CN101750502A - 一种同步检测AFP和AFP-IgM的TRFIA及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同步检测AFP和AFP-IgM的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)及其试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：1)第一抗原表位的AFP单克隆抗体，2)一种镧系元素标记的第二抗原表位的AFP单克隆抗体，3)另一种镧系元素标记的IgM单克隆抗体，4)AFP/AFP-IgM混合标准品，5)缓冲液，6)洗涤液，7)增强液，其中，所述的镧系元素选自铕和钐，所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体与所述的第一抗原表位的AFP单克隆抗体具有不同的抗原表位。本发明采用高灵敏的TRFIA，建立同时检测AFP和AFP-IgM方法，灵敏度高，特异性强，稳定性好，操作简单，可实现高度自动化，提高临床检验的速度，大幅度降低人为误差，增加检出结果的可靠性，极大提高诊断效率。

Description

一种同步检测AFP和AFP-IgM的TRFIA及其试剂盒

技术领域

本发明属于生化检测领域，特别涉及一种同步检测甲胎蛋白和甲胎蛋白-免疫球蛋白复合物的时间分辨荧光免疫分析方法及其试剂盒。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是全世界最常见的致死性癌症之一，其发病率排在第四位。迄今还没有一理想的高灵敏、高特异的血清标志物可以用于HCC的诊断，尤其是早期诊断。目前临床常用的甲胎蛋白(AFP)，如将cutoff值定为20ng/ml，其诊断肝癌的灵敏度也仅有60-80％，对小肝癌仅为40％。在一些肝的良性病变中也会出现AFP增高现象，比如约有15-18％的慢性肝炎和11-47％的肝硬化患者其血清AFP在20-200ng/ml水平，所以造成AFP诊断肝癌的特异性不高。如果提高cutoff值虽然可以提高特异性，但其诊断灵敏度就会大幅下降。研究表明AFP在人体内以与免疫球蛋白(AFP-IgM)和游离(FAFP)等形式存在，AFP-IgM可在肝脏疾病的早期存在，而且与肝损害相关。目前AFP-IgM已作为一种补充血清标志物用于HCC的诊断。AFP-IgM的补充检测，极大的提高了HCC的检测灵敏度和特异性。但是现有的方法中，对AFP和AFP-IgM的检测是作为两个标记物分别进行的，检测过程较为复杂和繁琐，影响诊断效率。

时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术。实际上是在荧光免疫分析的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析利用了荧光波长与其激发光波长的巨大差异，但当进行超微量分析时，激发光的杂散光会严重影响对荧光的检测。解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1/2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。TRFIA所用的荧光标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长及Stokes位移大的特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰，具有灵敏度高，标记物制备简单，稳定性好，标准曲线线性范围宽，操作方便，成为最有发展前途的超微量分析技术和当前标记免疫分析发展到新阶段的代表。在实际应用中，通常还在荧光标志物中加入一种增强液(Enhancement solution)，可增强荧光效果上百万倍。

目前，已有采用TRFIA检测AFP的技术，但还没有采用TRFIA检测AFP-IgM的技术，更缺乏同步检测AFP和AFP-IgM的技术。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的方法中，对HCC的肿瘤标记物AFP和辅助标记物AFP-IgM分别进行检测，检测过程较为复杂和繁琐，影响诊断效率的缺陷，提供一种同步检测AFP和AFP-IgM的方法及其试剂盒，该检测方法及其试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，操作简单、迅捷，能极大提高肝癌的诊断效率。

本发明人经过大量的试验和研究，惊喜的发现，利用TRFIA可以容易实现免疫双标记分析，同时测定AFP和AFP-IgM，从而完成了本发明。

因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是，一种同步检测甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白-免疫球蛋白(AFP-IgM)复合物的时间分辨荧光免疫分析方法的试剂盒，包括以下试剂：

1)第一抗原表位的AFP单克隆抗体，

2)一种镧系元素标记的第二抗原表位的AFP单克隆抗体，

3)另一种镧系元素标记的IgM单克隆抗体，

4)AFP/AFP-IgM混合标准品，

5)缓冲液，

6)洗涤液，

7)增强液，

其中，所述的镧系元素选自铕和钐，所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体与所述的第一抗原表位的AFP单克隆抗体具有不同的抗原表位。

根据本发明，试剂1)为第一抗原表位的AFP单克隆抗体。其较佳的为鼠抗人AFP单克隆抗体；更佳的为固相抗体，固相载体较佳的为反应板，优选96孔板或48孔板。所述的固相抗体可以采用本领域常规的抗体包被固相载体的方法制备。较佳的包括如下步骤：采用反应板作为固相载体，用AFP单克隆抗体包被反应板，再用封闭液封闭，然后真空抽干，即得固相抗体。包被时，AFP单克隆抗体较佳的用缓冲液稀释至1～10mg/L作为包被液，所述的缓冲液较佳的为pH9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液。封闭液较佳的为含0.2(w/v)％明胶和2(w/v)％蔗糖的50mmol/L pH7.2的Tris-HCl缓冲液。真空抽干后，所得的固相抗体(如反应板)较佳的可以在密封后置-20℃冷冻保存。

根据本发明，试剂2)为一种镧系元素标记的第二抗原表位的AFP单克隆抗体。其较佳的为鼠抗人AFP单克隆抗体。其可以采用本领域常规的蛋白标记方法制备，较佳的包括如下步骤：用R³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(R³⁺-DTTA)与AFP单克隆抗体反应，其中R代表铕或钐，反应液经过柱层析分离纯化，即得。其中，所述的AFP单克隆抗体与R³⁺-DTTA的质量比较佳的为1∶0.2～0.5。

根据本发明，试剂3)为另一种镧系元素标记的IgM单克隆抗体。其较佳的为鼠抗人IgM单克隆抗体。其可以采用本领域常规的标记方法制备，较佳的包括如下步骤：用R³⁺-DTTA与IgM单克隆抗体反应，其中R代表钐或铕，反应液经过柱层析分离纯化，即得。其中，所述的IgM单克隆抗体与R³⁺-DTTA的质量比较佳的为1∶0.2～0.5。

其中，试剂2)所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体具有一种镧系元素标记，试剂3)所述的IgM单克隆抗体具有另一种镧系元素标记，所述的镧系元素选自铕和钐。这两种单克隆抗体具有的标记都选自铕和钐中的任何一种，但是在同一试剂盒中，标记第二抗原表位的AFP单克隆抗体的元素必须和标记IgM单克隆抗体的元素是不相同的。

根据本发明，试剂4)为AFP/AFP-IgM混合标准品。其较佳的可以共6瓶，其中，AFP浓度分别为：0ng/ml，1.21ng/ml，12.1ng/ml，121ng/ml，605ng/ml，1210ng/ml；AFP-IgM浓度分别为：0AU/mL，0.5AU/mL，5AU/mL，50AU/mL，250AU/mL，500AU/M1，其中，AU设定为任意单位。

根据本发明，试剂5)为缓冲液。其较佳的可以为：含8mmol/L NaCl、0.1wt％明胶、0.2wt％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1wt％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

根据本发明，试剂6)为洗涤液。其较佳的可以为：含14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2wt％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

根据本发明，试剂7)为增强液。其较佳的可以为：含15μmol/L β-萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化膦和体积百分比0.1％曲拉通X-100的pH3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是，一种根据上述的试剂盒同步检测甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白-免疫球蛋白(AFP-IgM)复合物的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)，依次包括以下步骤：

1)在固相的第一抗原表位的AFP单克隆抗体中，加入AFP/AFP-IgM混合标准品或待测样品以及缓冲液，进行孵育；

2)用洗涤液洗涤步骤1)的孵育后的反应液，然后加入一种镧系元素标记的第二抗原表位的AFP单克隆抗体和另一种镧系元素标记的IgM单克隆抗体，进行孵育，其中，所述的镧系元素选自铕(Eu)和钐(Sm)，所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体与步骤1)所述的第一抗原表位的AFP单克隆抗体具有不同的抗原表位；

3)用洗涤液洗涤步骤2)的孵育后的反应液，然后加入增强液进行反应，之后进行时间分辨荧光检测。本发明的同时检测AFP和AFP-IgM的时间分辨荧光免疫分析方法的原理示意图见图1。

根据本发明，步骤1)为：在固相的第一抗原表位的AFP单克隆抗体中，加入AFP/AFP-IgM混合标准品或待测样品以及缓冲液，进行孵育。其中，所述的固相的第一抗原表位的AFP单克隆抗体的固相载体较佳的为反应板，即该第一抗原表位的AFP单克隆抗体包被在反应板上。所述的缓冲液为常规的免疫反应的缓冲液，较佳的可以为：含8mmol/L NaCl、0.1wt％明胶、0.2wt％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1wt％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。孵育的方法同常规，较佳的为37℃，1～2小时。孵育后AFP/AFP-IgM混合标准品或待测样品中的AFP与反应板上的固相AFP单克隆抗体形成免疫复合物。

根据本发明，步骤2)为：用洗涤液洗涤步骤1)的孵育后的反应液，然后加入一种镧系元素标记的第二抗原表位的AFP单克隆抗体和另一种镧系元素标记的IgM单克隆抗体，进行孵育，其中，所述的镧系元素选自铕和钐，所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体与步骤1)所述的第一抗原表位的AFP单克隆抗体具有不同的抗原表位。

其中，所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体具有一种镧系元素标记，所述的IgM单克隆抗体具有另一种镧系元素标记，所述的镧系元素选自铕和钐。这两种单克隆抗体具有的标记都选自铕和钐中的任何一种，但是同一个检测中，标记AFP单克隆抗体的元素必须和标记IgM单克隆抗体的元素是不相同的。因为镧系元素(包括铕和钐)在受激发后发射波长和荧光寿命相对较大，时间分辨荧光免疫分析法可利用这些镧系元素波长和荧光寿命的不同，将标记物区别开来。从发射波长看，Eu³⁺(615nm)与Tb³⁺(544nm)作双标记配对，区分较明显，但是要同时测定它们，就需用氟化脂肪β-二酮螯合剂，而其对Eu³⁺的测定效果却较差，因而，Eu³⁺与Tb³⁺作双标记配对时，测定结果不好。Eu³⁺与Sm³⁺的最大发射波长虽然只相差约30nm，但因多是窄发射峰，已能被充分分辨，在340nm激发光作用下，两者都能与β-NTA(β-二酮)形成高度发荧光的螯合物，且它们的荧光寿命相差显著(Sm³⁺为50s，Eu³⁺为730s)，可通过时间延迟充分分辨。因此，较佳的Eu³⁺和Sm³⁺最适合于作为配对的双标记用于时间分辨荧光免疫分析法。

用洗涤液是为了洗涤步骤1)的孵育后的反应液。步骤1)所述的第一抗原表位的AFP单克隆抗体固载于反应板上，其与加入的AFP/AFP-IgM混合标准品或待测样品中的AFP(即抗原)因抗原-抗体的作用而结合，而游离的未与固相抗体反应的其他成份，用洗涤液洗涤去除。所述的洗涤液较佳的为：含14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2wt％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

作为抗原，AFP和AFP-IgM复合物中的AFP都与固相载体上的AFP抗体作用结合，但是这些AFP在其他的抗原表位还可以结合其他AFP抗体，即步骤2)所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体。而AFP-IgM复合物中的IgM也可以由抗原-抗体反应和IgM单克隆抗体作用。经过孵育后，分别形成了夹心复合物。孵育的方法同常规，较佳的为37℃，1～2小时。

根据本发明，步骤3)为：用洗涤液洗涤步骤2)的孵育后的反应液，然后加入增强液进行反应，之后进行时间分辨荧光检测。其中，所述的洗涤液同上，用洗涤液洗涤去除游离的AFP单克隆抗体和IgM单克隆抗体。所述的增强液较佳的为含β-二酮的溶液，较佳的为：含15μmol/L β-萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化膦和体积百分比0.1％曲拉通X-100的pH3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。增强液中的β-二酮可以倍增荧光信号。加入增强液进行镧系元素离子如Eu³⁺或Sm³⁺加入增强液如β-NTA振荡反应后，形成高度发荧光的螯合物。反应的温度和时间，较佳的为37℃，5分钟。在340nm激发光作用下，所形成的螯合物发射很强的荧光，Sm³⁺的荧光寿命为50s，Eu³⁺的荧光寿命为730s，用时间分辨荧光仪器测定其荧光强度。荧光强度与分别与样品中的AFP和AFP-IgM浓度成正比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明采用高灵敏的时间分辨荧光免疫分析技术，建立同时检测AFP和AFP-IgM方法。该方法灵敏度高，特异性强，稳定性好，特别适用于肝癌患者血清或其他体液(如心包积液、腹水、尿液等)中AFP和AFP-IgM含量的检测，可作为临床肝癌诊断的辅助指标。本发明试剂成本低，操作简单，分析系统可实现高度自动化，可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人为误差，增加检出结果的可靠性。同时检测AFP和AFP-IgM也可极大提高肝癌的诊断效率。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1时间分辨荧光免疫分析同时检测AFP和AFP-IgM的原理。

图2为本发明AFP/AFP-IgM的TRFIA标准曲线及精密度图。A图：AFP-IgM，B图：AFP。

图3AFP-IgM和AFP在肝癌、慢性肝炎、肝硬化及正常人血清中的分布。

图4AFP-IgM和AFP在正常人、肝良性疾病和肝癌中的ROC曲线。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所述的“室温”，为试验操作的实验室温度，为18～25℃。

其中，下列实施例中的鼠抗人AFP单克隆抗体(克隆号分别为M19301和M94115，分别针对不同的抗原表位)购自Biodesign公司；鼠抗人IgM单克隆抗体(克隆号为M94181)也购自Biodesign公司；96孔微孔板(8×12)为labsystem公司产品；Eu³⁺和Sm³⁺标记盒为PerkerElmer公司产品；SephadexG-50为Amersham产品；其他试剂均为国产分析纯；全自动TRFIA检测仪(Auto DELFIA 1235)为Wallac产品。

实施例1  试剂盒的制备

每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：

(1)1×96孔板(8条×12孔，可以拆分为单孔)包被有抗鼠抗人AFP单克隆抗体。

(2)6×AFP/AFP-IgM混合标准品，冻干品。使用前每瓶各用1ml蒸馏水溶解。

(3)1×铕标记抗体冻干品，使用时用0.5ml蒸馏水溶解。

(4)1×钐标记抗体冻干品，使用时用0.5ml蒸馏水溶解。

(5)1×缓冲液，30ml。

(6)1×洗涤液，30ml，使用时以蒸馏水按体积比1∶25稀释。

(7)1×增强液，15ml。

下面是试剂盒中的各材料所含的具体成分及其制备方法。

1、微孔反应板制备

用50mmol/L pH9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将鼠抗人AFP单克隆抗体稀释至1μg/mL作为包被液，96孔微孔板每孔各加入100μl，4℃放置过夜，弃去包被液，用洗涤液(14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2wt％NaN₃的50mmol/L Tris-HCl pH7.2)冲洗四次，加200μl含0.2wt％明胶和2wt％蔗糖的50mmol/L pH7.2的Tris-HCl缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

2、AFP/AFP-IgM混合标准品制备

取10份肝癌患者(来自上海市肿瘤医院)的血清，将其混合后离心(4000rpm 20分钟，离心后取上清)。用Hepa AFP-IC Kit(生产厂商：XeptaGen，意大利)和罗氏公司AFP电化学发光免疫试剂盒分别对其中的AFP，AFP-IgM浓度进行定值。其中，AFP-IgM含量用任意单位(AU)表示。用含0.2wt％BSA，0.1wt％NaN3的50mmol/L pH7.8Tris-Hcl缓冲液将上述定值血清配成AFP-IgM浓度分别为：0、10、100、1000、5000、10000AU/ml和AFP浓度分别为：0、1.21、12.1、121、605、1210ng/mL系列标准液，每瓶1ml分装冻干，-20℃干燥保存。

该各瓶冻干保存的标准品，使用时可各用1ml蒸馏水溶解，AFP浓度分别为：0ng/ml，1.21ng/ml，12.1ng/ml，121ng/ml，605ng/ml，1210ng/ml；AFP-IgM浓度分别为：0AU/mL，10AU/mL，100AU/mL，1000AU/mL，5000AU/mL，10000AU/mL。

3、Eu³⁺标记的鼠抗人AFP单克隆抗体制备

参照Eu³⁺标记试剂盒(生产厂商PerkerElmer公司)说明书操作。具体为：取鼠抗人AFP单克隆抗体1mg溶于0.25mol/L NaHCO₃液200μl中，加入0.2mg Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)充分混匀，4℃反应24小时。反应液用Sephadex G-50柱(1×20cm)层析，A280监测收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量。同时用PerkinElmer公司Eu³⁺标准液测定合并峰的Eu³⁺浓度。所得的标记率(Eu³⁺mol/IgG mol)是8.11，蛋白回收率为79％。将收集的溶液稀释成Eu³⁺标记的抗人AFP单克隆抗体浓度为0.79mmol/L，每瓶0.5ml分装，-20℃干燥保存。

4、Sm³⁺标记鼠抗人IgM单克隆抗体制备

参照Sm³⁺标记试剂盒(生产厂商PerkerElmer公司)说明书操作。具体为：取鼠抗人IgM单克隆抗体1mg溶于0.25mol/L NaHCO₃液200μl中，加入0.2mg Sm³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm³⁺-DTTA)充分混匀，4℃反应24小时。反应液用Sephadex G-50柱(1×20cm)层析，A280监测收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量。同时用PerkinElmer公司Sm³⁺标准液测定合并峰的Sm³⁺浓度。将收集的溶液稀释成Sm³⁺标记鼠抗人IgM单克隆抗体浓度为0.79mmol/L，每瓶0.5ml分装，-20℃干燥保存，即为试剂盒中的Sm³⁺标记IgM单克隆抗体冻干品。

5、缓冲液：8mmol/L NaCl、0.1wt％明胶、0.2wt％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1wt％NaN3的50mmol/L Tris-HClpH7.2。

6、洗涤液：14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2wt％NaN₃的50mmol/L Tris-HCl pH7.2。

7、增强液：1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1ml曲拉通X-100。

使用该试剂盒测定之前注意事项如下：

(1)使用之前将所有试剂取出回升至室温(18～30℃)

(2)使用之后立即将所有试剂放回2～8℃保存。

(3)如果样品量大建议用多通道移移器，以减少各样本反应时间上的差异。

(4)在所有恒温孵育过程中，避免光线照射。

(5)取出需用数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。

实施例2试剂盒的制备

试剂盒中的材料：除不含包被有抗鼠抗人AFP单克隆抗体96孔板(1)以外，其它的同实施例1。

试剂盒中的各材料的制备方法如下：

(1)Eu³⁺标记制备鼠抗人AFP单克隆抗体的制备

参照Eu³⁺标记试剂盒(生产厂商PerkerElmer公司)说明书操作。具体为：取鼠抗人AFP单克隆抗体1mg溶于0.25mol/L NaHCO₃液200μl中，加入0.5mg Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)充分混匀，4℃反应24小时。反应液用Sephadex G-50柱(1×20cm)层析，A280监测收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量。同时用PerkinElmer公司Eu³⁺标准液测定合并峰的Eu³⁺浓度。所得的标记率(Eu³⁺mol/IgG mol)是8.21，蛋白回收率为80.4％。将收集的溶液稀释成Eu³⁺标记的抗人AFP单克隆抗体浓度为0.8mmol/L，每瓶0.5ml分装，-20℃干燥保存。

(2)钐标记的鼠抗人IgM单克隆抗体制备

参照Sm³⁺标记试剂盒(生产厂商PerkerElmer公司)说明书操作。具体为：取鼠抗人IgM单克隆抗体1mg溶于0.25mol/L NaHCO₃液200μl中，加入0.5mg Sm³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm³⁺-DTTA)充分混匀，4℃反应24小时。反应液用Sephadex G-50柱(1×20cm)层析，A280监测收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量。同时用PerkinElmer公司Eu³⁺标准液测定合并峰的Sm³⁺浓度。所得的标记率(Sm³⁺mol/IgG mol)是8.30，蛋白回收率为78.2％。将收集的溶液稀释成Sm³⁺标记鼠抗人IgM单克隆抗体浓度为0.78mmol/L，每瓶0.5ml分装，-20℃干燥保存，即为试剂盒中的Sm³⁺标记IgM单克隆抗体冻干品。

(3)试剂盒中的其他材料(AFP/AFP-IgM混合标准品，缓冲液，洗涤液，增强液)的制备方法均同实施例1。

实施例3试剂盒的制备

每一个盒中的试剂足够进行48个测量，盒中的材料如下：

(1)1×48孔板(4条×12孔，可以拆分为单孔)包被有鼠抗人AFP单克隆抗体。

(2)6×AFP/AFP-IgM混合标准品，冻干品。使用前每瓶各用1ml蒸馏水溶解。

(3)1×铕标记抗体冻干品，使用时用0.5ml蒸馏水溶解。

(4)1×钐标记抗体冻干品，使用时用0.5ml蒸馏水溶解。

(5)1×缓冲液，30ml。

(6)1×洗涤液，30ml，使用时以蒸馏水按体积比1∶25稀释。

(7)1×增强液，15ml。

试剂盒中的各材料的制备方法如下：

1、微孔反应板制备

用50mmol/L pH 9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将抗鼠抗人AFP单克隆抗体稀释至10μg/mL作为包被液，48孔微孔板各加入100μl，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗四次，加200μl含0.2wt％明胶和2wt％蔗糖的50mmol/LpH7.2的Tris-HCl缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

2、试剂盒中的其他材料(AFP/AFP-IgM混合标准品，Eu³⁺标记的鼠抗人AFP单克隆抗体，Sm³⁺标记鼠抗人IgM单克隆抗体，缓冲液，洗涤液，增强液)的制备方法均同实施例1。

实施例4采用TRFIA同步检测AFP和AFP-IgM

采用实施例1提供的试剂盒。

一、实施例1的试剂盒中各材料的稀释

AFP/AFP-IgM混合标准品，为冻干品，共6瓶，分别用1ml蒸馏水溶解成：AFP浓度分别为：0ng/ml，1.21ng/ml，12.1ng/ml，121ng/ml，605ng/ml，1210ng/ml；AFP-IgM浓度分别为：0AU/mL，10AU/mL，100AU/mL，1000AU/mL，5000AU/mL，10000AU/mL。

铕标记抗体冻干品，用0.5ml蒸馏水溶解。

钐标记抗体冻干品，用0.5ml蒸馏水溶解。

洗涤液，用蒸馏水按1∶25稀释。

二、检测

取上述制备的包被有抗鼠抗人AFP单克隆抗体的微孔反应板，加50μlAFP/AFP-IgM混合标准品或待测样品至各自的微孔中，加100μl缓冲液，室温振荡反应1小时。洗涤后加200μl以缓冲液作稀释剂，体积比1∶100稀释铕标记的鼠抗人AFP单克隆抗体和钐标记的鼠抗人IgM单克隆抗体，室温振荡反应1小时。用洗涤液洗涤6次，加增强液200μl振荡5分钟后用全自动TRFIA检测仪测量荧光强度，从标准曲线分别计算样品中的AFP和AFP-IgM的含量。

三、AFP/AFP-IgM的TRFIA性能指标考核

1.灵敏度和线性范围

AFP/AFP-IgM的TRFIA典型标准曲线和各浓度值的变异系数见图2。每个浓度点重复测10次，计算变变系数。图2显示各标准品浓度值的变异系数均小于10％。

以零参考标准品当作样品测量20次，计算其荧光均值及标准差，以该点荧光测定值减去2倍标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度值为其灵敏度，经测定本试验灵敏度为0.41ng/ml(AFP)和0.01AU/mL(AFP-IgM)。

2.准确度(回收试验)将实施例1中的冻干的系列标准品稀释为AFP浓度：11.89，51.06，110.33ng/mL，加入至5个已知AFP浓度的血清样本中(其AFP浓度依次为28.65，56.74，90.92，154.56，299.68ng/mL)。AFP-IgM浓度：10.67，58.81，226.03 AU/mL，加入至5个已知AFP-IgM浓度的血清样品中(10.59，23.13，58.63，116.43，277.45 AU/mL。通过计算实测值与理论值的比值，得出本实验在可测范围内其回收率(见表1)。AFP为95.32％-101.6％；AFP-IgM为96.78％-101.24％。

表1.回收试验结果

3.精密度7份不同浓度的血清样本按相同的实验条件，在10天内重复检测定10次，每次实验时每份标本重复测10次，计算批内批间的变异系数(见表2)。本方法的批内变异系数和批间变异系数均小于10％，符合试剂盒规定要求。

表2.批内批间变异系数测定结果

4.三个不同浓度的血清样本，分别用分析缓冲液按体积比1∶2，1∶4，1∶8，1∶16进行稀释，计算其回收率(见表3)。

表3.平行稀释试验

5.方法学比较分别将本发明的实施例1的试剂盒与ECLIA AFP test(Roche Diagnostics GmbH，German)(x)以及Hepa AFP-IC Kit(XeptaGen，Italy)(z)进行比较，分别用于测定实施例5中的118例(n＝118)血清标本中的AFP浓度和AFP-IgM浓度。经相关性分析，得出本发明检测AFP(y1)和AFP-IgM(y2)结果与所述的两个现有的试剂盒的结果的线性回归方程和相关系数(r)如下：

AFP：y1＝1.05x-0.07；r＝0.9987(n＝118)；

AFP-IgM：y2＝0.97z+0.12；r＝0.9854(n＝118)。

可见，本发明的试剂盒的检测结果和现有的两个试剂盒的检测结果的相关性极高，本发明的试剂盒及其方法十分可靠。

实施例5试剂盒的临床应用

采用实施例1提供的试剂盒。

临床资料：118例原发性肝细胞癌[HCC，年龄(48.62±3.42)岁，男76例，女42例]，60例肝硬化[年龄(52.70±1.62)岁，男33例，女27例]，63例慢性肝炎[CH，年龄(56.17±1.62)岁，男50例，女13例]患者血清标本均由上海市肿瘤研究所提供，所有病例均经手术或相关检查确诊。286例健康对照者[年龄(50.00±5.00)岁，男180例，女106例]为近期来上海交通大学医学院附属仁济医院进行体格检查者，经血液、B超、X线等检查未发现良恶性肿瘤。所有研究对象于清晨空腹抽取静脉血2ml，低速离心后分离血清，置-20℃保存待测。

具体检测步骤：取包被有抗AFP-IgM单克隆抗体的微孔反应板，加AFP50μl AFP/AFP-IgM混合标准品或待测样品至各自的微孔中，每个标准品和样品必须使用新的吸头，加100μl缓冲液，室温振荡反应1小时，洗涤四次。再加200μl以缓冲液作稀释剂，按体积比1∶100稀释的铕标记抗体和钐标记抗体，加样时移液器吸头不要接触到微孔中的液体，25-37℃振荡反应1小时，用洗涤液洗涤六次，加增强液200μl振荡5分钟后测量荧光强度，从标准曲线计算样品中的AFP和AFP-IgMAFP含量。

AFP-IgM和AFP在HCC、CH、肝硬化及健康人血清中的分布如图3所示。AFP[4.19(5.60-2.92)μg/L]及AFP-IgM[72.79(95.07-43.97)U/L]在正常人血清中可检测出。肝癌组AFP[6.20(81.70-4.58)μg/L]和AFP-IgM[152.55(233.68-77.90])U/L]均明显高于正常对照组(p＜0.001)、CH组[AFP：3.27(4.63-1.96)μg/L，AFP-IgM：74.20(109.05-47.65)U/L，p＜0.001]以及肝硬化组[AFP：3.38(5.04-1.96)μg/L，AFP-IgM：75.70(118.0-27.45)U/L，p＜0.001]，肝炎组和肝硬化组无显著差异(AFP：CHISQ＝12.44，P＝0.09；AFP-IgM：CHISQ＝10.83，P＝0.991)。AFP和AFP-IgM在本研究对象中无相关性(r＝1.82，P＝0.15)。

以健康对照组AFP或AFP-IgM水平值的95％可信区间为正常值范围，诊断HCC的临床界值AFP为：7.23μg/L，AFP-IgM为127.52kU/L。在HCC组中AFP-IgM的阳性率为63.56％(75/118)，AFP的阳性率为46.61％(55/118)；在肝硬化化组中AFP-IgM的阳性率为23.33％(14/60)，AFP的阳性率20％(12/60)；在CH组中AFP-IgM的阳性率为14.29％(9/63)，AFP的阳性率7.94％(5/63)；在健康对照组中AFP及AFP-IgM的阳性率分别为3.15％(9/286)和4.20％(12/286)。经ROC曲线分析(图4)AFP和AFP-IgM对HCC的诊断效率两者无显著差异(χ2＝5.02，p＝0.939)，联合检测AFP-IgM和AFP可以提高肝癌的诊断灵敏度和准确率(见表4)。

AFP-IgM是HCC新型血清标志物，同时检测AFP和AFP-IgM能极大提高HCC的诊断灵敏度和诊断准确性，有利于HCC的早期诊断。本发明同时检测AFP和AFP-IgM稳定可靠，可以满足临床使用需要。

表4.AFP和AFP-IgM及两者联检诊断肝癌效率比较

Claims (10)

1.一种同步检测甲胎蛋白和甲胎蛋白-免疫球蛋白复合物的时间分辨荧光免疫分析的试剂盒，包括以下试剂：

1)第一抗原表位的AFP单克隆抗体，

2)一种镧系元素标记的第二抗原表位的AFP单克隆抗体，

3)另一种镧系元素标记的IgM单克隆抗体，

4)AFP/AFP-IgM混合标准品，

5)缓冲液，

6)洗涤液，

7)增强液，

其中，所述的镧系元素选自铕和钐，所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体与所述的第一抗原表位的AFP单克隆抗体具有不同的抗原表位。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂1)所述的第一抗原表位的AFP单克隆抗体为鼠抗人AFP单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂1)所述的第一抗原表位的AFP单克隆抗体为固相抗体，其固相载体为反应板。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂2)所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体为鼠抗人AFP单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂3)所述的IgM单克隆抗体为鼠抗人IgM单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂4)所述的AFP/AFP-IgM混合标准品，共6瓶，其中，AFP浓度分别为：0ng/mL，1.21ng/mL，12.1ng/mL，121ng/mL，605ng/mL，1210ng/mL；AFP-IgM浓度分别为：0AU/mL，0.5AU/mL，5AU/mL，50AU/mL，250AU/mL，500AU/mL，其中，AU设定为任意单位。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂5)所述的缓冲液为：含8mmol/L NaCl、0.1wt％明胶、0.2wt％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1wt％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂6)所述的洗涤液为：含14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2wt％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂7)所述的增强液为：含15μmol/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化膦和体积百分比0.1％曲拉通X-100的pH3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。

10.一种根据权利要求1～9任一项所述的试剂盒同步检测甲胎蛋白和甲胎蛋白-免疫球蛋白复合物的时间分辨荧光免疫分析方法，依次包括以下步骤：

1)在固相的第一抗原表位的AFP单克隆抗体中，加入AFP/AFP-IgM混合标准品或待测样品以及缓冲液，进行孵育；

2)用洗涤液洗涤步骤1)的孵育后的反应液，然后加入一种镧系元素标记的第二抗原表位的AFP单克隆抗体和另一种镧系元素标记的IgM单克隆抗体，进行孵育，其中，所述的镧系元素选自铕和钐，所述的第二抗原表位的AFP单克隆抗体与步骤1)所述的第一抗原表位的AFP单克隆抗体具有不同的抗原表位；

3)用洗涤液洗涤步骤2)的孵育后的反应液，然后加入增强液进行反应，之后进行时间分辨荧光检测。

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