CN101762697A - 一种定量检测血液中肿瘤相关抗原15-3的磁性免疫层析试纸条及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种定量检测血液中肿瘤相关抗原15-3的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是在底板上依次相互交错2mm粘贴上包被膜、结合了肿瘤相关抗原15-3抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的试纸条，包被膜上预包被有肿瘤相关抗原15-3抗体检测线和质控线，本发明将磁性免疫层析技术引入到肿瘤相关抗原15-3的定量检测中，大大提高了检测灵敏度，并且可以准确的给出定量结果，操作简便，诊断快速。

Description

一种定量检测血液中肿瘤相关抗原15-3的磁性免疫层析试纸条及制备方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种定量检测血液中肿瘤相关抗原15-3的磁性免疫层析试纸条及制备方法。

背景技术

1984年Hilkens等从人乳脂肪球膜上糖蛋白MAM-6制成的小鼠单克隆抗体(115-DB)1984年Kufu等自肝转移乳腺癌细胞膜制成单克隆抗体(DF-3)。CA15-3是一种乳腺癌相关抗原，属糖蛋白，分子量超过400kD。乳腺癌患者常有CA15-3升高，但在乳腺癌的初期敏感性较低，转移性乳腺癌阳性率可达80％。CA15-3可以作为原发性乳腺癌的辅助诊断指标，也可以作为手术后随访，监测肿瘤复发、转移的指标。其它恶性肿瘤，如肺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、原发性肝癌等也有不同程度的阳性率。肝脏、胃肠道、肺、乳腺、卵巢等非恶性肿瘤疾病，阳性率一般低于10％。

目前的血液中CA15-3的诊断技术主要包括：放射免疫分析(RIA)，酶联免疫分析(ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA)、时间分辨荧光免疫分析、胶体金免疫层析等方法，但这些方法都有各自的特点及不足：放射免疫是临床比较常用的方法，优点是结果比较准确，线性范围较宽，缺点是操作繁琐，耗时长，且放射性标记物会对操作者产生危害，并且会产生环境污染，目前已经逐渐被其他方法所替代。ELISA和化学发光以及时间分辨荧光法原理类似，只是因为最终的检测系统有所区别而在灵敏度方面有差异，目前已经实现自动化、大批量、定量检测，但是存在方法间结果差异大，线性范围较窄等缺点，同时，自动化检测目前由国外大厂商所垄断，仪器设备昂贵，并且不适合单人份和较小批量检测用，大大限制了它们在基层医院、诊所的应用。近年来出现了胶体金免疫层析法来检测CA15-3，快速，便捷，单人份操作，但是缺点是只能实现半定量，只能指示一个大概范围，无法实现精确定量，异常标本需要使用其他方法复核检测，增加了被测试者的就医成本，在市场推广方面有较大难度，很难广泛使用。

磁性免疫层析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年来出现的一种单人份快速定量检测技术。是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米微粒上的生化物质来提供对生物样品的定量检测数据。通过检测测量磁场强度来表达标记在样品区域的量，采用标记的免疫复合物-磁场强度的标准曲线，从而达到定量的目的。该技术与传统技术相比具有下述优势：a.所用磁性检测仪器采用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；b.灵敏度比各类目测快速诊断法高10-100倍；c.分析速度可在15秒内测量到多达6个分析位点的数据；d.线形范围在4个数量级浓度范围内呈线性；e.超顺磁性纳米微粒由聚合物包被，不会随时间而衰变。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒等)简便快速，单人份操作的优点，又弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定量的缺点，代表了当今即时检验(Point of Care Test，POCT)技术发展的方向和潮流，一经问世，发展迅速，目前已经成为替代传统免疫层析技术的首选。

将超顺磁性颗粒引入免疫层析中，在极大地提高了检测方法的灵敏度的同时，又提供了一种极好的定量分析技术平台，有利于大规模生产。

发明内容

本发明的目的即是将免疫层析技术和超顺磁性颗粒技术联合应用在CA15-3定量检测试纸条中，将一株CA15-3抗体共价偶联于超顺磁颗粒上，将另一株配对的CA15-3抗体包被于硝酸纤维素膜上作为捕获固相，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行检测，在实现高灵敏度检测的同时又能大大缩短检测的窗口期，可以避免前述几种检测方法的种种弊端，又综合了前述几种方法的优势：可以单人份检测，也可以批量检测，并且可以即时给出定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。

为达到上述的目的，本发明的技术方案如下：一种定量检测血液中CA15-3的磁性免疫层析试纸条，该试纸条是在底板上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜、结合了CA15-3抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的试纸条，包被膜上预包被有CA15-3抗体检测线T和质控线C。

其中所述的样品垫是经过样品垫处理液预处理的纤维素膜，所述的样品垫处理液是含有1％-5％酪蛋白(Casein)和0.1％-1％的聚乙烯醇(PVA)以及0.01-0.2％吐温20(Tween-20)的0.02M pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲液(PBS)。

上述定量检测血液中CA15-3的磁性免疫层析试纸条制备方法包括以下步骤：

A、磁颗粒的制备：选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)共价偶联的方式将CA15-3抗体标记到磁颗粒上，以1∶2-1∶5的比例(摩尔比)与磁颗粒混合；

B、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25μl/cm-50μl/cm的量喷涂于磁颗粒垫上；

C、包被膜的制备：使用包被缓冲液分别将抗CA15-3包被抗体以及抗鼠的二抗稀释到0.5-2mg/ml浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0.5-1.0cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35度烘干8小时，加入干燥剂封存备用；

D、样品垫的处理：将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时；

E、试纸条的组装：在透明塑料底板上依次相互交错2mm地贴上包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸条。

进一步，上述的步骤A包括以下步骤：

使用含有0.1％Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和CA15-3抗体使CA15-3抗体与磁颗粒的比例为5∶1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02M，pH7.0-7.6的PBS室温封闭30分钟，用上述醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，1％Casein，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mM(pH8.2-9.0)硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4℃保存备用；

进一步，上述的步骤B中，磁颗粒的喷涂方法是：将制备好的磁颗粒使用定量喷膜装置以50μl/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。

进一步，上述的步骤C中，包被膜的制备方法是：用包被缓冲液(0.02M pH 7.2的磷酸缓冲液)将CA15-3抗体稀释为0.5mg/ml，抗鼠的二抗稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将二者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液(含有0.5％BSA的0.02M PBS，pH7.0-7.6)中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

与现有快速检测试纸条相比较，本发明具有以下优点：

1)通过对试纸条的改进，首次将磁性免疫层析技术引入CA15-3的检测中，结合磁性检测仪，实现了CA15-3的单人份宽范围定量检测，为临床使用提供了极大便利。

2)通过引入磁颗粒系统，使得试纸条的检测灵敏度比传统的免疫层析技术提高了100倍。

本发明操作简便，适合大规模生产，检测所需的便携式设备也已经上市，因此能广泛用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位以及一些采血现场、农村和基层诊所等小批量或单人份使用的单位使用。对于乳腺癌的定量诊断有着积极的意义。

附图说明

图1为本发明磁性免疫层析法定量检测血液中CA15-3的试纸条结构示意图

为进一步说明本发明磁性免疫层析法定量检测血液中CA15-3的试纸条及制备方法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

具体实施方式

本发明所述的定量检测血液中CA15-3的磁性免疫层析试纸条如图1所示，该试纸条是在底板1)上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜2)、结合了CA15-3抗体的磁颗粒垫3)、样品垫4)、吸水垫5)，然后在上层覆盖透明塑料密封膜6)组装而成的试纸条，包被膜2)上预包被有CA15-3抗体检测线T和质控线C。

在具体实施例中，所采用CA15-3配对抗体为单克隆抗体技术制备的单抗。利用双抗体夹心检测CA15-3抗原的原理检测标本，当待测标本中含有CA15-3抗原时，抗原会先和磁颗粒上偶联的抗体结合，随着层析作用的进行，结合物向前移动到达CA15-3抗体包被线T处，抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在T线处，另外，未结合的偶联CA15-3抗体的磁颗粒会继续前行，到达指控线C时，抗鼠的二抗会与CA15-3抗体结合从而在C线处同样出现磁颗粒聚集。整个反应在30分钟内进行完全，一般反应十五分钟后即可进行上机读卡，T线以及C线都会产生相应的磁性信号值，磁性免疫层析检测仪会根据检测卡上的二维码信息将实际测值代入预设的标准曲线即可得出确定量的结果。整个读卡、识别二维码、将实测值代入预设标准曲线得出定量值的过程已经完全程序化，磁性检测仪会直接给出定量结果。

本发明所述的定量检测血液中CA15-3的磁性免疫层析试纸条的制备方法见以下实例：

实施例1

定量检测血液中CA15-3的磁性免疫层析试纸条及试纸盒的制备方法

本实施例的试纸条及试纸盒的制备方法包括以下步骤：

A、抗体制备：选用商品化的的CA15-3配对抗体，对20mM，pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS 4℃透析过夜备用。

B、包被膜的制备：

包被缓冲液的配制：0.02M pH 7.2的磷酸缓冲液(PB)为包被缓冲液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期两周。

封闭液的配制：含0.5％BSA的0.02M，pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置于4℃保存备用，有效期一周。

包被膜的制备：用包被缓冲液(0.02M PB，pH7.2(pH7.0-7.6均适用))将CA15-3抗体稀释为0.5mg/ml，抗鼠的二抗稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将二者以0.6cm的间隔均匀喷印于3.5cm宽度硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液(含有0.5％BSA的0.02M PBS，pH7.2(pH7.0-7.6均适用))中浸泡10分钟后于25-35度烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

C、磁颗粒的制备：

醋酸钠缓冲液的配制：用双蒸水和醋酸钠及冰醋酸配制pH值为4.7(pH4.5-5.0均适用)，浓度为50mM的醋酸缓冲液，加入Tween-20至终浓度为0.1％，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用，有效期两周。

硼酸保存缓冲液的配制：用双蒸水，硼酸和硼砂配制pH为8.5(pH8.2-9.0均适用)，终浓度为50mM的硼酸缓冲液，加入PVP，Casine，Tween-20，蔗糖，终浓度分别为1％，1％，0.5％，5％，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用，有效期一周。

磁颗粒的制备：使用含有0.1％Tween-20的50mM，pH4.7(pH4.5-5.0均适用)醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol，室温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后，加入CA15-3抗体使CA15-3抗体与磁颗粒的比例为5∶1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02M，pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS室温封闭30分钟，使用含有0.1％Tween-20的50mM，pH4.7(pH4.5-5.0均适用)的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，1％Casein，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mM pH 8.5(pH8.2-9.0均适用)硼酸保存缓冲液，复溶磁颗粒，4℃保存备用。

D、磁颗粒的喷涂与冻干

使用BioDot喷膜仪的专用喷头将处理好的磁颗粒以50μl/cm的量均匀喷涂于0.8cm宽度玻璃纤维垫上，过夜冷冻干燥，加入干燥剂封存备用，

E、样品垫的处理

将1.8cm宽度样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时。

样品垫处理液是含有1％-5％Casein和0.1％-1％的PVA以及0.01-0.2％Tween-20的0.02M，pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS溶液。

F、试纸条的组装及切割

下述所有操作都必须在湿度小于20％，温度20-25℃的房间内进行。

试纸板的组装：使用BioDot LM5000型组装仪按照要求将3.5cm包被膜，2.5cm吸水纸，0.8cm磁颗粒垫，1.8cm样品垫组装于9.8cm宽度透明塑料底板上，覆盖上层透明塑料盖板，组装成试纸板。

试纸条的裁切：使用BioDot CM4000型切条机将组装好的试纸板切成0.5cm宽的成品试纸条。

G、试纸卡的组装

将本发明所述的切割好的单人份试纸条置于塑料底卡上的卡槽内，盖上上盖，使用压卡机将上下两片塑料卡压紧，确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温封存备用。

H、确定该批次的二维码信息

品名：CA15-3定量磁性检测卡

批次：试纸卡的组装日期，格式为：年/月/日，XXXX/XX/XX

判读标准的确定：取CA15-3标准抗原原料，用标准品稀释液稀释成500U/mL，150U/mL，50U/mL，15U/mL，5U/ml，每个标准点作10个测试，按照统计学方法确定每个标准点与磁性测量值的关系并建立方程使之拟合成线性，此方程和标准曲线即可使磁性检测仪得以确定标本测量值。

标准品稀释液配方：20mmol PBS，pH7.2(pH7.0-7.6均适用)，0.5％BSA，0.01％NaN3。

I、二维码的打印粘贴

将上述二维码信息输入二维码打印机内并打印，将二维码粘贴于试纸卡的特定位置，使用二维码粘贴位置检测器随机抽检2％确保二维码粘贴无误。

J、成品包装

将贴好二维码的单人份试纸卡与一包干燥剂密封于铝箔袋内，100人份为一个包装置于一个包装盒内，一盒一份说明书和1瓶10ml装层析缓冲液即制成试纸盒，该试纸盒于室温避光保存，保质期为18个月。

层析缓冲液配方为：1％Tween-20，0.5％Triton X-100，1％NP-40，0.05％NaN₃，20mmolPBS，pH7.2(pH7.0-7.6均适用)。

实施例2

除了CA15-3抗体的磁颗粒的制备的步骤中：CA15-3抗体使CA15-3抗体与磁颗粒的比例为1∶3，其它步骤同实施例1，

实施例3

除了CA15-3抗体的磁颗粒的制备的步骤中：CA15-3抗体使CA153抗体与磁颗粒的比例为1∶8，其它步骤同实施例1。

实施例4

本发明的检测卡的使用方法

1、加样

从包装盒中取出单人份的检测卡，撕开铝箔带包装，将试纸卡置于平整桌面上，用微量移液器取50μl样本血清加入卡上的加样孔内，再加入50μl层析缓冲液，等待反应进行15分钟。

2、测量及结果输出

将检测卡插入磁性免疫层析检测仪的插卡口，运行仪器，仪器会自行读取卡的二维码信息，进行测量并即时打印测量结果，阴阳性结果会在打印结果中显示。

实施例5本发明的试纸条的方法学鉴定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试纸条进行检定，

(1)试纸条灵敏度实验

以S0校准品进行10次重复测定，其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试纸条的灵敏度，其灵敏度为2.1U/mL。

(2)试纸条特异性实验

与其类似物作交叉反应实验，交叉反应率＜0.01％。

(3)试纸条精密性实验

批内变异

取低、中、高三份质控血清样品分别进行10孔平行实验，计算测定值的平均值

和标准差(s)。按公式

计算变异系数，批内变异系数CV分别为5.8％，5.2％，4.5％。

批间变异

选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数(CV％)，批间变异CV在8.96～10.69％之间。

(4)试纸条稳定性实验

试纸条保存温度为2-8℃，经过15个月的测定试纸条的各项指标均满足要求，考虑到运输和使用过程中对试纸条的影响，我们进行37℃7天的加速实验，实验结果表明试纸条的各项指标完全符合要求。

说明“定量检测血液中CA15-3的磁性免疫层析试纸条及试剂盒”的灵敏度、特异性、精密性和稳定性是完全合格的。

Claims (7)

1.一种定量检测血液中肿瘤相关抗原15-3(CA15-3)的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条是在底板上依次相互交错2mm地粘贴包被膜、结合了CA15-3抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、然后在上层覆盖透明塑料密封膜而组装成的试纸条，包被膜上预包被有CA15-3抗体的检测线T和质控线C。

2.根据权利要求1的定量检测血液中CA15-3的磁性免疫层析试纸条制备方法，其特征在于：所述的包被膜制备是使用0.02mM，pH7.0-7.6的PBS，分别将抗CA15-3包被抗体以及抗鼠的二抗稀释到0.5-2.0mg/ml浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0.5-1.0cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

3.根据权利要求1的定量检测血液中CA15-3的磁性免疫层析试纸条制备方法，其特征在于：所述的磁颗粒垫制备是选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺共价偶联的方式将CA15-3抗体与磁颗粒联结，将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25-50μl/cm的量喷涂于磁颗粒垫上。

4.根据权利要求1的定量检测血液中CA15-3的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：所述的样品垫是经过样品垫处理液预处理的纤维素膜，所述的样品垫处理液是含有1％-5％酪蛋白和0.1％-1％的聚乙烯醇以及0.01-0.2％吐温-20的0.02M，pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求2所述包被膜的制备方法是：用包被缓冲液将CA15-3抗体稀释为0.5mg/ml，抗鼠的二抗稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将二者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

6.根据权利要求3所述的磁颗粒垫的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

使用含有0.1％Tween-20的50mmol，pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入碳二亚胺和琥珀酰亚胺使二者终浓度均为20mmol，室温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后加入CA15-3抗体使其与磁颗粒的比为5∶1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02M，pH7.0-7.6的PBS室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，1％Casein，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mmol，pH8.2-9.0的硼酸保存缓冲液，复溶磁颗粒，4℃保存备用。

7.根据权利要求3所述磁颗粒的喷涂方法是：将制备好的磁颗粒使用定量喷膜装置以50μl/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。

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