CN102621330A - 用于检测人体铁储量的蛋白芯片及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于人体铁营养检测领域的用于人体铁储量检测的蛋白芯片，包括固相载体和阵列式分布于固相载体上的抗血清铁蛋白单克隆抗体、抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体和抗C-反应蛋白单克隆抗体；其中所述的单克隆抗体以共价键固定在固相载体的表面；所述的固相载体经醛基化修饰。本发明还公开了基于所述蛋白芯片的检测试剂盒。与现有技术相比，利用本发明蛋白芯片可实现对评价人体铁储量的三项指标进行同时检测，结果准确可靠；其次，利用本发明蛋白芯片检测特异性强、灵敏度高、检测速度快，检测结果稳定；此外，本发明采用多样品微阵列技术，适于对大规模人群的筛查检测；本发明方法需采血样量小，对受检人群伤害小，检测且成本低。

Description

用于检测人体铁储量的蛋白芯片及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种蛋白芯片，具体涉及用于检测人体铁储量的蛋白芯片，以及相应的蛋白芯片检测试剂盒。

背景技术

铁是人体内必需的微量元素。铁缺乏会导致成年人生理活力减低，儿童大脑发育受损。人体严重铁缺乏会导致缺铁性贫血。目前，全球约有20亿人群贫血，铁缺乏人群比例更高。评估机体铁状况，判别是否存在铁缺乏具有重要的临床意义，同时也是亟待解决的技术问题。选择具有特异、灵敏的早期铁缺乏的监测指标，将有助于及时发现并治疗缺铁人群和潜在贫血患者，同时也有助于人群营养调查，为制订控制预防铁缺乏及缺铁性贫血的公共卫生政策提供科学依据。目前，对铁营养状况进行监测的指标主要包括血清铁蛋白(serum ferritin，简称SF)，可溶性转铁蛋白受体(soluble transferrinreceptor，简称sTfR)，C-反应蛋白(C reactive protein，简称CRP)，血清铁(serum iron，简称SI)，转铁蛋白饱和度(transferrin saturation，简称TS)、血红蛋白(haemoglobin，简称Hb)和血液锌原卟啉(zincprotoporphyrin，简称ZPP)(葛可佑.中国营养科学全书(上、下册)[M].第一版.北京：人民卫生出版社，2004：129.)；后四种指标曾经一度与血清铁蛋白一同做为评价铁储量耗损与贫血发展之间关系的综合指标，但由于血清铁蛋白和转铁蛋白的生理学变异较大，且正常人和缺铁人群这两个指标的范围有重叠，故转铁蛋白不是判定缺铁与否的有效指标(KONIIN AM等.BrJ Haem，1977，37：7-16.)；血红蛋白主要用于功能性铁缺乏的判断，其在判断机体缺铁方面不具有特异性，在使用时也需要联合其他指标对贫血原因进行分析才能得出相应结果，其并不是早期发现铁缺乏的灵敏指标(Brugnara C等.J AMA，1998，281：2225-2230)；锌原卟啉虽是识别成人铁缺乏的灵敏指标，但由于铅中毒、慢性病贫血、慢性感染及炎症等原因也会引起锌原卟啉的升高，所以锌原卟啉也不是特异性判断铁缺乏的指标，而且正常人群ZPP与缺铁人群的ZPP有很大范围的重叠、不同试验ZPP分析方法不统一，结果表示方法也不一致，这些原因都限制了锌原卟啉作为检测指标的应用(LABBE R F等.ClinBiochem，2004，37：165-174)。因此，目前主要以血清铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体作为判断铁营养储量的标志物。以C-反应蛋白做为质量控制，用以判断是否确实存在铁缺乏(Iron Deficiency，ID)或缺铁性贫血(iron-deficiency anemia，IDA)。

目前，对血清铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体和C-反应蛋白的检测方法主要有酶联免疫法与比浊法。但这两种方法对血清的需要量大，且不能实现对两种标志物的同时快速检测，存在检测成本高、检测效率低等问题(殷继永等.卫生研究.2011，40(2)，266-269)。另外的方法是利用蛋白质芯片技术进行检测，如利用蛋白芯片技术对可溶性转铁蛋白受体(殷继永等.卫生研究，2011，40(1)：91-94.)和血清铁蛋白(殷继永等.营养学报，2011，33(2)，182-187.)进行检测。此种方法具有检测特异性强、灵敏度高、且检测所需的样品用量少等优点，但是由于每次仅能进行单一指标检测，多指标需要进行多次检测，仍然存在着需要多次取样，不仅影响结果的判断，还会因多次取样造成受检者痛苦，其次，还存在检测成本高，检测效率低、检测速度慢等问题。如果能将三种检测指标置于同一个蛋白芯片上，从而实现对它们同时进行检测，则可克服上述缺点。经检索，未发现有关用多指标检测人体铁储量的蛋白芯片的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测人体铁储量的蛋白芯片。利用该蛋白芯片可同时检测三种与人体铁储量有关的指标，通过一次检测就可以准确判定人体铁储量的存在状况，具有检测结果准确、检测速度快，检测效率高，成本低、受检者痛苦少等优点。

本发明另一目的在于提供上述蛋白芯片的制备方法。

本发明第三目的在于提供含有上述用于检测人体铁储量的蛋白芯片试剂盒。

本发明通过下述技术方案实现：

一种用于检测人体铁储量的蛋白芯片，包括固相载体和阵列式分布于同相载体上的抗血清铁蛋白单克隆抗体、抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体和抗C-反应蛋白单克隆抗体；其中所述的单克隆抗体以共价键固定在固相载体的表面；所述的固相载体经醛基化修饰。

所述的固相载体是指经过醛基化修饰的载玻片。

所述的抗血清铁蛋白单克隆抗体可以是小鼠抗血清铁蛋白单克隆抗体(Anti-Ferritin，mitochondrial antibody)。

所述的抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体可以是小鼠抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体(Anti-Transferrin Receptor antibody)。

所述的抗C-反应蛋白单克隆抗体可以是小鼠抗C-反应蛋白单克隆抗体(Anti-C Reactive Protein Antibody)。

所述的单克隆抗体皆可于市场上公开购买得到；如小鼠抗血清铁蛋白单克隆抗体和小鼠抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体可于abcam公司购买，小鼠抗C-反应蛋白单克隆抗体可于Novus公司购买。

上述用于检测人体铁储量的蛋白芯片，还包括阳性对照、阴性对照、空白对照；所述的阳性对照、阴性对照分别通过共价键固定于经过醛基化修饰的固相载体表面。

所述的阳性对照是指兔IgG(兔多克隆抗体)。

所述的阴性对照是指小牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)。

所述的空白对照是指磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)。

所述的阳性对照、阴性对照皆可于市场上公开购买；如兔IgG(兔多克隆抗体)、小牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液均可自北京中杉金桥公司购买。

上述用于检测人体铁储量的蛋白芯片的制备方法，包括选择醛基化微阵列固相载体，确定点阵的排列方式和点样位置；配制点样液，然后用点样针按点阵的排列方式将抗血清铁蛋白单克隆抗体、抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体、抗C-反应蛋白单克隆抗体与阴性对照、阳性对照及空白对照分别以接触式点样方式直接点印于固相载体上；37℃过夜；以5％小牛血清白蛋白溶液封闭1小时，然后用含有1‰吐温20的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffersaline Tween 20，PBST，pH7.4)洗涤3次，室温晾干，然后抽真空包装，4℃保存。

一种用于检测人体铁储量的蛋白芯片试剂盒，包括上述用于检测人体铁储量的蛋白芯片。

上述用于检测人体铁储量的蛋白芯片试剂盒，还包括样本稀释液、浓缩洗涤液、标准品混合液、空白对照液、抗体检测液、Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液。

所述的样本稀释液是指3％小牛血清白蛋白溶液(BSA)。

所述的浓缩洗涤液是指含有1％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST，pH7.4)。

所述的标准品混合液是指以3％小牛血清白蛋白溶液(BSA)做样本稀释液溶解配制的血清铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体和C-反应蛋白的混合液。其中混合液中三种蛋白的浓度分别为：血清铁蛋白(SF)为512.5ng/ml，可溶性转铁蛋白受体(sTfR)625ng/ml，C-反应蛋白(CRP)为200ng/ml。血清铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体和C-反应蛋白皆可于市场上购买。

所述的空白对照液是指3％小牛血清白蛋白溶液(BSA)。

所述的抗体检测液是指以3％小牛血清白蛋白溶液(BSA)做样本稀释液溶解配制的兔抗血清铁蛋白多克隆抗体、兔抗可溶性转铁蛋白受体多克隆抗体和兔抗C-反应蛋白多克隆抗体的混合液；其中混合液中三种多克隆抗体的质量体积浓度(μg/ml)分别为：兔抗血清铁蛋白多克隆抗体5μg/ml、兔抗可溶性转铁蛋白受体多克隆抗体0.36μg/ml，兔抗C-反应蛋白多克隆抗体为0.5μg/ml。

所述的Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液是指Cy3标记的羊抗兔IgG与3％小牛血清白蛋白溶液按1∶1000稀释成的二抗工作液。

所述的样本稀释液、浓缩洗涤液、标准品混合液、空白对照液、抗体检测液、Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液中的各种溶质成份均可公开购买。如小牛血清白蛋白可自中杉金桥购买，吐温20可自北京市庆盛达化工技术有限公司购买，血清铁蛋白可自Fitzgerald公司购买，C-反应蛋白可自R&D公司购买，可溶性转铁蛋白受体可自ARP-1公司购买，兔抗血清铁蛋白多克隆抗体可自abcam公司购买，兔抗可溶性转铁蛋白受体多克隆抗体可自Nuvos公司购买，兔抗C-反应蛋白多克隆抗体可自Nuvos公司购买，Cy3荧光标记的羊抗兔IgG可自GE-Amersham Biosciences UK L imited公司购买。

本发明具有的优点和有益效果：(1)、本发明可对检测铁储量的三项指标同时进行检测，与单一指标检测相比，结果准确性大大提高。(2)本发明特异性强、灵敏度高、检测速度快，检测结果稳定；(3)本发明可采用多样品微阵列技术，可同时对多人样品同时进行检测，适于对大规模人群的筛查检测；(4)与现有检测方法相比，本发明检测方法简单、操作安全、检测效率高，样品需要量小，且检测一次完成，对受检人群伤害小，已有的检测方法对三项指标进行检测时需要将一份样本分三次检测才能完成，使得检测所需血样量较大，检测耗时较长，检测效率较低，且影响结果的准确性；(5)本发明蛋白芯片生产成本低、检测成本低。

附图说明

图1.蛋白芯片阵列设计示意图。芯片为12阵列芯片，其中阳性对照：兔多克隆抗体(兔IgG)检测点位；阴性对照：小牛血清白蛋白(BSA)检测点位；空白对照：磷酸盐缓冲液(pH 7.4 PBS)检测点位；SF：血清铁蛋白检测点位；sTfR：可溶性转铁蛋白受体检测点位；CRP：C-反应蛋白检测点位。

图2.蛋白芯片点样后扫描图。

图3.血清铁蛋白标准曲线图。

图4.可溶性转铁蛋白受体标准曲线图。

具体实施方式

以下实施例仅用于对本发明做进一步的解释说明，不应理解为对本发明的保护范围构成任何限制。如无特别说明，实施例中所用的方法为本领域技术人员常规方法，所涉及的药品及浓度也是本领域常用试剂和浓度。

实施例1  用于检测人体铁储量的蛋白芯片的制备

按照如下方法进行：

(1)固相载体的选择：选用醛基化的12点阵形式的三维基片(晶芯高分子三维基片，购自博奥生物有限公司)，确定点阵的排列方式为3×6阵列。

(2)配制点样液：

a.用含有游离Cy3的50％甘油点样缓冲液(购自博奥生物有限公司)与pH7.4的PBS缓冲液按点样缓冲液：PBS：单克隆抗体之间1∶1∶2体积比分别配制：小鼠抗血清铁蛋白单克隆抗体(Anti-Ferritin，mitochondrial antibody[F23]，abcam公司)点样液、小鼠抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体(Anti-TransferrinReceptor antibody[2B6]，abcam公司)点样液和小鼠抗C反应蛋白单克隆抗体(Anti-C Reactive Protein Antibody[C6]，Novus公司)点样液。

b.阴性对照点样液：将50％甘油点样缓冲液、pH7.4的PBS溶液和12％小牛血清白蛋白溶液之间按1∶1∶2的体积比配制。

c.阳性对照点样液：将含有游离Cy3的含50％甘油点样缓冲液、pH7.4的PBS溶液和兔多克隆抗体(兔IgG，浓度为1mg/ml)(购自中杉金桥公司)按照1∶1∶2的体积比配制。

d.空白对照：pH7.4的PBS溶液。

(3)利用蛋白芯片点样仪(PersonalArrayer^TM 16 Microarray Spotter，博奥生物有限公司)将(2)中配制的各点样液：小鼠抗血清铁蛋白单克隆抗体点样液、小鼠抗可溶性铁蛋白受体单克隆抗体点样液、小鼠抗C-反应蛋白单克隆抗体点样液、阳性对照点样液、阴性对照点样液、空白对照点样液分别点样于步骤(1)中的醛基化的三维基片上。

(4)固定、封闭、洗涤：在37℃恒温箱中固定反应16小时；然后以5％小牛血清白蛋白溶液(购自北京中杉金桥公司)封闭1小时，

再用含有1‰吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)(pH 7.4)洗涤芯片3次，室温晾干，得到本发明用于检测人体铁储量的蛋白芯片(见图1)。对固定好的芯片抽真空，4℃保存。

对所制备的蛋白芯片进行检测：用芯片扫描仪(LuxScan^TM 10K MicroarrayScanner，博奥生物有限公司)扫描上述制备的蛋白芯片，直接观察点样结果。结果(见图2)除了阴性对照点因不含游离Cy3而没有荧光信号外，其余各点位因含有游离的Cy3均呈清晰圆润信号结果，说明所制备的蛋白芯片质量好。

实施例2  用于检测人体铁储量的蛋白芯片检测人体铁储量的对比试验

试验样品为2010年采自河南省南阳地区成年育龄妇女自愿受试者(20～60岁)的血清，随机选取六例(编号为I、II、III、IV、V、VI)，每例血清样品分为两份，一份为200μl/份，用比浊法分别检测血清铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体和C-反应蛋白含量；另一份为20μl/份，用于本发明实施例1制备的蛋白芯片同时检测血清铁蛋白与可溶性转铁蛋白受体和C-反应蛋白含量。

(一)比浊法检测：每例取血清200μl用比浊法进行检测。比浊法检测按常规方法(Dubois S等.GIT Labor-Medizin，1988；9：468-471)进行。结果见表1。

(二)蛋白芯片检测按照如下方法进行：

(1)杂交反应：将实施例1制备的蛋白芯片取出，恢复至室温后破真空，对芯片中的1～6阵列依次滴加入将标准品混合液(以3％小牛血清白蛋白溶液(BSA)做样本稀释液溶解配制的血清铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体和C-反应蛋白的混合液；其中混合液中各种蛋白的质量浓度分别为：血清铁蛋白(SF)为512.5ng/ml，可溶性转铁蛋白受体(sTfR)为625ng/ml，CRP为200ng/ml；从高至低按1∶2倍比稀释所得的5个梯度的混合液，第六阵列加入空白对照液(30μl/阵)；第7～12阵列分别依次加入6份稀释的血清样品(30μl/阵)(用3％小牛血清白蛋白溶液(BSA)按1∶8稀释各份血清后配成稀释的血清样品)；37℃温育1小时；

(2)将浓缩洗涤液按1∶10稀释得1‰PBST洗涤液，然后用1‰PBST洗涤液洗涤芯片3次，5分钟/次，室温晾干。

(3)向各阵列中加入抗体检测液(用3％小牛血清白蛋白溶液(BSA)稀释配制的兔抗血清铁蛋白多克隆抗体(购自abcam公司)、兔抗可溶性转铁蛋白受体多克隆抗体(购自Nuvos公司)和兔抗C-反应蛋白多克隆抗体(购自Novus公司)的混合液。其中混合液中各种兔多克隆抗体的质量体积浓度(μg/ml)分别为：兔抗血清铁蛋白多克隆抗体5μg/ml、兔抗可溶性转铁蛋白受体多克隆抗体0.36μg/ml、兔抗C-反应蛋白多克隆抗体0.5μg/ml，30μl/阵，37℃温育1小时；用1‰PBST洗涤液洗涤芯片3次，每次5分钟，室温晾干。

(4)向各阵列中加入Cy3荧光标记羊抗兔IgG(购买自GE——AmershamBiosciences UK L imited公司)与3％小牛血清白蛋白按1∶1000稀释的Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液，30μl/阵，37℃温育1小时；用1‰PBST洗涤液洗涤芯片3次，每次5分钟，室温晾干。

(5)利用芯片扫描分析仪(LuxScan^TM 10K Microarray Scanner，博奥生物有限公司)进行结果的判读与数据分析。对芯片中1-6阵列检测信号值与浓度值做六个浓度点的标准曲线(图3和图4)并拟合标准回归方程(公式1、公式2)。

血清铁蛋白标准回归方程：

y＝-6.49+0.014x    (公式1)

其中x为检测信号值，y为样本血清铁蛋白浓度值(ng/ml)。

可溶性转铁蛋白受体标准回归方程：

y＝13.94-0.005x+4.38E-007x²    (公式2)

其中x为检测信号值，y为样本血清铁蛋白浓度值(ng/ml)。

将7-12阵列中血清样品检测信号值代入标准方程后，定量的计算出各例血清中检测浓度，并按公式3计算各血清铁储量。

$\mathrm{BIS}(\mathrm{mg}/\mathrm{Kg})=-\frac{\log \left(\frac{\mathrm{sTfR}}{\mathrm{SF}}\right)-2.8229}{0.1207}$ (公式3)

其中BIS表示铁储量，SF表示血清铁蛋白含量，sTfR表示可溶性转铁蛋白受体含量。

根据此公式，当结果为正值时，表示机体储存铁的实际含量；当结果为负值时，表示机体缺铁的量。

表1比浊法检测人体铁储量结果

表2.用本发明蛋白芯片检测人体铁储量结果

C-反应蛋白(CRP)是反映人体有无炎症和其他可能疾病的指标，如果CRP＞5μg/ml，则说明人体处于炎症和疾病状况。而炎症和疾病会导致铁蛋白不正常上升，从而使铁储量计算结果不能真实反映机体铁状况。因此通过检验CRP来确定血清铁蛋白值和可溶性转铁蛋白受体的值是否可用于铁储量的计算。从表1和表2可以看出，本次样品CRP检测值均小于5μg/ml，说明受检人机体无炎症和疾病，用所测的血清铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体的值计算的人体铁储量可以反映人体实际铁储量。

从表1与表2数据可以看出，两种方法检测血清铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体含量的结果之间无显著差异，其六例血清样品的实际铁储量计算结果也无显著差异(铁储量公式：COOK J D等.Blood，2003，101：3359-3367)，说明用本发明蛋白芯片检测铁储量结果准确可靠。但是，利用本发明蛋白芯片经一次加样即可同时检测三个蛋白指标，从而缩短了三个指标间的检测时间，使得检测结果更能反应出三个检测指标的真实性，并进而更能准确的反应出受检者铁储量的真实值；其次，用本发明蛋白芯片检测耗时少，本发明方法仅用五小时即可完成对42份血样各3项检测指标3次重复的检测操作，而比浊法则至少需要用时9-10小时；此外，本发明方法检测用血量低，本方法对每份血样各3项指标完成3次重复仅需血样20μl/份，而比浊法为至少需血样200μl/份，本发明减少了受检人的痛苦。因而利用本发明蛋白芯片检测人体铁储量方法是一种高通量、检测速度快、所需样品少的检测方法。

Claims (10)

1.一种用于检测人体铁储量的蛋白芯片，包括固相载体和阵列式分布于固相载体上的抗血清铁蛋白单克隆抗体、抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体和抗C-反应蛋白单克隆抗体；其中所述的单克隆抗体以共价键固定在固相载体的表面；所述的固相载体经醛基化修饰。

2.按照权利要求1所述的用于检测人体铁储量的蛋白芯片，其特征在于所述的固相载体是指经过醛基化修饰的载玻片。

3.按照权利要求1所述的用于检测人体铁储量的蛋白芯片，其特征在于所述的抗血清铁蛋白单克隆抗体是小鼠抗血清铁蛋白单克隆抗体；所述的抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体是指小鼠抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体；所述的抗C-反应蛋白单克隆抗体是小鼠抗C-反应蛋白单克隆抗体。

4.按照权利要求1所述的用于检测人体铁储量的蛋白芯片，其特征在于还包括阳性对照、阴性对照、空白对照；所述的阳性对照、阴性对照分别通过共价键固定于经过醛基化修饰的固相载体表面。

5.按照权利要求4所述的用于检测人体铁储量的蛋白芯片，其特征在于所述的阳性对照是指兔IgG；所述的阴性对照是指小牛血清白蛋白；所述的空白对照是指磷酸盐缓冲液。

6.权利要求1～5任一所述的用于检测人体铁储量的蛋白芯片的制备方法，其特征在于包括选择醛基化微阵列固相载体，确定点阵的排列方式和点样位置；配制点样液，然后用点样针按点阵的排列方式将抗血清铁蛋白单克隆抗体、抗可溶性转铁蛋白受体单克隆抗体、抗C-反应蛋白单克隆抗体与阴性对照、阳性对照及空白对照分别以接触式点样方式直接点印于固相载体上；37℃过夜；以5％小牛血清白蛋白溶液封闭1小时，然后用含有1‰吐温20的磷酸缓冲液洗涤3次，室温晾干，然后抽真空包装，4℃保存。

7.一种用于检测人体铁储量的蛋白芯片试剂盒，其特征在于包括权利要求1～5任一所述的用于检测人体铁储量的蛋白芯片。

8.按照权利要求7所述的蛋白芯片试剂盒，其特征在于还包括样本稀释液、浓缩洗涤液、标准品混合液、空白对照液、抗体检测液和Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液。

9.按照权利要求8所述的蛋白芯片试剂盒，其特征在于所述的样本稀释液是指3％小牛血清白蛋白溶液；所述的浓缩洗涤液是指含有1％吐温20的磷酸盐缓冲液；所述的空白对照液是指3％小牛血清白蛋白溶液；所述的标准品混合液是指以3％小牛血清白蛋白溶液做样本稀释液溶解配制的血清铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体和C-反应蛋白的混合液。

10.按照权利要求8或9所述的蛋白芯片试剂盒，其特征在于所述的抗体检测液是指以3％小牛血清白蛋白溶液做样本稀释液溶解配制的兔抗血清铁蛋白多克隆抗体、兔抗可溶性转铁蛋白受体多克隆抗体和兔抗C-反应蛋白多克隆抗体的混合液；所述的Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液是指Cy3标记的羊抗兔IgG与3％小牛血清白蛋白溶液按1∶1000稀释成的二抗工作液。

Images