕获效率，从而提高检测灵敏度。在划膜液链霉亲和素的基础上增加生物素化抗体，即在检测线上添加生物素化抗体，补充抗体位点，可以捕获标记物与待测物的复合物，再次提升检测灵敏度，最终导致该链霉亲和素-生物素化抗体划膜系统信号较抗体直接划膜信号提高1.5倍以上，极大提升了体系灵敏度。
试验例2
验证不同检测线划膜液浓度的检测效果。
采用实施例3、实施例1、实施例4的制备方法进行试剂片的制备，检测结果如表2所示。
表2检测结果
注：左数第一列表示测试的样本中心肌肌钙蛋白I的浓度，第二列表示划膜液中生物素化抗体添加浓度为0.1mg/mL、链霉亲和素添加浓度为1mg/mL(实施例3)，第三列表示划膜液中生物素化抗体添加浓度为0.2mg/mL、链霉亲和素添加浓度为2mg/mL(实施例1)，第四列表示划膜液中生物素化抗体添加浓度为0.5mg/mL、链霉亲和素添加浓度为4mg/mL(实施例4)，SA2/SA1 RD表示当生物素化抗体添加浓度为0.2mg/mL、链霉亲和素添加浓度为2mg/mL时的测试信号与生物素化抗体添加浓度为0.1mg/mL、链霉亲和素添加浓度为1mg/mL的信号相比的差异(实施例1与实施例3的相对偏差)，SA4/SA1 RD表示当生物素化抗体添加浓度为0.5mg/mL、链霉亲和素添加浓度为4mg/mL时的测试信号与生物素化抗体添加浓度为0.1mg/mL、链霉亲和素添加浓度为1mg/mL的信号相比的差异(实施例4与实施例3的相对偏差)。
调节划膜液中链霉亲和素、生物素化抗体的浓度，进行信号比较，结果如表2所示，链霉亲和素浓度从1mg/mL提升至4mg/mL，生物素化抗体浓度从0.1mg/mL提升至0.5mg/mL，低值信号约有5-16％的提升。
试验例3
验证不同划膜体系的检测效果。
采用实施例5(SA+生物素化抗体划膜)、实施例6(SA划膜)以及对比例2(抗体划膜)的制备方法进行试剂片的制备，检测结果如表3所示。
表3检测结果
注：SA/Ab RD表示SA划膜产生的信号与Ab划膜产生的信号差异(实施例6与对比例2数据的相对偏差)，SA+Ab/Ab RD表示SA与生物素化抗体共同划膜产生的信号与Ab划膜产生的信号差异(实施例5与对比例2数据的相对偏差)。
由表3可知，使用链霉亲和素划膜相较抗体直接划膜的低值信号高50％以上，而在划膜液中加入链霉亲和素与生物素化抗体的低值信号较抗体直接划膜高2倍，高值信号高50％左右。使用链霉亲和素划膜，将生物素化抗体转移到结合垫上，使得抗原、抗体从结合垫上就开始双抗夹心反应，增加反应时间以提高反应效率，且生物素化抗体在硝酸纤维素膜上可以流动，与抗原反应能力强于固定在检测线上的抗体，提高双抗夹心复合物产生的效率，提升灵敏度；同时将硝酸纤维素膜上的捕获反应从抗原-抗体反应转换成链霉亲和素-生物素的反应，反应效率提高3-4个数量级，提高膜上检测线的捕获效率，从而提高检测灵敏度。在划膜液链霉亲和素的基础上增加生物素化抗体，即在检测线上添加生物素化抗体，补充抗体位点，可以捕获标记物与待测物的复合物，再次提升检测灵敏度，最终导致该链霉亲和素-生物素化抗体划膜系统信号较抗体直接划膜低值信号提高2倍，极大提升了体系灵敏度。
试验例4
比较链霉亲和素-生物素放大系统在不同使用位置的检测效果。
采用实施例1(SA+生物素化抗体划膜、微球直接偶联抗体)、对比例1(抗体划膜、微球直接偶联抗体)以及对比例3(抗体划膜、微球通过链霉亲和素与生物素系统偶联抗体)的制备方法进行试剂片的制备，检测结果如表4所示。
表4检测结果
由表3可知，微球通过链霉亲和素和生物素方式偶联抗体(对比例3)与微球直接偶联抗体(对比例1)相比，信号升高23-55％；在划膜液中加入链霉亲和素与生物素化抗体、微球直接偶联抗体(实施例1)的信号较微球通过链霉亲和素和生物素方式偶联抗体(对比例3)的信号高17-63％。由此可见，将链霉亲和素-生物素的放大系统的应用从微球抗体偶联物扩大到整个试剂片，检测信号有进一步提升，说明将链霉亲和素-生物素放大系统应用在整个试剂片上对提升检测灵敏度更有利。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种免疫层析试纸，其包括：底板以及依次搭接并承载于所述底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上固定有检测线与质控线，其特征在于，所述结合垫上包被有：生物素化抗体，抗体与标记物的偶联物；所述生物素化抗体以及所述偶联物中的抗体均为能够结合待测物的抗体；
所述检测线上包被有链霉亲和素；
所述质控线上包被有能够结合质控信号物质的质控线抗体。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于，部分所述链霉亲和素上连接有所述生物素化抗体；
优选地，所述质控信号物质选自：抗体与标记物的偶联物，或独立质控体系抗体与标记物的偶联物，当所述质控信号物质为独立质控体系抗体与标记物的偶联物时，所述结合垫上还包被有独立质控体系抗体与标记物的偶联物。
3.如权利要求1或2所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，其包括：在底板上依次搭接样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
在所述结合垫上包被：生物素化抗体，以及抗体与标记物的偶联物；所述生物素化抗体以及所述偶联物中的抗体均为能够结合待测物的抗体；
在所述检测线上包被链霉亲和素；
在所述质控线上包被能够结合质控信号物质的质控线抗体。
4.根据权利要求3所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，在所述结合垫上包被生物素化抗体以及抗体与标记物的偶联物的步骤，包括：
在释放液中添加生物素化抗体，和抗体与标记物的偶联物，获得结合垫溶液；所述结合垫溶液中的生物素化抗体的终浓度为1～5μg/mL，抗体与标记物的偶联物的终浓度为0.1～2mg/mL；
当所述质控信号物质为独立质控体系抗体与标记物的偶联物时，还包括在所述结合垫上包被独立质控体系抗体与标记物的偶联物，独立质控体系抗体与标记物的偶联物的终浓度为0.05～1mg/mL；
采用所述结合垫溶液浸湿玻璃纤维膜，干燥后，获得所述结合垫；
优选地，所述释放液包括：0.005～0.15M硼酸，质量分数为1％～5％蔗糖、质量分数为0.1％～1％牛血清白蛋白、质量分数为0.5％～1.5％的聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
5.根据权利要求2～4任一项所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述检测线上的部分链霉亲和素连接有生物素化抗体，在所述检测线上包被链霉亲和素的步骤包括：采用检测线划膜液在硝酸纤维膜上划膜，所述检测线划膜液中包括有链霉亲和素以及生物素化抗体。
6.根据权利要求5所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述检测线划膜液中，链霉亲和素的终浓度为1～4mg/mL，生物素化抗体的终浓度为0.1～0.5mg/mL。
7.根据权利要求3所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，在所述质控线上包被抗体的步骤包括：
采用质控线划膜液在硝酸纤维膜上划膜，所述质控线划膜液中包括有能够结合质控信号物质的抗体；
优选地，所述质控线划膜液中，能够结合质控信号物质的抗体的终浓度为1～4mg/mL。
8.如权利要求1或2所述的免疫层析试纸或如权利要求3～7任一项所述的制备方法制备的免疫层析试纸在免疫层析检测中的应用。
9.如权利要求1或2所述的免疫层析试纸或如权利要求3～7任一项所述的制备方法制备的免疫层析试纸在制备免疫层析检测试剂片或试剂盒中的应用。
10.一种免疫层析检测试剂片或试剂盒，其特征在于，其包括有：如权利要求1或2所述的免疫层析试纸或如权利要求3～7任一项所述的制备方法制备的免疫层析试纸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111256747.XA CN113970635B (zh) | 2021-10-27 | 2021-10-27 | 一种免疫层析试纸及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111256747.XA CN113970635B (zh) | 2021-10-27 | 2021-10-27 | 一种免疫层析试纸及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113970635A true CN113970635A (zh) | 2022-01-25 |
| CN113970635B CN113970635B (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=79588658
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111256747.XA Active CN113970635B (zh) | 2021-10-27 | 2021-10-27 | 一种免疫层析试纸及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113970635B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114324901A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-04-12 | 天津中新科炬生物制药股份有限公司 | 一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009028202A1 (ja) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd. | 免疫クロマトディバイス |
| JP2015230280A (ja) * | 2014-06-06 | 2015-12-21 | 凸版印刷株式会社 | 分析対象物の検出方法及びラテラルフロー用テストストリップ |
| CN105652008A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-06-08 | 广州市微米生物科技有限公司 | 人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡及其制备方法 |
| WO2018120620A1 (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-05 | 武汉纽康度生物科技股份有限公司 | 荧光免疫层析检测卡及其制备方法和应用 |
| CN110596404A (zh) * | 2019-09-20 | 2019-12-20 | 成都艾科斯伦医疗科技有限公司 | 一种il-6生物素-链霉亲和素免疫层析检测卡 |
-
2021
- 2021-10-27 CN CN202111256747.XA patent/CN113970635B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009028202A1 (ja) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd. | 免疫クロマトディバイス |
| JP2015230280A (ja) * | 2014-06-06 | 2015-12-21 | 凸版印刷株式会社 | 分析対象物の検出方法及びラテラルフロー用テストストリップ |
| CN105652008A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-06-08 | 广州市微米生物科技有限公司 | 人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡及其制备方法 |
| WO2018120620A1 (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-05 | 武汉纽康度生物科技股份有限公司 | 荧光免疫层析检测卡及其制备方法和应用 |
| CN110596404A (zh) * | 2019-09-20 | 2019-12-20 | 成都艾科斯伦医疗科技有限公司 | 一种il-6生物素-链霉亲和素免疫层析检测卡 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114324901A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-04-12 | 天津中新科炬生物制药股份有限公司 | 一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法 |
| CN114324901B (zh) * | 2022-03-07 | 2022-06-07 | 天津中新科炬生物制药股份有限公司 | 一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113970635B (zh) | 2024-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4228237A (en) | Methods for the detection and determination of ligands | |
| JP3358737B2 (ja) | 改良された投与量応答曲線を有するアッセイ | |
| EP0303110B1 (en) | Immunodiagnostic device and method | |
| CA1223813A (en) | Colorimetric immunoassay on solid surface | |
| AU617091B2 (en) | Immunochromatographic method and device | |
| JP6008670B2 (ja) | イムノクロマトグラフ試験ストリップ用メンブレン、試験ストリップ及び検査方法 | |
| CN1146557A (zh) | 定量检测免疫层析条上的分析物 | |
| CN110596404A (zh) | 一种il-6生物素-链霉亲和素免疫层析检测卡 | |
| US5658725A (en) | Acylated protein aggregates and their use in suppressing interference in immunoassays | |
| CN205193076U (zh) | 一种生物素-亲和素系统快速检测卡 | |
| CN113970635B (zh) | 一种免疫层析试纸及其制备方法和应用 | |
| CN116165378A (zh) | 高特异性、高灵敏度的免疫层析检测试纸及其制备方法、检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN115436627A (zh) | 一种胱抑素c荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN107782898B (zh) | 一种荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法 | |
| JP5248264B2 (ja) | イムノクロマトグラフ法による高感度測定キット | |
| EP1540343B1 (en) | Method for the elimination of interferences in immunochromatographic assays | |
| WO2020108583A1 (zh) | 一种基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件及荧光检测方法 | |
| US5437981A (en) | Method for the immunological determination of ligands | |
| WO2011064910A1 (ja) | 免疫測定方法 | |
| CN111562383A (zh) | 标记物引导通用探针检测三种真菌毒素的侧向抗体芯片 | |
| JPH10132817A (ja) | 標識抗体粒子及びそれを用いた測定装置 | |
| CN111381026A (zh) | 多重检测免疫试剂及其制备方法、试剂盒、系统及应用 | |
| JP2000019175A (ja) | 免疫学的検査方法および免疫学的検査用キット | |
| CN110672853A (zh) | 集成式免疫层析试纸、其制备方法及应用 | |
| US20230042375A1 (en) | Membrane based chemiluminescence immunochromatography assay and its use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |