CN102116770B - 一种免疫层析快速试剂盒及其生产制备 - Google Patents
一种免疫层析快速试剂盒及其生产制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及了一种免疫层析试纸条的生产方法及应用这种生产方法而制备的甲胎蛋白快速定量免疫层析试纸条和C反应蛋白快速定量免疫层析试纸条。该层析试纸条采用上转发光材料即UCP作为生物标记物。其结构主要包括：样品垫、结合垫或结合物稀释垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料卡组成。本发明涉及了产业化生产这种上转发光法免疫层析试纸条的方法、使用方法。应用该上转发光检测免疫层析试纸条可快速、简便、定量的测定被检测物的含量，准确的对疾病进行，为疾病的预防、诊断、治疗提供支持。
Description
技术领域
本发明涉及了一种免疫层析试纸条、其制备方法及含有所述试纸条的试剂盒。具体而言，本发明涉及一种基于上转发光技术的免疫层析试纸条，采用冻干法生产所述免疫层析试纸条的生产方法，以及包含所述免疫层析试纸条的检测试剂盒。本发明还涉及了应用上述生产方法生产的用于检测甲胎蛋白、C反应蛋白的免疫层析试纸条及其试剂盒。
背景技术
中国专利申请200410034104.0中记载了一种被称为上转发光材料(UCP)的物质以及应用该材料作为标记物的免疫层析试纸条。
虽然上转发光材料具有高灵敏性、高稳定性、高简易性、高灵活性和高安全性等诸多优点，使其在作为生物标记物方面具有广泛的应用前景。但是至今仍然没有一种商品化的上转发光法定量检测试纸可以供临床使用，原因是在于现有的基于上转发光法的免疫层析试纸条无法满足对定量检测试纸的生产质量要求。如中国专利申请200410034104.0所述，以往UPT(上转发光技术，Up-Converting Phosphor Technology)快速试纸的制备方法中结合垫或结合物释放垫是采用烘干方法。由于UCP颗粒容易团聚，导致烘干结合垫后裁剪的变异过大，批内精密度低，变异系数(CV)大于15％。变异系数CV常被用于表示精密度，包括批内和批间变异系数两种(分别对应于批内精确度和批间精确度)，CV越小精密度越高。批间精密度的CV值一般大于批内，低含量标本的CV值一般大于高含量标本。最常见的精密度评价是对稳定的样品作多次测定，求这些重复测定值的均值和标准差s，以及变异系数CV。重复次数一般要求10-20次。若在一批内的重复测定，这是批内精密度；卫生部发的《临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则》WS/T124-1999中有这方面的检测和计算方法的规定。一般临床免疫试剂的批内和批间CV均应该≤15％。
医院实验室对病人标本检测时，由于该行业的沿袭特点，一直是对每份标本只作一次检测发出报告。因此国际上将精密度性能列为实验方法、仪器或试剂盒分析性能的第一位。检测结果必须具重现性，也即具有良好的精密度。因此急需开发出具有较高精密度的基于上转发光法技术的免疫层析试纸条。
甲胎蛋白(α-Fetoprotein，AFP)是1956年Bergstrandh和Czar在人胎儿血清中发现的一种专一性的甲种球蛋白，是胚胎早期的主要蛋白质，来源于胎儿肝脏和卵黄囊。胎儿的AFP浓度非常高，可达1-10mg/ml，但在出生后迅速下降，生后2个月只有痕量AFP可检测到，并几乎完全被血清白蛋白所替代。甲胎蛋白是原发性肝细胞癌(PHC)较为特异的肿瘤标志物，70％以上的患原发性肝细胞癌病人早期血清中AFP含量升高。同时在其它一些恶性肿瘤中也能发现AFP水平升高，如睾丸癌。对血清中AFP含量的检测可以用作肝癌高发区普查以及肝癌的早期临床诊断，同时也可以评定肝癌的治疗效果和判断预后。
C-反应蛋白(CRP)是参与炎症的主要时机反应蛋白，在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗塞、手术创伤、放射性损伤等疾病发作后数小时迅速升高，并有成倍增长之势。病变好转时，又迅速降至正常，其升高幅度与感染的程度呈正相关。C-反应蛋白还可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断。一旦发生炎症，C-反应蛋白水平即升高，而病毒性感染C-反应蛋白大都正常。
近年来发现C-反应蛋白浓度甚至在正常范围内的轻度升高都与心血管疾病发生的危险性增加有关，可以推测以后心肌梗死事件发生的可能性。超敏C-反应蛋白是心脑血管疾病中的一项独立风险预测指标，可以敏感地预测糖尿病合并心、脑血管事件的危险发生率。
AFP和CRP都是常见的POCT检测指标。应用上转发光免疫分析技术开发AFP及CRP快速检测免疫层析试纸条应用于床旁快速检测(POCT)领域有临床应用价值，但是批内精密度(CV)应不高于15％才能满足临床使用需要。因此需要具有可以应用于POCT检测的高精密度，基于上转发光技术的成品AFP及CRP快速检测免疫层析试剂条及试剂盒。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足，本发明提供一种基于上转发光技术的采用经冻干法制备的结合垫或结合物释放垫的免疫层析试纸条，具有精密度高即变异系数CV≤15％的特点。
本发明的试纸条是检测原理是通过一系列表面修饰与活化，上转换发光材料UCP(Up-Converting Phosphor，UCP)颗粒可与生物活性分子相结合，利用UPT生物传感器，对在层析过程中通过特异免疫反应结合于特定区域(检测带与质控带)的UCP颗粒进行扫描分析，从而利用由UPT快速定量检验系统实现精确定量或定性。
具体地，本发明提供了一种基于上转换发光技术的免疫层析试纸条，其特征在于含有上转换发光材料(UCP)-生物分子颗粒的结合垫或结合物稀释垫是经冻干的。
在一个优选的实施方案中，所述免疫层析试纸条的分析膜为硝酸纤维素膜。
在另一个优选的实施方案中，所述试纸条包括一外壳，所述外壳上包括加样孔、结果判读窗口和终点指示窗口，如图2B所示。
在另一个优选的实施方案中，通过所述加样孔，将生物样品添加到样品垫上；结果判读窗口对应于分析膜上的检测带和质控带；终点指示窗口对应于吸水垫上的终点指示带，如图2B所示。
在另一个优选的实施方案中，所述生物分子选自AFP抗体、CRP抗体、肌钙蛋白I CTN-I抗体、脑钠肽BNP抗体、N端前体脑钠肽N-pro-BNP抗体、盐酸克伦特罗(瘦肉精)抗体、盐酸莱克多巴胺抗体、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗体、乙肝表面抗原抗体和髓过氧化物酶MPO抗体。优选地，所述上述抗体均为单抗。
本发明还提供了一种制备上述免疫层析试纸条的方法，其中在制备结合垫或结合物稀释垫的过程中，所述结合垫或结合物稀释垫是经冻干的。
在一个优选的实施方案中，所述所述制备结合垫或结合物稀释垫的过程包括：
a)将UCP-生物分子悬浊液离心并弃上清；
b)向a)步骤得到的UCP-生物分子沉淀物中加入UCP保存液，吹打混匀；
c)向b)步骤得到的UCP-生物分子悬浊液中加入冻干液；
d)将c)步骤得到的UCP-生物分子悬浊液中加于玻璃纤维上；
e)将玻璃纤维放于-80℃下，预冻时间0.5小时，真空冻干2小时。
在一个优选的实施方案中，所述UCP保存液为pH7.2的0.15M的磷酸缓冲液，含有2wt％BSA和0.05wt％NaN3，所述冻干液为pH7.2的0.15M的磷酸缓冲液，含有4.2wt％BSA、5.6wt％多糖和1.5wt％甘氨酸。
本发明还提供了一种基于上转换发光技术的免疫层析快速试剂盒，包括本发明的上述免疫层析试纸条。
在一个优选的实施方案中，上述试剂盒中试纸条的生物分子选自AFP抗体、CRP抗体、肌钙蛋白I CTN-I抗体、脑钠肽BNP抗体、N端前体脑钠肽N-pro-BNP抗体、盐酸克伦特罗(瘦肉精)抗体、盐酸莱克多巴胺抗体、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗体、乙肝表面抗原抗体和髓过氧化物酶MPO抗体。优选地，所述上述抗体均为单抗。
在一个实施方案中，本发明提供了一种含有上述AFP-UPT快速检测免疫层析试剂条的试剂盒。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种含有上述CRP-UPT快速检测免疫层析试剂条的试剂盒。
本发明克服了以往烘干法生产上转发光免疫层析试纸条碰到的精密度低，变异系数CV％过大的问题，克服了上转发光法免疫层析试纸条产业化当中的极其重要的问题。使得上转发光法免疫层析试纸条可以应用于临床。
附图说明
图1为两个光子激发UCP产生上转发光的过程。
图2为附图为本发明冻干法上转发光免疫定量检测免疫层析试纸条免疫层析试纸条的剖面结构示意图。其中图2A中1为样品垫、2为结合垫、3为分析膜、4为吸水垫、5为粘性低衬、6为UCP结合物、7为检测带T线、8为质控带C线。图2B中9为加样孔、10为结果判读窗口、11为终点指示窗口。
图3为对比烘干法和冻干法方法差别。
图4为烘干法和冻干法制备的免疫层析试纸条的测量变异对比。
图5为本发明AFP-UPT试剂盒的对AFP定量标准品线性检测结果。
图6为本发明AFP-UPT上转发光检测试剂盒和AFP电化学发光免疫试剂盒测定AFP临床样本比较。
图7本发明CRP-UPT试剂盒对CRP定量标准品的线性检测结果。
图8为为本发明CRP-UPT上转发光检测试剂盒和免疫比浊法贝克曼CRP试剂盒测定CRP临床样本比较。
具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的具体改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：基于上转发光法技术的免疫层析试纸条制备过程中采用烘干法和采用冻干法时的差别及其对CV的影响：
A)对比烘干法和冻干法方法差别(如图3所示)
冻干结合垫的制备：UCP颗粒采购自上海科润光电技术有限公司，玻璃纤维、纤维素膜采购自Millipore公司、塑料卡和吸水垫购买自上海金标生物科技有限公司，塑料卡购买自深圳市金灿华实业有限公司。
a)将50ml UCP标记物(UCP-生物分子)悬浊液，以12000rpm在4℃下离心30min，弃去上清液；
b)在UCP沉淀物中加入5ml的保存液(pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含2wt％BSA和0.05wt％NaN3)，吹打混匀；
c)加入45ml的冻干液(pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含4.2wt％BSA、5.6wt％海藻糖和1.5wt％甘氨酸)；
d)将UCP标记物悬浊液按12.5ml/cm2加于玻璃纤维上；
e)将玻璃纤维在-80℃下，预冻0.5h；真空冻干2h；
f)裁剪玻璃纤维，装塑料卡
烘干法制备结合垫的步骤：
a)～d)：与冻干结合垫的制备相同，
e)：将玻璃纤维在37℃的鼓风干燥箱中2小时。
f)裁剪玻璃纤维，装塑料卡
B)两种生产方法的成品(C反应蛋白CRP上转发光法免疫层析试纸条)进行CV检测对比：
取高、低浓度血清各一份，用两种方法制备的试纸条测量，同一份血清用每种试纸条各测10次，计算10次测量结果的变异系数(CV)。结果如图4及表1和表2所示
表1高浓度血清测量结果(单位：ng/ml)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV | |
| 烘干法 | 376.40 | 278.54 | 434.52 | 408.14 | 516.91 | 528.11 | 526.22 | 347.85 | 398.84 | 347.17 | 20.49％ |
| 冻干法 | 378.74 | 402.11 | 421.26 | 425.24 | 426.20 | 417.39 | 411.79 | 394.23 | 426.83 | 400.96 | 3.92％ |
表2低浓度血清测量结果(单位：ng/ml)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV | |
| 烘干法 | 23.80 | 14.91 | 13.73 | 13.56 | 18.23 | 25.32 | 17.61 | 25.12 | 17.36 | 23.99 | 24.55％ |
| 冻干法 | 21.27 | 19.28 | 19.08 | 21.48 | 20.34 | 19.48 | 21.18 | 20.11 | 18.59 | 20.62 | 5.00％ |
结果可见，冻干法制备的免疫层析试纸条测量结果的变异系数(CV)明显小于烘干法制备的免疫层析试纸条。
实施例2：AFP-UPT免疫层析试纸条的原理及采用冻干法工艺制备AFP-UPT免疫层析试纸条的方法
该试纸条的原理：AFP-UPT快速检测试纸条采用双抗体夹心免疫层析方法定量检测样品中甲胎蛋白含量。分析膜上测试区(T)预包被抗甲胎蛋白单抗，质控区(C)预包被羊抗鼠IgG，结合垫上有UCP颗粒标记的另一株抗甲胎蛋白单抗。反应时样品中甲胎蛋白与两株抗体反应结合，在T区形成抗甲胎蛋白抗体-甲胎蛋白抗原-UCP标记的抗甲胎蛋白抗体复合物，UCP颗粒在红外光激发下发射可见光，发射光的强度与样品中甲胎蛋白的浓度成正比。无论样品中是否存在甲胎蛋白，在C区都会形成羊抗鼠-UCP标记的抗甲胎蛋白抗体复合物。
所述经冻干法制备的基于上转发光法技术的AFP-UPT免疫层析试纸条(简称AFP-UPT试纸条)所采用的标记单抗为北京热景生物技术公司出售，克隆号为2G5，包被用的AFP单抗也为该公司出售，克隆号3B11。
采用冻干法方法生产AFP-UPT免疫层析试纸条所用的辅助试剂——UCP-生物分子的稀释液同时作为结合垫的冻干液，其组分如下：该稀释液的组分为以下成分组成：pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含4.2wt％BSA、5.6wt％海藻糖和1.5wt％甘氨酸
(1)包被：将AFP单抗3B11稀释到2mg/ml，作为检测带T线包被液，将羊抗鼠IgG(北京热景生物技术公司出售，产品编号YL031)稀释到2mg/ml，作为质控带C线包被液。通过喷膜机，将检测带T线包被液和质控带C线包被液包被到硝酸纤维素膜上。晾干，即获得单克隆抗体包被膜条。
(2)样品垫的制备：将玻璃纤维(上海金标生物技术有限公司)裁成1.5cm长X2mm宽条带作为样品垫
(3)UCP标记单抗：本试剂盒中的UCP标记单克隆抗体(即UCP-生物分子)是用以下步骤获得，步骤如下：
a)称取10mg UCP颗粒置于锥形瓶中；
b)加入10ml pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液；
c)向UCP颗粒悬浊液中加入0.5mg AFP单抗2G5，搅拌过夜；
d)以12000rpm在4℃下离心30min，弃去上清液；
e)UCP沉淀物中加入10ml pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，吹打混匀；
f)以12000rpm在4℃下离心30min，弃去上清液；
g)向UCP沉淀物中加入10ml封闭液(pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含2wt％BSA)，吹打混匀；
h)将上述UCP悬浊液倒入锥形瓶中，搅拌1h；
i)以12000rpm在4℃下离心30min，弃去上清液；
j)UCP沉淀物中加入10ml保存液(pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含2wt％BSA和0.05wt％NaN3)，吹打混匀；
(4)冻干结合垫的制备：
a)将50ml UCP标记物悬浊液，12000rpm，4℃，离心30min，弃上清；
b)UCP沉淀物中加入5ml的保存液(pH＝7.20.15M磷酸缓冲液，含2wt％BSA，0.05wt％NaN3)，吹打混匀；
c)加入45ml的冻干液(pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含4.2wt％BSA、5.6wt％海藻糖和1.5wt％甘氨酸)；
d)将UCP标记物悬浊液按12.5ml/cm2加于玻璃纤维上；
e)将玻璃纤维放-80℃，预冻0.5h；
f)真空冻干2h；
(5)裁剪结合垫；将冻干的结合垫裁剪成1cm宽的长条。
(6)分析膜的制备：将NC膜(采购自Millipore公司)贴于PVC板上，然后分检测带T线、质控带C线采用喷膜机划线。
(7)组装试纸条；依次将硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫、样品垫贴到底板(即上述的带有分析膜的PVC板)上，切成4.0mm宽的纸条。
(8)装塑料卡；将4.0mm宽的试纸条装到塑料卡底壳中，盖上塑料卡上壳，压紧。
实施例3.采用冻干法方法生产的AFP-UPT试剂盒的组成：
1、实施例2中制备的AFP-UPT免疫层析试纸条
2、样本稀释液
3、样品管
4、使用说明书
所述AFP-UPT试剂盒中的样本稀释液组成如下：pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含有1％v/vTween 20。
实施例4：本发明的AFP-UPT试剂盒的质量检测
采用本发明提供的检测甲胎蛋白AFP的上转发光法检测试剂盒进行甲胎蛋白含量检测的步骤为：
a.在测试前先完整阅读使用说明书，
b.将待测样本从储存环境中取出，编号并且平衡至室温(20℃-30℃)。
c.将试纸条置于干净平整的平面上，取40μl血清或血浆样本加至UPT免疫层析试纸的加样孔，再加入100μl稀释液，同时开始计时。
d.放置15min后，利用UPT生物传感器对试纸条进行扫描分析。
e.UPT生物传感器显示测量结果，Y值为甲胎蛋白的浓度，系统默认单位为mg/L。
检测指标：
1)准确性：采用试剂盒校准品与相应浓度的国家校准品(来源于中国药品生物制品检定所)同时进行分析测定，用双对数(或其它适当的)数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行(t检验)，以国家标准品为对照，试剂盒校准品的测定浓度与理论浓度的比值即为试剂盒校准品的效价。测定结果应符合以下规定，即试剂盒校准品的效价应在0.900～1.100范围内。
2)精密度：随机抽取20人份试纸条，用同一份AFP阳性质控血清(来源于解放军第302医院)按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、标准偏差(SD)和变异系数CV。批内变异系数(CV)应不高于15％。
具体检测方法如下：
a.将试纸条、稀释液及待测样本平衡至室温(20～25℃)。
b.拆开试纸条的铝箔袋包装，将试纸条放置在平整的表面上。
c.在试纸条外壳上写上待测样本的编号。
d.取50μl样本，加入加样孔中。
e.取70μl稀释液，加入加样孔中。
f.室温放置15分钟。
g.在上转发光免疫分析仪中输入该批试纸条的参数，进行测量。
h.数据处理：与AFP定量测定试剂盒配套的上转发光免疫分析仪具有计算浓度功能。测量完成后仪器自动将T/C值(TEST线/CONTROL线的浓度比值)经过计算得到的浓度值显示在屏幕上。
3)检测灵敏度：根据AFP标准品稀释测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为＜5ng/ml。
测定20个0ng/ml点，计算平均值和标准差，以(平均值+2倍标准差)在标准曲线上对应的浓度为灵敏度。
表3灵敏度检测数据
表4灵敏度检测结果
4)特异性：与人血清白蛋白(HSA)、癌胚抗原(CEA)无显著交叉反应。
测定200mg/ml的人血清白蛋白(HSA)和200ng/ml的癌胚抗原(CEA)。在标准曲线上计算HSA和CEA测得的浓度分别为0.44ng/ml和0.59ng/ml(表5、6)。
表5与BSA和CEA的交叉反应检测结果
表6与其它物质的交叉反应数据
| 交叉原 | 浓度(ng/ml) | 相当于AFP(ng/ml) |
| HSA | 2×106 | ≤5.0 |
| CEA | 200 | ≤5.0 |
检测结果：
A)准确性检测的结果：
国家标准品购买自中国药品生物制品检定所，为5ng/ml；20ng/ml；100ng/ml；400ng/ml；1000ng/ml；结果如图5及表7所示
表7准确性检测的结果
| 标准品含量 | 检测值T/C | 检测值 |
| 0ng/ml | 0.045 | 0.005ng/ml |
| 5ng/ml | 0.365 | 5.2ng/ml |
| 20ng/ml | 0.547 | 21ng/ml |
| 100ng/ml | 1.102 | 99ng/ml |
| 400ng/ml | 2.265 | 405ng/ml |
| 1000ng/ml | 4.165 | 991ng/ml |
B)精密度检测结果：将浓度为20ng/ml、400ng/ml的标准品加入本发明的AFP-UPT免疫层析试纸条中，每个标准品采用试纸条检测10次，记录每次检测值然后计算精密度CV＝SD/平均值％。
表8精密度检测结果
| AFP | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 平均值 | SD | CV |
| 20ng/ml | 19.75 | 19.49 | 19.20 | 20.00 | 19.19 | 19.94 | 20.88 | 20.46 | 20.97 | 18.71 | 19.86ng/ml | 0.75 | 3.76％ |
| 400ng/ml | 384.57 | 427.72 | 405.10 | 409.48 | 387.61 | 422.80 | 404.87 | 392.60 | 411.88 | 401.91 | 404.85ng/ml | 14.08 | 3.48％ |
实施例5：本发明AFP-UPT试剂盒和AFP电化学发光免疫试剂盒的性能对比：
取本发明AFP-UPT试剂盒和罗氏公司的AFP电化学化学发光试剂盒进行了对比检测实验。
采用北京地坛医院病毒研究室提供的标本进行对比检测：120份已知原发性肝癌阳性标本，50份体检健康血清，100份肝炎，肝病标本均为AFP阳性标本。结果见表9及图6。
表9在不同标本中检出率比较
结果表明，这2种方法线性关系没有差异，即本发明的AFP-UPT试剂盒与罗氏公司的AFP电化学化学发光免疫试剂盒的性能非常接近，没有差异。
实施例6：CRP-UPT免疫层析试纸条的原理及采用冻干法方法制备CRP-UPT免疫层析试纸条的方法
CRP-UPT免疫层析试纸条采用双抗体夹心免疫层析方法定量检测样品中CRP含量。分析膜上测试区(T)预包被抗CRP单抗，质控区(C)预包被羊抗鼠IgG，结合垫上有UCP颗粒标记的另一株抗CRP单抗。反应时样品中CRP与两株抗体反应结合，在T区形成抗CRP抗体-CRP抗原-UCP标记的抗CRP抗体复合物，UCP颗粒在红外光激发下发射可见光，发射光的强度与样品中CRP的浓度成正比。无论样品中是否存在-CRP，在C区都会形成羊抗鼠-UCP标记的抗CRP抗体复合物。
所述冻干法制备的基于上转发光法的CRP-UPT免疫层析试纸条(简称CRP-UPT试纸条)所采用的标记单抗为北京热景生物技术公司出售，克隆号3C8，包被用的CRP单抗也为该公司出售，克隆号为3D7。该稀释液的组分为以下成分组成：pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含4.2wt％BSA、5.6wt％海藻糖和1.5wt％甘氨酸
(1)包被：将CRP单抗3D7稀释到2mg/ml，作为检测带T线包被液，将羊抗鼠IgG(北京热景生物技术公司出售，产品编号YL031)稀释到2mg/ml，作为质控带C线包被液。通过喷膜机，将检测带T线包被液和质控带C线包被液包被到硝酸纤维素膜上。晾干，即获得单克隆抗体包被膜条。
(2)样品垫的制备：将玻璃纤维(上海金标生物技术有限公司)裁成1.5cm长X2mm宽条带作为样品垫
(3)UCP标记单抗：本试剂盒中的UCP标记单克隆抗体(即UCP-生物分子)是用以下步骤获得，步骤如下：
a)称取10mg UCP颗粒置于锥形瓶中；
b)加入10ml pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液；
c)向UCP颗粒悬浊液中加入0.5mg CRP单抗3C8，搅拌过夜；
d)以12000rpm在4℃下离心30min，弃去上清液；
e)向UCP沉淀物中加入10ml pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，吹打混匀；
f)以12000rpm在4℃下离心30min，弃去上清液；
g)向UCP沉淀物中加入10ml封闭液(pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含2wt％BSA)，吹打混匀；
h)将UCP悬浊液倒入锥形瓶中，搅拌1h；
i)以12000rpm在4℃下离心30min，弃去上清液；
j)UCP沉淀物中加入10ml保存液(pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含2wt％BSA和0.05wt％NaN3)，吹打混匀；
(4)冻干结合垫的制备：
a)将50ml UCP标记物悬浊液，以12000rpm在4℃下离心30min，弃去上清液；
b)向UCP沉淀物中加入5ml的保存液(pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含2wt％BSA和0.05wt％NaN3)，吹打混匀；
c)加入45ml的稀释液；
d)将UCP标记物悬浊液按12.5ml/cm2加于玻璃纤维上；
e)将玻璃纤维放-80℃，预冻0.5h；
f)真空冻干2h；
(5)裁剪结合垫；将冻干的结合垫裁剪成1cm宽的长条。
(6)分析膜的制备：将NC膜(采购自密里博公司)贴于PVC板上，然后分检测带T线、质控带C线采用喷膜机划线。
(7)组装试纸条；依次将硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫、样品垫贴到底板上，切成4.0mm宽的纸条。
(8)装塑料卡；将4.0mm宽的试纸条装到塑料卡底壳中，盖上塑料卡上壳，压紧。
实施例7.采用冻干法方法生产的CRP-UPT试剂盒的组成：
1.实施例8中制备的AFP-UPT免疫层析试纸条
2.样本稀释液
3.样品管
4.使用说明书
所述CRP-UPT试剂盒中的样本稀释液组成如下：pH＝7.2的0.15M磷酸缓冲液，含有1％Tween 20。
实施例8.本发明的CRP-UPT试剂盒的质量检测
采用冻干法方法生产的CRP-UPT试剂盒的操作步骤是：
a.在测试前先完整阅读使用说明书，
b.将待测样本从储存环境中取出，编号并且平衡至室温(20℃-30℃)。
c.取出样品管，每管加入990μl样本稀释液。如果为血清/血浆标本，每管加入10μl样本；如果为全血标本，每管加入15μl样本。扣上样品管盖摇匀。
d.将试纸条置于干净平整的平面上，取100μl稀释好的待检样品加至UPT免疫层析试纸的加样孔，同时开始计时。
e.放置15min后，利用UPT生物传感器对试纸条进行扫描分析。
f.UPT生物传感器显示测量结果，Y值为甲胎蛋白的浓度，系统默认单位为mg/L。
1)准确性：采用试剂盒校准品与相应浓度的国际标准品(来源于英国国家生物学标准和质控物研究所，NIBSC)同时进行分析测定，用双对数(或其它适当的)数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行(t检验)，以国际标准品为对照，试剂盒校准品的测定浓度与理论浓度的比值即为试剂盒校准品的效价。测定结果应符合以下规定，即试剂盒校准品的效价应在0.900～1.100范围内。
检测结果：
国际标准品购买自NIBSC，为0.5mg/L；2mg/L；5mg/L；20mg/L；150mg/L；结果如图7及表10所示
表10准确性检测的结果
2)精密度：随机抽取20人份试纸条，用同一份CRP质控血清(来源于解放军第302医院)按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、标准偏差(SD)和变异系数CV。批内变异系数(CV)应不高于15％。
具体检测方法如下：
a.将试纸条、稀释液及待测样本平衡至室温(20～25℃)。
b.拆开试纸条的铝箔袋包装，将试纸条放置在平整的表面上。
c.在试纸条外壳上写上待测样本的编号。
d.取出样品管，每管加入990μl样本稀释液。如果为血清/血浆标本，每管加入10μl样本；如果为全血标本，每管加入15μl样本。扣上样品管盖摇匀。
e.将试纸条置于干净平整的平面上，取100μl稀释好的待检样品加至UPT免疫层析试纸的加样孔，同时开始计时。
f.室温放置15分钟。
g.在上转发光免疫分析仪中输入该批试纸条的参数，进行测量。
h.数据处理：与CRP定量测定试剂盒配套的上转发光免疫分析仪具有计算浓度功能。测量完成后仪器自动将T/C值(TEST线/CONTROL线的浓度比值)经过计算得到的浓度值显示在屏幕上。
精密度检测结果：将浓度为2mg/L、50mg/L的标准品加入本发明的CRP-UPT免疫层析试纸条中，每个标准品采用试纸条检测10次，记录每次检测值然后计算精密度CV(CV＝SD/平均值％)。
表11精密度检测结果
| CRP | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 平均值 | SD | CV |
| 2mg/L | 2.00 | 2.16 | 2.15 | 1.91 | 2.05 | 1.89 | 1.99 | 1.92 | 1.95 | 2.12 | 2.01mg/L | 0.10 | 5.03％ |
| 50mg/L | 53.03 | 49.63 | 49.51 | 48.03 | 50.69 | 48.94 | 50.82 | 52.07 | 47.28 | 50.54 | 50.05mg/L | 1.75 | 3.50％ |
3)检测灵敏度：根据CRP标准品稀释测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为小于0.5mg/L。
测定20个0mg/L点，计算平均值和标准差，以(平均值+2倍标准差)在标准曲线上对应的浓度为灵敏度。
表12灵敏度检测数据
表13灵敏度检测结果
4)特异性：与人血清白蛋白(HSA)、胆红素无显著交叉反应。
测定200mg/ml的人血清白蛋白(HSA)和50mg/L的胆红素。在标准曲线上计算HSA和胆红素测得的浓度分别为0.11mg/L和0.09mg/L(表14、15)。
表14与BSA和胆红素的交叉反应检测结果
表15与其它物质的交叉反应数据
| 交叉原 | 浓度 | 相当于CRP(mg/L) |
| HSA | 200mg/ml | ≤0.5 |
| 胆红素 | 50mg/L | ≤0.5 |
实施例9.本发明的CRP-UPT试剂盒对临床标本的检测分析：
分别用本发明的CRP-UPT试剂盒和免疫比浊法贝克曼CRP试剂盒检测90份血样，血样来源于北京同仁医院。结果表明该CRP-UPT试剂盒检测结果与贝克曼CRP试剂盒检测结果符合性好，符合率≥80％。结果如图8和表16所示。
表16CRP-UPT试剂盒与免疫比浊法贝克曼CRP试剂盒的检测结果
| 样本编号 | UPT测值 | 参比值(mg/L) | 样本编号 | UPT测值 | 参比值 | 样本编号 | UPT测值 | 参比值 | 样本编号 | UPT测值 | 参比值 |
| (mg/L) | (mg/L) | (mg/L) | (mg/L) | (mg/L) | (mg/L) | (mg/L) | |||||
| 1 | 30.18 | 30.73 | 28 | 7.90 | 8.67 | 55 | 3.95 | 4.07 | 82 | 0.75 | 1.03 |
| 2 | 13.91 | 16.12 | 29 | 3.46 | 3.76 | 56 | 0.83 | 1.0 | 83 | 4.33 | 7.23 |
| 3 | 9.05 | 9.15 | 30 | 76.14 | 76.4 | 57 | 74.27 | 79.3 | 84 | 1.25 | 2.22 |
| 4 | 40.68 | 38.38 | 31 | 0.96 | 1.0 | 58 | 2.79 | 2.98 | 85 | 4.95 | 7.75 |
| 5 | 24.21 | 21.07 | 32 | 28.42 | 27 | 59 | 1.28 | 1.42 | 86 | 1.61 | 1.53 |
| 6 | 5.89 | 10.64 | 33 | 8.70 | 8.27 | 60 | 20.31 | 19 | 87 | 2.15 | 2.96 |
| 7 | 28.7 | 27.04 | 34 | 4.46 | 4.17 | 61 | 2.71 | 2.54 | 88 | 13.6 | 12.8 |
| 8 | 67.49 | 59.3 | 35 | 1.42 | 1.56 | 62 | 85.12 | 96.2 | 89 | 4.11 | 3.08 |
| 9 | 22.3 | 24.31 | 36 | 63.64 | 61.6 | 63 | 0.41 | 1.72 | 90 | 10.21 | 9.64 |
| 10 | 14.2 | 13.68 | 37 | 129.47 | 143 | 64 | 0.5 | 1.0 | 91 | 0.95 | 3.08 |
| 11 | 80.13 | 99.2 | 38 | 3.60 | 3.62 | 65 | 0.71 | 1.0 | 92 | 41.2 | 55.9 |
| 12 | 97.26 | 105 | 39 | 1.36 | 1.5 | 66 | 1.01 | 2.47 | 93 | 117.1 | 158 |
| 13 | 12.27 | 15.5 | 40 | 1.06 | 1.0 | 67 | 23.18 | 19.6 | 94 | 25.57 | 14.9 |
| 14 | 21.37 | 26.8 | 41 | 82.28 | 79.8 | 68 | 50.22 | 53.5 | 95 | 55.93 | 47.3 |
| 15 | 32.43 | 38.3 | 42 | 90.27 | 92.8 | 69 | 93.21 | 117 | 96 | 25.7 | 26.7 |
| 16 | 13.58 | 9.0 | 43 | 90.40 | 99.9 | 70 | 2.34 | 2.65 | 97 | 63.93 | 55.5 |
| 17 | 21.89 | 37.8 | 44 | 16.03 | 14.8 | 71 | 0.66 | 1.42 | 98 | 36.10 | 41.1 |
| 18 | 10.57 | 11.9 | 45 | 6.41 | 6.13 | 72 | 5.83 | 6.96 | 99 | 30.84 | 24.3 |
| 19 | 34.34 | 29.5 | 46 | 41.49 | 45.7 | 73 | 1.01 | 1.58 | 100 | 9.83 | 8.13 |
| 20 | 46.28 | 38.6 | 47 | 105.47 | 98.8 | 74 | 1.74 | 2.78 | 101 | 40.72 | 30.5 |
| 21 | 38.86 | 34.7 | 48 | 12.51 | 13.5 | 75 | 1.21 | 1.75 | 102 | 81.03 | 125 |
| 22 | 19.31 | 17 | 49 | 0.86 | 1.0 | 76 | 36.2 | 38 | 103 | 16.32 | 12.3 |
| 23 | 64.43 | 71.6 | 50 | 2.12 | 2.25 | 77 | 2.81 | 5.13 | 104 | 0.44 | 3.08 |
| 24 | 29.73 | 25.4 | 51 | 2.08 | 2.15 | 78 | 5.70 | 6.91 | 105 | 18.4 | 20.8 |
| 25 | 10.33 | 9.4 | 52 | 36.05 | 33.3 | 79 | 0.81 | 1.0 | 106 | 2.77 | 3.72 |
| 26 | 14.79 | 9.4 | 53 | 0.88 | 1.0 | 80 | 1.83 | 1.66 | 107 | 7.13 | 5.09 |
| 27 | 69.87 | 46.6 | 54 | 2.80 | 2.6 | 81 | 1.53 | 1.36 | 108 | 15.52 | 13.1 |
Claims (9)
1.一种基于上转换发光技术的免疫层析试纸条，其特征在于含有上转换发光材料(UCP)-生物分子颗粒的结合垫或结合物稀释垫是经冻干的。
2.权利要求1所述的免疫层析试纸条，其中所述结合垫或结合物稀释垫是使用UCP保存液和冻干液处理后的上转换发光材料(UCP)-生物分子颗粒冻干而成。
3.权利要求1所述的免疫层析试纸条，其中所述试纸条包括一外壳，所述外壳上包括加样孔、结果判读窗口和终点指示窗口。
4.权利要求3所述的免疫层析试纸条，其中通过所述加样孔，将生物样品添加到样品垫上；结果判读窗口对应于分析膜上的检测带和质控带；终点指示窗口对应于吸水垫上的终点指示带。
5.权利要求1-4任一项所述的免疫层析试纸条，其中所述生物分子选自AFP抗体、CRP抗体、肌钙蛋白I CTN-I抗体、脑钠肽BNP抗体、N端前体脑钠肽N-pro-BNP抗体、盐酸克伦特罗抗体、盐酸莱克多巴胺抗体、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗体、乙肝表面抗原抗体和髓过氧化物酶MPO抗体。
6.一种制备权利要求1-4任一项所述的免疫层析试纸条的方法，其中在制备结合垫或结合物稀释垫的过程中，所述结合垫或结合物稀释垫是经冻干的。
7.权利要求6所述的方法，其中所述制备结合垫或结合物稀释垫的过程包括：
a)将UCP-生物分子悬浊液离心并弃上清；
b)向a)步骤得到的UCP-生物分子沉淀物中加入UCP保存液，吹打混匀；
c)向b)步骤得到的UCP-生物分子悬浊液中加入冻干液；
d)将c)步骤得到的UCP-生物分子悬浊液中加于玻璃纤维上；
e)将玻璃纤维放于-80℃下，预冻时间0.5小时，真空冻干2小时；
其中所述UCP保存液为pH7.2的0.15M的磷酸缓冲液，含有2wt％BSA和0.05wt％NaN3，所述冻干液为pH7.2的0.15M的磷酸缓冲液，含有4.2wt％BSA、5.6wt％海藻糖和1.5wt％甘氨酸。
8.一种基于上转换发光技术的免疫层析快速试剂盒，其特征在于包括权利要求1-4任一项所述的免疫层析试纸条。
9.权利要求8所述的试剂盒，其中所述免疫层析试纸条中的生物分子选自AFP抗体、CRP抗体、肌钙蛋白I CTN-I抗体、脑钠肽BNP抗体、N端前体脑钠肽N-pro-BNP抗体、盐酸克伦特罗抗体、盐酸莱克多巴胺抗体、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗体、乙肝表面抗原抗体和髓过氧化物酶MPO抗体。
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Address after: 102600 Daxing District, Zhongguancun science and Technology Park Daxing biomedical industry base, Fu Street, No. 9, building 9, No. Patentee after: Beijing hot King biotechnology Limited by Share Ltd Patentee after: Yang Ruibi Patentee after: Zhou Lei Address before: 100026 Beijing Keyuan Daxing District economic and Technological Development Zone No. 27 Hospital Road Patentee before: Beijing Hotgen Biotechnology Co., Ltd. Patentee before: Yang Ruibi Patentee before: Zhou Lei |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20191031 Address after: 102600 Daxing District, Zhongguancun science and Technology Park Daxing biomedical industry base, Fu Street, No. 9, building 9, No. Co-patentee after: Yang Ruibi Patentee after: Beijing hot King biotechnology Limited by Share Ltd Address before: 102600 Daxing District, Zhongguancun science and Technology Park Daxing biomedical industry base, Fu Street, No. 9, building 9, No. Co-patentee before: Yang Ruibi Patentee before: Beijing hot King biotechnology Limited by Share Ltd Co-patentee before: Zhou Lei |
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| TR01 | Transfer of patent right |