CN115436627A - 一种胱抑素c荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种胱抑素c荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供的一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法，采用双抗体夹心法，利用荧光免疫层析的技术原理，以鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线上包被用抗体，鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY混合作为荧光微球标记抗体，使用AIE荧光微球免疫层析方法全程定量检测胱抑素C比传统方法更敏感，测定范围更宽广，本发明提供的方法提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合，并且具有较宽的线性范围，检测时间仅为10分钟，大大提高了诊断效率，使用AIE荧光微球偶联到抗体表面的羧基基团，单个抗体可结合多个AIE荧光微球，可放大产生的荧光信号，具有高灵敏度。

Description

一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断免疫层析检测领域，尤其是涉及一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法，具体地说是一种利用荧光免疫层析的技术原理实现定量检测人血清中。
背景技术
胱抑素C(CYS-C)是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质。当肾功能受损时，CYS-C在血液中的浓度随肾小球滤过率变化而变化。肾衰时，肾小球滤过率下降，CYS-C在血液中浓度可增加数倍甚至十数倍。CYS-C水平不受性别、年龄、饮食等因素的影响，是一种反映肾小球滤过率(GFR)变化的理想内源性标志物，所以胱抑素C的检测在临床评价肾脏功能、肾脏损害、肾移植等方面有重要应用价值。
临床检验中胱抑素C的检测多以生化免疫比浊法为主，该方法适合于批量检测但需要大型仪器，而免疫层析法由于检测快速且不需要大型仪器，在临床检验中占据一席之地。目前胱抑素C免疫层析试剂也有胶体金法，检测快速但灵敏度不够、线性窄、特异性较差，无法精确的监测血液中的胱抑素C含量的变化来监测肾脏功能。
因此，亟需一种特异性高、灵敏度强的胱抑素C试剂盒及其制备方法来解决上述问题。
发明内容
本发明为了解决现有技术无法做到的技术问题，提供的一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒。
本发明的第二个目的是提供胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案是：
一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，包括PVC底板，所述PVC底板上沿长度方向依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫侧设有检测线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水纸侧设有质控线，所述结合垫中含有AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体；
所述检测线上包被有鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ，所述质控线上包被有鸡IgY抗体；
所述标记用的AIE荧光微球为长沙美牛科技有限公司粒径为200nm的AIE荧光微球。
优选的，所述AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将AIE荧光微球加入至MES溶液中，溶解后定容至浓度30～100ul/ml，得AIE荧光微球存储液，将AIE荧光微球存储液与化学交联剂混合后，以MES缓冲液作为反应介质，25℃培育30～120min，得到活化后的AIE荧光微球存储液，更优选的，化学交联剂选用零键桥交联剂EDC，该试剂是生物耦合中最小的可利用试剂体系，它通过形成一个不含其它原子的键合介导两个分子之间的生物耦合，这其中一个分子中的一个原子共价的附着于另一个分子的一个原子，它们中间没有介入任何交联剂或间隔基。在本发明的一个优选技术方案中，采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化；
(2)将步骤(1)中活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES缓冲液；
(3)取步骤(2)中第一次重悬后的AIE荧光微球存储液分别加入鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY，20-25℃反应60min，并加入500ul的3％酪蛋白，封闭30min；
(4)封闭结束后离心，离心条件为15000rpm，20min，25℃；用Tris-HCl缓冲液对离心后的标记液进行洗涤，离心条件为12000rpm，15min，25℃，重复2-3次，最后一次离心条件为15000rpm，20min，25℃，去上清后，得AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体。
优选的，所述化学交联剂为EDC、NHS、琥珀酸酐和戊二醛中的一种或多种。
优选的，所述Tris-HCl缓冲液中含有1-5％的蔗糖及0.05-0.1％的表面活性剂。
优选的，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100中的任意一种。
优选的，所述AIE荧光微球与所述鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅱ的质量比为(30～100)ul:(5-50)ug；所述AIE荧光微球与所述羊抗鸡IgY的反应比例为(30～100)ul:(5-50)ug；所述AIE荧光微球为活化前的AIE荧光微球。
为了实现上述第二个目的，本发明采用的技术方案是：
一种如上任一项所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.抗体的标记：使用AIE荧光微球标记鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体；
b.将步骤a中AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体使用复溶液分别按比例稀释定容；
c.包被抗体：将检测抗体鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ和质控抗体鸡IgY溶解于0.1-1M的Tris-HCl缓冲液中；检测抗体鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ的包被浓度为0.8g/ml～1mg/ml，质控抗体鸡Ig的包被浓度为0.5mg/ml～1mg/ml；
d.划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16-18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
e.结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3-8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
f.样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
g.组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另一端为D端，样品垫于结合垫D端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，然后用裁切机将粘贴好的反应板斩切成(3.9±0.1)mm宽的试剂条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，并密封保存，即得胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，通过包被抗体缓冲液增强了抗体蛋白与NC膜的结合效率，并且与检测液中的抗体处于最适配比范围，所以达到较宽的线性范围；
h.制备标准曲线。
优选的，所述复溶液，由以下组分组成：0.01-5mol/L的Tris-HCl、1％-5％的BSA、0.5％-1％的吐温20、10％-20％的蔗糖；所述复溶液的pH值为6-9；通过将AIE荧光微球活化，活化后的AIE荧光微球表面含有稳定的活性酯，之后加入需要交联的抗体，活性酯可以与抗体上的氨基缩合成为稳定地酰胺键，得到AIE荧光微球标记的抗体。由于抗体上存在多个氨基位点，所以可偶联上多个AIE荧光微球分子，以放大反应信号。并且由于抗体的空间折叠方式和Fc端疏水性强，因此偶联反应的绝大多数发生在Fc端，对抗体与抗原的结合的影响不大，之后使用重悬的方法将游离的AIE荧光微球去除，使用复溶液定容至适合的浓度。
优选的，所述步骤h中的制备标准曲线，具体包括以下步骤：将制备好的检测卡配合配套检测设备，用不同梯度的企业参考品进行加样测试，以企业参考品的浓度值以及对应T/C值制备标准曲线，然后将CYS-C标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片，即得胱抑素C的ID芯片；
所述胱抑素C的ID芯片中所存储的标准曲线中各标准点的浓度为0.5mg/L、1.25mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L和9.0mg/L。
本试剂盒测定的原理：采用双抗体夹心法，利用荧光免疫层析的技术原理。测试时，样本与缓冲液混匀，并滴加到试剂的加样孔中，在毛细效应下进行层析，样本中的CYS-C抗原与荧光标记CYS-C抗体结合，扩散至测试区，被检测线包被的CYS-C单克隆抗体捕获，并形成“抗体-抗原-荧光抗体”复合物；样本中的CYS-C浓度与复合物荧光强度成正比，通过干式荧光免疫分析仪及设定的标准曲线，将荧光信号值转换成样本中CYS-C浓度。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
1、本申请提供的一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，采用双抗体夹心法，利用荧光免疫层析的技术原理，以鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线上包被用抗体，鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY混合作为荧光微球标记抗体，使用AIE荧光微球免疫层析方法全程定量检测胱抑素C比传统方法更敏感，测定范围更宽广。临床常规测定胱抑素C的方法为免疫比浊法，但其灵敏度相对较低，测量时间长，线性范围较窄，而本发明提供的方法提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合，并且具有较宽的线性范围，检测时间仅为10分钟，大大提高了诊断效率，使用AIE荧光微球偶联到抗体表面的羧基基团，单个抗体可结合多个AIE荧光微球，可放大产生的荧光信号，具有高灵敏度。
2、本申请提供的一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，通过选定合适原料、合理设计各材料用量、选取最适反应条件，制备工艺简单，制备得到产品标记过程简单、灵敏度高、结果准确且稳定，检测成本低，产品使用简便，成本低廉，适合推广。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本申请实施例1的校准曲线图。
图2是本申请实施例2的校准曲线图。
图3是本申请实施例3的校准曲线图。
图4是本申请实施例4的校准曲线图。
图5是本申请实施例5的校准曲线图。
图6是本申请实施例6的校准曲线图。
图7是本申请实施例7的校准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例1-7说明本发明的具体技术方案：
实施例1：
[1]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[2]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[3]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的鼠抗胱抑素C单抗2(T2)25℃反应60分钟。
[4]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[5]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(T2)。
[6]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[7]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[8]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的羊抗鸡IgY(C2)25℃反应60分钟。
[9]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[10]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(C2)。
[11]配置复溶液，使用0.05mol/L的Tris-HCl、10％的蔗糖、1％的BSA、0.5％的吐温-20，pH值为8.0的复溶液。将用AIE荧光微球标记好的(T2)以及(C2)分别按1:20以及1:25的比例进行稀释。
[12]包被抗体
[13]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解鸡IgY(C1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[14]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解胱抑素C抗体(T1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[15]划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16-18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
[16]结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3-8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
[17]样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
[18]组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另一端为D端，样品垫于结合垫D端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，然后用裁切机将粘贴好的反应板斩切成(3.9±0.1)mm宽的试剂条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，并密封保存，即得胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒；
[19]制作标准曲线，T/C值与质控浓度如表1所示。
[20]如图1表明：该试剂盒在实施例一的情况，线性范围为0.5-9.0mg/L在此区间具有非常好的线性。
表1：
T/C值 0.07509 0.14598 0.25346 0.43392 0.71009
质控浓度mg/L 0.5 1.25 2.5 5 9
T/C值log10 -1.12436 -0.83569 -0.59608 -0.36258 -0.14868
质控浓度log10 -0.30102 0.09691 0.39794 0.69897 0.95424
实施例2：
[1]AIE荧光微球使用赛默飞科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[2]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[3]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的鼠抗胱抑素C单抗2(T2)25℃反应60分钟。
[4]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[5]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(T2)。
[6]AIE荧光微球使用赛默飞科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[7]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[8]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的羊抗鸡IgY(C2)25℃反应60分钟。
[9]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[10]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(C2)。
[11]配置复溶液，使用0.05mol/L的Tris-HCl、10％的蔗糖、1％的BSA、0.5％的吐温-20，pH值为8.0的复溶液。将用AIE荧光微球标记好的(T2)以及(C2)分别按1:20以及1:25的比例进行稀释。
[12]包被抗体
[13]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解鸡IgY(C1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[14]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解胱抑素C抗体(T1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[15]划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16-18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
[16]结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3-8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
[17]样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
[18]组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另一端为D端，样品垫于结合垫D端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，然后用裁切机将粘贴好的反应板斩切成(3.9±0.1)mm宽的试剂条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，并密封保存，即得胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒；
[19]制作标准曲线，T/C值与质控浓度如表2所示。
[20]如图1和图2所示，图2表明：该试剂盒在实施例1的情况，线性范围为0.5-9.0mg/L在此区间的线性没有实施例1好。
表2：
T/C值 0.08009 0.13598 0.33465 0.40392 0.71009
质控浓度mg/L 0.5 1.25 2.5 5 9
T/C值log10 -1.09637 -0.86651 -0.47540 -0.39369 -0.14868
质控浓度log10 -0.30102 0.09691 0.39794 0.69897 0.95424
实施例3：
[1]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MODS反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[2]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[3]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的鼠抗胱抑素C单抗2(T2)25℃反应60分钟。
[4]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[5]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(T2)。
[6]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MODS反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[7]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[8]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的羊抗鸡IgY(C2)25℃反应60分钟。
[9]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[10]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(C2)。
[11]配置复溶液，使用0.05mol/L的Tris-HCl、10％的蔗糖、1％的BSA、0.5％的吐温-20，pH值为8.0的复溶液。将用AIE荧光微球标记好的(T2)以及(C2)分别按1:20以及1:25的比例进行稀释。
[12]包被抗体
[13]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解鸡IgY(C1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[14]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解胱抑素C抗体(T1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[15]划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16-18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
[16]结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3-8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
[17]样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
[18]组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另一端为D端，样品垫于结合垫D端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，然后用裁切机将粘贴好的反应板斩切成(3.9±0.1)mm宽的试剂条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，并密封保存，即得胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒；
[19]制作标准曲线，T/C值与质控浓度如表3所示。
[20]如图1和图3所示，图3表明：该试剂盒在实施例1的情况，线性范围为0.5-9.0mg/L在此区间的线性没有实施例1好。
表3：
T/C值 0.05099 0.18598 0.29465 0.43392 0.69009
质控浓度mg/L 0.5 1.25 2.5 5 9
T/C值log10 -1.29248 -0.73052 -0.53068 -0.36258 -0.16109
质控浓度log10 -0.30102 0.09691 0.39794 0.69897 0.95424
实施例4：
[1]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为2:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[2]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[3]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的鼠抗胱抑素C单抗2(T2)25℃反应60分钟。
[4]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[5]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(T2)。
[6]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[7]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[8]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的羊抗鸡IgY(C2)25℃反应60分钟。
[9]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[10]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(C2)。
[11]配置复溶液，使用0.05mol/L的Tris-HCl、10％的蔗糖、1％的BSA、0.5％的吐温-20，pH值为8.0的复溶液。将用AIE荧光微球标记好的(T2)以及(C2)分别按1:20以及1:25的比例进行稀释。
[12]包被抗体
[13]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解鸡IgY(C1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[14]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解胱抑素C抗体(T1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[15]划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16-18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
[16]结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3-8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
[17]样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
[18]组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另一端为D端，样品垫于结合垫D端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，然后用裁切机将粘贴好的反应板斩切成(3.9±0.1)mm宽的试剂条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，并密封保存，即得胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒；
[19]制作标准曲线，T/C值与质控浓度如表4所示。
[20]如图1和图4所示，图4表明：该试剂盒在实施例1的情况，线性范围为0.5-9.0mg/L在此区间的线性没有实施例1好。
表4：
T/C值 0.08599 0.12059 0.28465 0.40392 0.50009
质控浓度mg/L 0.5 1.25 2.5 5 9
T/C值log10 -1.06553 -0.91865 -0.54568 -0.39369 -0.30094
质控浓度log10 -0.30102 0.09691 0.39794 0.69897 0.95424
实施例5：
[1]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[2]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[3]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的鼠抗胱抑素C单抗2(T2)25℃反应60分钟。
[4]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为10％的BSA。
[5]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(T2)。
[6]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[7]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[8]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的羊抗鸡IgY(C2)25℃反应60分钟。
[9]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为10％的BSA。
[10]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(C2)。
[11]配置复溶液，使用0.05mol/L的Tris-HCl、10％的蔗糖、1％的BSA、0.5％的吐温-20，pH值为8.0的复溶液。将用AIE荧光微球标记好的(T2)以及(C2)分别按1:20以及1:25的比例进行稀释。
[12]包被抗体
[13]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解鸡IgY(C1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[14]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解胱抑素C抗体(T1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[15]划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16-18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
[16]结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3-8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
[17]样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
[18]组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另一端为D端，样品垫于结合垫D端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，然后用裁切机将粘贴好的反应板斩切成(3.9±0.1)mm宽的试剂条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，并密封保存，即得胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒；
[19]制作标准曲线，T/C值与质控浓度如表5所示。
[20]如图1和图5所示，图5表明：该试剂盒在实施例1的情况，线性范围为0.5-9.0mg/L在此区间的线性没有实施例1好。
表5：
T/C值 0.03455 0.13455 0.28468 0.45595 0.60694
质控浓度mg/L 0.5 1.25 2.5 5 9
T/C值log10 -1.46147 -0.87111 -0.54562 -0.34107 -0.21685
质控浓度log10 -0.30102 0.09691 0.39794 0.69897 0.95424
实施例6：
[1]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[2]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[3]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的鼠抗胱抑素C单抗2(T2)25℃反应60分钟。
[4]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[5]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(T2)。
[6]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[7]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[8]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的羊抗鸡IgY(C2)25℃反应60分钟。
[9]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[10]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(C2)。
[11]配置复溶液，使用0.05mol/L的Tris-HCl、10％的蔗糖、1％的BSA、0.5％的吐温-20，pH值为8.0的复溶液。将用AIE荧光微球标记好的(T2)以及(C2)分别按1:20以及1:25的比例进行稀释。
[12]包被抗体
[13]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解鸡IgY(C1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及1％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[14]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解胱抑素C抗体(T1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及1％PVP，2％NaCl、2％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[15]划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16-18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
[16]结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3-8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
[17]样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
[18]组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另一端为D端，样品垫于结合垫D端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，然后用裁切机将粘贴好的反应板斩切成(3.9±0.1)mm宽的试剂条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，并密封保存，即得胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒；
[19]制作标准曲线，T/C值与质控浓度如表6所示。
[20]如图1和图6所示，图6表明：该试剂盒在实施例1的情况，线性范围为0.5-9.0mg/L在此区间的线性没有实施例1好。
表6：
T/C值 0.04062 0.08921 0.15698 0.43854 0.52092
质控浓度mg/L 0.5 1.25 2.5 5 9
T/C值log10 -1.39123 -1.04955 -0.80412 -0.35798 -0.28322
质控浓度log10 -0.30102 0.09691 0.39794 0.69897 0.95424
实施例7：
[1]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[2]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[3]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的鼠抗胱抑素C单抗2(T2)25℃反应60分钟。
[4]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[5]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(T2)。
[6]AIE荧光微球使用长沙美牛科技有限公司的200nm荧光微球，使用MES反应液进行稀释，使其浓度为30ul/mL，作为AIE荧光微球存储液。采用EDC/NHS交联法对AIE荧光微球进行活化，EDC和NHS比例为1:1，提前混合，不超过半小时内使用。将AIE荧光微球存储液与EDC+NHS混合液混合，25℃培育60分钟，得到活化后的AIE荧光微球存储液。
[7]将活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES反应液。
[8]取第一次重悬后的AIE荧光微球存储液加入20μg/mL的羊抗鸡IgY(C2)25℃反应60分钟。
[9]取反应好的AIE荧光微球存储液加入500ul封闭液，封闭30min。封闭液组分为3％酪蛋白。
[10]封闭结束后离心，离心条件为15000rmp，20min，25℃。
用Tris-HCl缓冲液进行洗涤，离心条件为12000rmp，15min，25℃。重复两次，最后一次离心条件为15000rmp，20min，25℃。去上清后备用，得到(C2)。
[11]配置复溶液，使用0.05mol/L的Tris-HCl、10％的蔗糖、1％的BSA、0.5％的吐温-20，pH值为8.0的复溶液。将用AIE荧光微球标记好的(T2)以及(C2)分别按1:20以及1:25的比例进行稀释。
[12]包被抗体
[13]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解鸡IgY(C1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、1％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[14]使用pH值为8.0，含有0.1-1M的Tris-HCl缓冲液。溶解胱抑素C抗体(T1)，浓度为1mg/ml；在Tris-HCl缓冲液加入1％蔗糖、及0.05％PVP，2％NaCl、1％吐温，磷酸缓冲液的pH值为6-9。
[15]划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16-18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
[16]结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3-8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
[17]样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
[18]组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另一端为D端，样品垫于结合垫D端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，然后用裁切机将粘贴好的反应板斩切成(3.9±0.1)mm宽的试剂条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，并密封保存，即得胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒；
[19]制作标准曲线，T/C值与质控浓度如表7所示。
[20]如图1和图7所示，图7表明：该试剂盒在实施例1的情况，线性范围为0.5-9.0mg/L在此区间的线性没有实施例1好。
表7：
T/C值 0.02659 0.04622 0.09626 0.26494 0.49132
质控浓度mg/L 0.5 1.25 2.5 5 9
T/C值log10 -1.57520 -1.33511 -1.01653 -0.57684 -0.30862
质控浓度log10 -0.30102 0.09691 0.39794 0.69897 0.95424
本申请提供的一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，采用双抗体夹心法，利用荧光免疫层析的技术原理，以鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线上包被用抗体，鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY混合作为荧光微球标记抗体，使用AIE荧光微球免疫层析方法全程定量检测胱抑素C比传统方法更敏感，测定范围更宽广。临床常规测定胱抑素C的方法为免疫比浊法，但其灵敏度相对较低，测量时间长，线性范围较窄，而本发明提供的方法提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合，并且具有较宽的线性范围，检测时间仅为10分钟，大大提高了诊断效率，使用AIE荧光微球偶联到抗体表面的羧基基团，单个抗体可结合多个AIE荧光微球，可放大产生的荧光信号，具有高灵敏度。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，包括PVC底板，所述PVC底板上沿长度方向依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫侧设有检测线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水纸侧设有质控线，其特征在于：所述结合垫中含有AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和AIE荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体；
所述检测线上包被有鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ，所述质控线上包被有鸡IgY抗体；
所述标记用的AIE荧光微球为长沙美牛科技有限公司粒径为200nm的AIE荧光微球。
2.根据权利要求1所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将AIE荧光微球加入至MES缓冲液中，溶解后定容至浓度30～100ul/ml，得AIE荧光微球存储液，将AIE荧光微球存储液与化学交联剂混合后，以MES缓冲液作为反应介质，25℃培育30～120min，得到活化后的AIE荧光微球存储液；
(2)将步骤(1)中活化后的AIE荧光微球存储液离心重悬去上清，再加入同体积MES缓冲液；
(3)取步骤(2)中第一次重悬后的AIE荧光微球存储液分别加入鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY，20-25℃反应60min，并加入500ul的3％酪蛋白，封闭30min；
(4)封闭结束后离心，离心条件为15000rpm，20min，25℃；用Tris-HCl缓冲液对离心后的标记液进行洗涤，离心条件为12000rpm，15min，25℃，重复2-3次，最后一次离心条件为15000rpm，20min，25℃，去上清后，得AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体。
3.根据权利要求2所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述化学交联剂为EDC、NHS、琥珀酸酐和戊二醛中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液中含有1-5％的蔗糖及0.05-0.1％的表面活性剂。
5.根据权利要求4所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述AIE荧光微球与所述鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅱ的质量比为(30～100)ul:(5-50)ug；所述AIE荧光微球与所述羊抗鸡IgY的反应比例为(30～100)ul:(5-50)ug；所述AIE荧光微球为活化前的AIE荧光微球。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.抗体的标记：使用AIE荧光微球标记鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体；
b.将步骤a中AIE荧光微球标记的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ和羊抗鸡IgY抗体使用复溶液分别按比例稀释定容；
c.包被抗体：将检测抗体鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ和质控抗体鸡IgY溶解于0.1-1M的Tris-HCl缓冲液中；检测抗体鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ的包被浓度为0.8mg/ml～1mg/ml，质控抗体鸡Ig的包被浓度为0.5mg/ml～1mg/ml；
d.划线：将硝酸纤维素膜裁剪后粘贴在PVC底板上，将吸水纸一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤c制得的鼠抗胱抑素C单克隆抗体Ⅰ液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，将按照步骤c制得的鸡IgY液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在靠A端处划线即为质控线，靠B端处划线为检测线，划线后，在45℃下干燥16-18h，干燥环境湿度恒定在20％以下，干燥后密封保存；
e.结合垫的制备：用步骤b中复溶液稀释定容与抗体偶联后的AIE荧光微球，将混合后的鼠抗人胱抑素C单克隆抗体Ⅱ与羊抗鸡IgY均匀后按3-8ul/cm喷涂在裁切好结合垫处理液处理过的玻璃纤维上，于45℃干燥16～18h；
f.样品垫的制备：配置样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维，于45℃平铺干燥，裁切后保存备用；
g.组装：将处理好的样品垫、结合垫、吸收垫和粘贴有包被NC膜的PVC底板进行粘贴组装，吸收垫于包被好的NC膜A端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于包被好的NC膜B端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，结合垫于NC膜接触端为C端，另一端为D端，样品垫于结合垫D端覆盖2-3mm粘贴于PVC底板上，然后用裁切机将粘贴好的反应板斩切成(3.9±0.1)mm宽的试剂条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，并密封保存，即得胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒；
h.制备标准曲线。
8.根据权利要求7所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述复溶液，由以下组分组成：0.01-5mol/L的Tris-HCl、1％-5％的BSA、0.5％-1％的吐温20、10％-20％的蔗糖。
9.根据权利要求8所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述复溶液的pH值为6-9。
10.根据权利要求7所述的胱抑素C荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤h中的制备标准曲线，具体包括以下步骤：将制备好的检测卡配合配套检测设备，用不同梯度的企业参考品进行加样测试，以企业参考品的浓度值以及对应T/C值制备标准曲线，然后将CYS-C标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片，即得胱抑素C的ID芯片；
所述胱抑素C的ID芯片中所存储的标准曲线中各标准点的浓度为0.5mg/L、1.25mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L和9.0mg/L。
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