CN108535484A - 一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是在白色PVC底板上依次相互交错2mm粘贴上NC膜、标记了fPSA抗体和鼠抗兔IgG的荧光微球结合物垫、样品垫、吸水垫，然后再用配套的上下两个塑料卡壳固定试纸条组装而成的测试卡，NC膜上预包有fPSA抗体检测线和兔IgG质控线，本发明将时间分辨荧光免疫层析技术引入到了血液中fPSA的定量检测中，不仅大大的节约了检测时间，提升了检测的稳定性和灵敏度，而且操作简便，可用于现场筛查；同时也具有成本便宜，性价比高的优点。

Description

一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及 制备方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法。

背景技术

游离前列腺特异性抗原（free Prostate Specific Antigen, fPSA）在血液中小部分以游离形式存在，未与α1糜蛋白结合的PSA片段。正常人约80％的t-PSA以结合形式存在，f-PSA约占20％。PSA仅由前列腺上皮细胞分泌，具有很高的组织特异性，在前列腺癌（Prostate Cancer, PCA）患者血清中可明显升高，但对其诊断的特异性并不高，良性前列腺增生（Benign Prostate Hyperplasia,BPH）、前列腺息肉、前列腺缺血、细菌性前列腺炎等都可轻度升高。目前，国内通常把TPSA>4ng/ml作为筛选前列腺癌的临界值，把TPSA结果在4～10ng/ml之间称为灰色区域，前列腺癌与前列腺增生均有可能，而当TPSA>10ng/ml时，前列腺癌可能性极大。对于f-PSA/TPSA比值，各文献报道不一致，有以0.16为标准的，也有以0.19或0.25等为临界值，当血清TPSA在灰色区域时，f-PSA/TPSA显得非常重要，f-PSA/TPSA大于临界值时，前列腺癌可能性小，当f-PSA/TPSA值小于临界值时，前列腺癌可能性较大。

目前的血液中fPSA的诊断技术主要包括：酶联免疫实验（ELISA）、化学发光（CLIA）、胶体金免疫层析等方法，但这些方法都有各自的特点及不足：ELISA和化学发光以及时间分辨荧光法原理类似，只在灵敏度方面有差异，目前大都实现了自动化、大批量、定量检测，但是存在方法间结果差异大，线性范围较窄等缺点，另外，自动化检测目前由国外大厂商所垄断，仪器设备昂贵，并且不适合单人份和较小批量检测用，大大限制了它们在基层医院、诊所的应用，近年来出现了胶体金免疫层析法来检测总fPSA，快速，便捷，单人份操作，但是缺点是只能实现半定量，只能指示一个大概范围，无法实现精确定量，而且因为胶体金灵敏度的限制，无法检测血液中含量低的游离的fPSA，异常标本需要使用其他方法复核检测，无形中增加了被测试者的就医成本，在市场推广方面有较大难度，很难大面积使用。

时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）是在传统荧光分析的基础上创立的一种新型非放射性免疫分析技术。TRFIA以含有镧系稀土元素的纳米微球作为标记物的，根据镧系金属螯合物荧光持续时间长且Stokes位移大，用时间分辨技术测量荧光，有效排除非特异性荧光的干扰，具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等特点。与经典的时间分辨荧光免疫分析方法DELFIA法不同，时间分辨荧光免疫层析技术采用荧光纳米微球作为标记物，每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了标记效率，有效的提高了灵敏度；同时纳米荧光微球表面修饰有合适密度的羧基，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高标记物的稳定性。随着科技的发展，即时诊断领域中的免疫层析技术，从第一代胶体金、彩色乳胶到第二代荧光微球技术，实现了从定性到定量分析的飞跃。而时间分辨荧光免疫层析技术则更进一步，提升了检测的稳定性和灵敏度，而且操作简便，检测时间短，可用于现场筛查；同时也具有成本便宜，性价比高的优点。

时间分辨荧光免疫层析是以乳胶微球标记抗体进行免疫反应检测标本中的生物活性物质，通过检测荧光纳米微球发出的荧光强度来提供对生物样品的定量检测数据，采用标记的免疫复合物-荧光强度的标准曲线，从而计算出待测生物样品的量。目前常用的标记乳胶微球为荧光纳米微球，没有特定波长紫外光的照射情况下不会激发荧光，只有在特定波长的紫外灯照射下才会发出荧光，商品化荧光纳米微球都经过了表面的修饰，大大方便了标记的过程，标记简便，重复性好。

发明内容

本发明的目的即是将时间分辨荧光免疫层析技术应用在fPSA定量检测试纸条中，将fPSA抗体和兔IgG分别共价偶联于荧光纳米微球上，二者按比例混合之后作为检测线和质控线，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的干式荧光免疫分析仪进行检测，在实现高灵敏度检测的同时又能大大缩短检测的窗口期，可以避免前述几种检测方法的种种弊端，又综合了前述几种方法的优势：可以单人间检测，也可以批量检测，并且可以即时给出准确的定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。

为达到上述的目的，本发明的技术方案如下：一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条，该测试卡包括底板7和底板7上依次紧密连接的样品垫1、荧光微球结合物垫2、反应膜3和吸水垫6。

其中底板为PVC底板；荧光微球结合物垫上包被有fPSA抗体和鼠抗兔IgG抗体；反应膜为硝酸维生素（NC）膜， NC膜上设有检测线4和质控线5；检测线4上包被有fPSA抗体，质控线5上包被有兔IgG。。

其中所述结合物垫是经过结合物垫处理液预处理的玻璃纤维，所述的结合物垫处理液是含有0.1mg/mL的M004阻断剂，1％的硼酸，0.5％的BSA和3％海藻糖的硼酸盐缓冲液。

在本发明的实施方案中，所述样品垫1、荧光微球结合物垫2、反应膜3和吸水垫6在底板7按顺序排列，其中，所述样本垫1与所述荧光微球结合物垫2部分重合，重合部分长度占所述荧光微球结合物垫2长度的1/5～1/3；所述荧光微球结合物垫2与反应膜3有部分重合，重合部分长度占所述荧光微球结合物垫2长度的1/5～1/3；所述反应膜3与吸水垫6有部分重合，重合部分长度占所述荧光微球结合物垫2长度的1/10～1/5；所述检测线4和质控线5的长度占所述反应膜3长度的1/15～1/10；所述检测线4和样本垫1的距离占所述反应膜3长度的1/4～1/3；所述检测线4和质控线5之间的间距占所述反应膜的1/3～1/2。

在本发明的一个具体实施例中，样本垫1的长度为20mm，荧光微球结合物垫2的长度为6mm，样本垫1与荧光微球结合物垫重合2mm；反应膜3的长度为25mm，反应膜3与荧光微球结合物垫重合2mm；吸水垫6的长度为17mm，吸水垫6和反应膜3的重合2mm；检测线4距离样本垫7mm，检测线和质控线的宽度为2mm，两者相距6mm。

在本发明的一个实施例中，所述fPSA抗体的终浓度为0.05～0.5mg/mL。在本发明的一个优选实施例中，所述fPSA抗体的终浓度为0.1～0.3mg/mL。在本发明的一个最优选实施例中，所述fPSA抗体的终浓度为0.2mg/mL。

在本发明的一个实施例中，所述鼠抗兔IgG抗体的终浓度为0.05～0.5mg/mL。在本发明的一个优选实施例中，所述鼠抗兔IgG抗体的终浓度为0.1～0.3mg/mL。在本发明的一个更优选实施例中，所述鼠抗兔IgG抗体的终浓度0.2 mg/mL。

在本发明的一个实施例中，所述荧光微球的直径为50～500nm。在本发明的一个优选实施例中，所述荧光微球的直径为100～300nm。在本发明的一个更优选实施例中，所述荧光微球的直径为200nm。

在本发明的一个实施全中，所述荧光微球载有镧系元素或其螯合物，所述镧系元素优选为钐、铕或铽。

本发明还提供上述任一种时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

A、结合物垫的处理：用定量喷液装置将结合物垫处理液以16μL/cm的量喷涂于结合物垫上后45℃烘干24小时；

B、NC膜的制备：使用包被缓冲液分别将抗fPSA包被抗体以及兔IgG稀释到0.8mg/mL和1.0mg/mL浓度，使用定量喷液装置分别将两者以0.5-0.8cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，后于45℃烘干72小时，加入干燥剂封存备用；

C、结合物垫的制备：选用直径为200nm的乳胶微球，使用碳二亚胺（EDC）共价偶联的方式将fPSA抗体和鼠抗兔IgG标记到乳胶微球上；将制备好的乳胶微球使用定量喷液装置以8μL/cm的量喷涂于处理过的结合物垫上；

D、试纸条的组装：在白色PVC底板上依次相互交错2mm地贴上NC膜、结合物垫、样品垫、吸水垫，即得到时间分辨荧光免疫层析试纸条。

进一步，上述的步骤C包括以下三步：

1）荧光标记抗体的制备：选用直径为200nm的乳胶微球，使用含有0.05mol/L的MES缓冲液洗涤乳胶微球，加入EDC和NHS使终浓度为分别为0.5mg/mL和5mg/mL，超声混匀置摇床避光孵育15min，离心20min去上清，用MES洗涤两次后加入抗体，使得抗体终浓度为0.2mg/mL，置于摇床避光孵育3h，加入30％封闭液，置于摇床避光孵育1.5h，封闭完成后去上清，用MES洗涤两次，0.05% Tween-20，0.1%酪蛋白和0.5％BSA的50mmol Tris-Hcl pH8.2的保存缓冲液，复溶乳胶微球，4℃保存备用；使用同样的方法将鼠抗兔IgG标记到乳胶微球上，后用结合物稀释液以1:10-1:15的比例将标记好的fPSA和鼠抗兔IgG抗体稀释。

进一步，上述的步骤C中，荧光微球抗体的喷涂方法是：将稀释好的荧光微球抗体混合物使用定量喷液装置以8μL/cm的量喷涂于处理过的结合物垫上，干燥后加入干燥剂封存备用。

进一步，上述的步骤B中，NC膜的制备方法是：用包被缓冲液将fPSA抗体稀释为0.8mg/mL，羊抗兔IgG稀释为1mg/mL，使用定量喷膜装置以1μL/cm的量将两者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，后于45℃烘干72小时，加入干燥剂封存备用。

与现有快速检测试纸条相比较，本发明具有以下优点：

1）通过对试纸条的改进，首次将时间分辨荧光免疫层析技术引入fPSA的检测中，结合干式荧光免疫分析仪，实现了fPSA的定量检测，为临床使用提供了极大的便利。

2）首次实现在一个试纸条上检测fPSA，大大方便了临床诊断。

本发明操作简便，适合大规模生产，检测所需的便携式设备也已经上市，因此能广泛用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位以及一些采血现场、农村和基层诊所等小批量或单人份使用的单位使用。对于乳腺癌的定量诊断有着积极的意义。

附图说明

图1显示了本发明时间分辨荧光免疫层析法定量检测血液中fPSA的试纸条结构示意图。

图2显示了本发明一个具体的试纸条结构示意图。

图3显示了发明检测卡检测fPSA的双对数标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明所述的定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条如图2所示，该试纸条在底板7上依次相互交错2mm地粘贴上NC膜3、结合了fPSA抗体和鼠抗兔IgG的结合物垫2、样品垫1、吸水垫6组装而成的试纸条，NC膜3上预包被有检测线4（fPSA抗体）和质控线5（兔IgG）。

在具体实施例中，所采用fPSA抗体为单克隆抗体技术制备的单抗，利用双抗体夹心检测fPSA抗原的原理检测标本，当待测标本中含有fPSA抗原时，抗原会先和结合物垫上偶联的抗体结合，随着层析作用的进行，结合物向前移动到达fPSA抗体包被线4处，抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在包被线4处，另外，兔IgG标记荧光微球抗体会继续前行，到达质控线5时，鼠抗兔IgG会与兔IgG结合从而在C线处同样出现荧光微球聚集。整个反应在30分钟内进行完全，一般反应十五分钟后即可进行上机读卡，检测线以及质控线都会产生相应的荧光信号值，时间分辨荧光免疫层析检测仪会根据检测卡上的二维码信息将实际测值代入预设的标准曲线即可得出确定量的结果。整个读卡、识别二维码、将实测值代入预设标准曲线得出定量值的过程已经完全程序化，干式荧光免疫分析仪会直接给出定量的结果。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例 1 定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及试剂盒的制备方法

本实施例的制备方法包括以下步骤：

A、NC膜的制备：

包被缓冲液的配制：0.05mol/L pH 7.4的PB缓冲液和1％海藻糖，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期两周。

NC膜的包被：用包被缓冲液将fPSA抗体稀释为0.8mg/mL，兔IgG稀释为1.0mg/mL，使用定量喷膜装置以1μL/cm的量将两者以0.6cm的间隔均匀喷印于2.5cm宽度硝酸纤维膜上，后于45℃烘干72小时，加入干燥剂封存备用。

B、荧光微球抗体的制备：

0.05mol/L的MES缓冲液的配制：用纯化水和MES配制pH值为6.0，浓度为50mmol/L的MES缓冲液，0.22μm微孔滤膜除菌后4℃保存备用，有效期两周。

储存液的配制：用纯化水、浓HCl和Tris配制终浓度50mmol的Tris-HCl缓冲液，加入BSA，Casein，Tween-20，终浓度分别是0.5%、0.1%、0.05%，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用有效期两周。

荧光标记抗体的制备：选用直径为200nm的乳胶微球，使用含有0.05mol/L的MES缓冲液洗涤乳胶微球，加入EDC和NHS使终浓度为分别为0.5mg/mL和5mg/mL，超声混匀置摇床避光孵育15min，离心20min去上清，用MES洗涤两次后加入抗体，使得抗体终浓度为0.2mg/mL，置于摇床避光孵育3h，加入30％封闭液，置于摇床避光孵育1.5h，封闭完成后去上清，用MES洗涤两次，0.05% Tween-20，0.1%酪蛋白和0.5％BSA的50mmol Tris-Hcl pH8.2的保存缓冲液，复溶乳胶微球，4℃保存备用；使用同样的方法将鼠抗兔IgG标记到乳胶微球上，后用结合物稀释液以1:10-1:15的比例将标记好的fPSA和鼠抗兔IgG抗体稀释。

C、结合物垫的处理

用定量喷液装置将结合物垫处理液以16μL/cm的量喷涂于6mm的玻璃纤维上后以45℃烘干24小时。

结合物垫处理液是含有0.1mg/mL的M004阻断剂，1％的硼酸，0.5％的BSA和3％海藻糖的硼酸盐缓冲液。

D、荧光微球抗体的喷涂和干燥

使用IsoFlow喷膜仪的专用喷头将配制好的荧光微球混合物以8μL/cm的量均匀喷涂上0.6cm宽度处理过的玻璃纤维垫上，45℃干燥72h，加入干燥剂封存备用；

E、试纸条的组装及切割

下述所有操作都必须在湿度小于30%，温度20-25℃的房间内进行。

试纸板的组装：按照要求将2.5cmNC膜，1.7cm吸水纸，0.6cm结合物垫，2.0cm样品垫组装于6.0cm宽度白色PVC底板上，组装成试纸板。

试纸条的裁切：使用BioDot CM 4000型切条机将组装好的试纸板切成0.4cm宽的成品试纸条。

F、试纸卡的组装

将本发明所述的切割好的单人份试纸条置于塑料底片卡上的卡槽内，盖上上盖，使用压卡机将上下两片塑料卡压紧，确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温封存备用。

G、确定该批次的二维码信息

品名：游离前列腺特异性抗原（fPSA）检测试剂盒（时间分辨荧光免疫层析法）

批次：试纸卡的组装日期，格式为：年/月/日，XXX/XX/X

H、二维码的打印

将包含项目名称和批号的二维码图案通过激光喷码机喷涂于测试卡上盖的特定位置，使用干式荧光免疫分析仪随机抽检2%确保二维码读取无误。

I、成品包装

将喷涂过二维码的单人份测试卡与一包干燥剂密封于铝箔袋内，20人份为一个包装置一个包装盒内，一盒一份说明书和一个写有标准曲线的ID芯片，于室温避光保存，保质期为18个月。

实施例2

除了荧光微球抗体的制备的步骤中：加入fPSA抗体与乳胶微球的分子比为10:1。其它步骤同实施例1。

实施例3

除了荧光微球抗体的混合步骤中：将二者使用结合物稀释液以1:10的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例1。

实施例4

除了标记好的荧光微球的混合步骤中：将二者使用结合物稀释液以1:15的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例1。

实施例5 本发明检测卡标准曲线建立

取fPSA标准抗原原料，以国家标准品为参考标准进行标定，用标准品稀释液稀释成40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL，每个标准点作10个测试，按照统计学方法确定每个标准点与荧光测量值的关系并建立方程使之拟合成线性，此方程和标准曲线即可使干式荧光免疫分析仪得以确定标本测量值。

标准曲线根据双对数法绘制，如图3所示。结果表明，荧光- fPSA浓度双对数曲线相关系数R达到0.9964，具有良好的线性关系。

实施例6 本发明的检测卡的使用方法

1、加样

从包装盒中取出单人份的检测卡，斯卡铝箔袋包装，将试纸卡置于平整桌面上，用微量移液器取70μL血清样本加入卡上的加样孔内，等待反应进行15分钟。

2、测量及结果输出

首先将ID芯片插入ID卡口，然后在仪器上读取ID芯片，再 将检测卡插入干式荧光免疫分析仪的插卡口，运行仪器，仪器会自行读取卡的二维码信息，进行测量并即时打印测量结果，定量结果会在打印结果中显示。

实施例7 本发明检测卡的灵敏度

采用fPSA标准品配制不同浓度的供试溶液，具体浓度为0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg/L。

分别将浓度供试溶液滴加到实施例1-4制备的时间分辨荧光免疫层析检测卡的样品垫上，反应5-8min，然后将试纸条放入简易荧光检测仪检测窗口，在300～400nm光源激发下，观察结果。

结果表明，实施例1-4制备的检测卡灵敏度极佳，达到<0.25μg/L。

实施例8 本发明检测卡的稳定性

将实施例1-4制备的检测卡在室温下放置3、6和12个月，然后按照实施例7的方法进行灵敏度测试。

结果表明（表1），检测卡存放3个月后，实施例1-4制备的检测卡的灵敏度依然全部达到<0.25μg/L。检测卡存在6个月后，实施例2和实施例4制备的检测卡灵敏度有所下降，为<0.5μg/L，但实施例1和实施例3制备的检测卡灵敏度依然达到<0.25μg/L。检测卡存放12个月后，实施例2制备的检测卡灵敏度下降至<1μg/L，实施例2制备的检测卡灵敏度下降至<2μg/L，而实施例1和实施例3、实施例4制备的检测卡灵敏度仍然可以达到<0.5μg/L。

表1 检测卡放置3、6和12个月后灵敏度结果

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					3个月	<0.25μg/L	<0.25μg/L	<0.25μg/L	<0.25μg/L
6个月	<0.25μg/L	<0.5μg/L	<0.25μg/L	<0.5μg/L
					12个月	<0.5μg/L	<2μg/L	<0.5μg/L	<0.5μg/L

实施例9 本发明检测卡的精密度

采用本实施例1-4制备的检测卡对100份经高效液相串联质谱检测为fPSA阴性的样本，室温条件下按照本发明采用定性检测方法进行检测，观察检测结果进行判断。

实验结果超出检出限的为阳性，未超出检出限的为阴性。

结果表明，100份阴性样本中，利用实施例1制备的检测卡检测出阴性结果99份，假阳性1份，假阳性率为1%，准确率为99%。利用实施例2-3制备的检测卡检测出阴性结果97份，假阳性3份，假阳性率为3%，准确率为97%。利用实施例4制备的检测卡检测出阴性结果100份，假阳性0份，假阳性率为0%，准确率为100%。

同样，采用本实施例1-4制备的检测卡对100份fPSA浓度为0.5μg/L样本，室温条件下按照本发明采用定性检测方法进行检测，观察检测结果进行判断。

结果表明，100份阴性样本中，利用实施例1制备的检测卡检测出阳性结果100份，假阴性0份，假阴性率为0%，准确率为100%。利用实施例2制备的检测卡检测出阳性结果99份，假阴性1份，假阴性率为1%，准确率为99%。利用实施例3和4制备的检测卡检测出阳性结果96份，假阴性4份，假阴性率为4%，准确率为96%。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，包括PVC底板，底板上依次相互交错2mm粘贴上NC膜、标记了fPSA抗体和鼠抗兔IgG的荧光微球结合物垫、样品垫、吸水垫，

所述NC膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有fPSA抗体，所述质控线上包被有兔IgG，所述检测条用配套的上下两个塑料卡壳固定。

2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫、荧光微球结合物垫、反应膜和吸水垫在底板按顺序排列。

3.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述fPSA抗体的终浓度为0.2mg/mL；所述鼠抗兔IgG抗体的终浓度为0.2mg/mL。

4.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球的直径为200nm。

5.根据权利要求1-4任一所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球载有镧系元素或其螯合物，所述镧系元素优选为钐、铕或铽。

6.根据权利要求1-5任一所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、结合物垫的处理：用定量喷液装置将结合物垫处理液以16μL/cm的量喷涂于结合物垫上后45℃烘干24小时；

B、NC膜的制备：使用包被缓冲液分别将抗fPSA包被抗体以及兔IgG稀释到0.8mg/mL和1.0mg/mL浓度，使用定量喷液装置分别将两者以0.5-0.8cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，后于45℃烘干72小时，加入干燥剂封存备用；

C、结合物垫的制备：选用直径为200nm的乳胶微球，使用碳二亚胺（EDC）共价偶联的方式将fPSA抗体和鼠抗兔IgG标记到乳胶微球上；将制备好的乳胶微球使用定量喷液装置以8μL/cm的量喷涂于处理过的结合物垫上；

D、试纸条的组装：在白色PVC底板上依次相互交错2mm地贴上NC膜、结合物垫、样品垫、吸水垫，即得到时间分辨荧光免疫层析试纸条。

7.根据权利要求6所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤C中将fPSA抗体和鼠抗兔IgG标记到乳胶微球上的步骤为：使用含有0.05 mol/L的MES缓冲液洗涤乳胶微球，加入EDC和NHS，超声混匀置摇床避光孵育15min，离心20min去上清，用MES洗涤两次后加入抗体，置于摇床避光孵育3h，加入30％封闭液，置于摇床避光孵育1.5h，封闭完成后去上清，用MES洗涤两次，0.05% Tween-20，0.1%酪蛋白和0.5％BSA的50mmolTris-Hcl pH8.2的保存缓冲液，复溶乳胶微球，4℃保存备用；使用同样的方法将鼠抗兔IgG标记到乳胶微球上，后用结合物稀释液将标记好的fPSA和鼠抗兔IgG抗体稀释。

8.根据权利要求7所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，加入EDC和NHS使终浓度为分别为0.5mg/mL和5mg/mL。

9.根据权利要求7所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述加入抗体使得抗体终浓度为0.2mg/mL。

10.根据权利要求7所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述结合物稀释液以1:10～1:15的比例将标记好的fPSA和鼠抗兔IgG抗体稀释。