CN1415964A - 糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片、其制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学研究及临床应用技术领域，具体涉及糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片、其制备及检测方法。本发明要解决现有糖尿病临床分型不易确诊和检测成本高的问题。解决方案是：一种蛋白芯片，所述外壳是上表面设置有多个反应池的玻璃薄片，反应池内均设置有一个检测微阵列，每个检测微阵列分别由三个不同种类的、同一规格大小的蛋白微型固相检测片组成，所述蛋白微型固相检测片分别是GAD蛋白微型固相检测片、PTP蛋白微型固相检测片和Insulin蛋白微型固相检测片；制备方法是：首先准备蛋白微型固相检测片，然后进行组装；检测方法是：先采用间接荧光法检测，再以生物芯片激光共聚焦扫描仪判定实验检测结果。
Description
所属技术领域：
本发明涉及生物医学研究及临床应用领域，具体涉及糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片、其制备及检测方法。
背景技术：
糖尿病是目前危害人类健康与生活质量最严重的疾病之一，它以血糖浓度持续性增高为主要症状表现，通过多种严重并发症而危害健康。据国际糖尿病联盟(KDF)对全球糖尿病的发病现状及世界卫生组织(WHO)对糖尿病发病情况做出的最新预测指出，目前全球已诊断出II型糖尿病患者达1.3亿人，我国超过4000万人。预计到2025年，全球糖尿病患者将突破3亿，我国糖尿病患者总数接近1亿。在我国，随着生活水平的提高和饮食结构的改变，糖尿病患者人群正迅速发展，预防和治疗糖尿病已成为我国重大社会课题。
糖尿病依病因可分为两类，I型和II型，这两种类型的糖尿病起因不同、对患者的危害以及治疗方法都截然不同。早在80年代，就有人观察到一部分临床诊断为II型糖尿病患者在血液中可检出特异性的胰岛细胞自身抗体，这类患者易出现继发性的口服降糖药治疗失效、必须依赖胰岛素治疗的现象。随后的大量研究表明，这类患者实际属于I型糖尿病中的免疫中介亚型，为一种起病晚的成人隐匿性I型糖尿病(LADA)，起病原因为自身免疫紊乱。但由于这类病人的临床表现与II型糖尿病很难鉴别，绝大多数医院又无相关抗体的检测手段，通常都诊断为II型糖尿病，从而使用不适当的II型糖尿病治疗方法，延误病情，导致患者健康乃至生命的损失。
在1999年，世界卫生组织(WHO)专家评议报告“糖尿病及其并发症的定义、诊断和分型第一部分”中提出了糖尿病新分型。其中，I型糖尿病被分为免疫中介型和特发型两个亚型，并指出，确诊免疫中介I型糖尿病，主要依赖在糖尿病患者中检出针对胰岛β细胞各种抗原的自身免疫抗体。人们目前已发现了多种与糖尿病相关的自身免疫抗体，其中最重要的自身免疫抗体包括：谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)；蛋白酪氨酸磷酸酶样跨膜蛋白抗体(ICA512/IA-2)；胰岛素抗体(IAA)；胰岛细胞自身抗体(ICAs)。因胰岛细胞自身抗体的出现远早于临床症状，在I型糖尿病临床的前期，多种自身抗体在外周血就可检测出，其最远时间可达8年，可及时预测未来I型糖尿病的发生。对这类患者如采取相应治疗措施，会大大延缓发病时间，甚至最终改变疾病的预后。
糖尿病自身免疫抗体在检测中由于出现情况、时间和强度并不一致，而且各种自身免疫抗体单一检出率都不超过80％，所以，任何单一的检测都很可能造成实际患者的漏诊。因此，糖尿病自身免疫抗体必须联合检测，在临床上才可用于分型确诊，进而影响治疗和患者预后的重要实用价值。目前常规的糖尿病诊断仍是以临床症状结合血糖浓度和口服糖耐量实验等相对实验室指标来诊断，它已不适合进行分型确诊，同时因其自身原因常会受到各种因素的干扰，有时会产生波动较大的检测结果，也就是说检测结果不稳定。另外已有人尝试采用特异性的血清免疫学方法来辅助分型诊断，但一般都是针对每种自身免疫抗体进行单独检测，因此检测成本高，一般患者难以采用，同时也难以作为体检筛查的手段，不能提供适应目前糖尿病患者增加所需要的相应的高通量标准化检测手段。
发明内容：
本发明要解决现有糖尿病临床分型不易确诊和检测成本高的问题。
为解决现有的技术问题，本发明的解决方案是：一种糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片，包括外壳1和检测微阵列3，其特殊之处在于，所述外壳1是上表面设置有多个反应池2的玻璃薄片，反应池2内均设置有一个检测微阵列3，每个检测微阵列3分别由三个不同种类的、同一规格大小的蛋白微型固相检测片组成，所述蛋白微型固相检测片分别是GAD蛋白微型固相检测片4、PTP蛋白微型固相检测片5和Insulin蛋白微型固相检测片6。
每个蛋白微型固相检测片的面积在0.1mm2～9mm2之间。
所述玻璃薄片规格为22mm×75mm，厚度1mm～3mm，其上表面设置有3～200个反应池2，所述反应池2是边长为0.2mm～18mm的正方形。
所述反应池2容量为10μl～100μl。
所述蛋白微型固相检测片上包含有2个～10个相应的蛋白点样点。
一种上述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片的制备方法如下：
首先准备蛋白微型固相检测片，本发明有三种蛋白微型固相检测片，根据其上的蛋白种类不同分为GAD蛋白微型检测片、PTP蛋白微型检测片和Insulin蛋白微型检测片。这三个蛋白微型固相检测片的制备中，检测片采用透明聚苯乙烯盖玻片或采用玻璃盖玻片和醋酸纤维膜，制备方法参照Gavin MacBeath的《用于高通量功能测定的蛋白微阵列制备》中的方法。
上述蛋白微型固相检测片的制备方案是：
①GAD蛋白微型固相检测片的制备中，点样试剂采用美国sigma公司纯化GAD蛋白，PBS稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％BSA封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的矩形蛋白微型检测片，每个微型检测片含有2～10个蛋白点样点。
②PTP蛋白微型固相检测片的制备中，试剂采用美国sigma公司重组纯化PTP蛋白(β亚型)，PBS稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％BSA封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的矩形蛋白微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点。
③Insulin蛋白微型固相检测片的制备中，试剂采用美国sigma公司合成人胰岛素蛋白，PBS稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％BSA封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的矩形蛋白微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点。
然后进行组装，①选用表面上设有3～200个反应池的玻璃薄片，每个反应池均为边长是0.2mm～18mm的正方形，容量10μl～100μl；②在反应池内设置检测微阵列，该检测微阵列由三个同一规格大小的不同种类的蛋白微型固相检测片排列并以透明黏合剂黏附固定于反应池内制成。
上述制备方法还包括包装步骤，将芯片表面用锡箔纸密封包装，储存于-20℃条件下，运输时置于不高于4℃的恒温容器内。
一种上述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片的检测方法如下：先采用间接荧光法检测，检测结果再以生物芯片激光共聚焦扫描仪或其他种类的微阵列扫描仪扫描判定实验检测结果，也可仅使用普通荧光显微镜直接观察，对实验结果进行人工判定；所述检测过程中，选取检测微阵列中的任意两个分别作为阴性质控检测微阵列和阳性质控检测微阵列。
上述间接荧光法中，先进行预处理步骤：
①将芯片取出后，室温放置5min～15min，打开包装；
②在每个反应池加入10μl～100μl PBS，放入37℃水浴中孵育15min～30min；
③滴加3％H2O2 50μl室温下封闭10min；
④PBS冲洗2次，每次5min；
⑤滴加1％BSA 50μl室温下封闭10min～20min。
然后对检测微阵列进行检测：
①将一份患者待测血清以1∶5用PBS稀释，直接滴加于一个检测微阵列表面，37℃孵育20min～1h；
②PBS冲洗3次，每次5min；
③加入荧光标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，37℃孵育20min～1h；
④PBS-1％Tween洗涤3次，每次10min；
⑤滴加封裱剂封片。
对质控检测微阵列的检测操作步骤是：
仅将检测微阵列操作步骤中所用患者待测血清换为阳性对照检测液或阴性对照检测液，其余步骤相同；阳性对照检测液是将健康成人血清，经1500转离心10min，将纯化的GADA、IA-2、IAA单克隆抗体各5u或相当于此量的浓缩溶液溶于健康成人血清制备而成；阴性对照检测液是将健康成人血清，经1500转离心10min，取上清液制备而成。
上述封裱剂是由甘油与0.5％PBS按1∶1混合制备而成。
与现有技术相比，本发明具有下述特点：
①利用当前最新的蛋白芯片技术，通过血清中糖尿病自身免疫抗体存在与否或其含量多少，为免疫中介性糖尿病患者的分型鉴别提供重要依据，也可广泛用于糖尿病高危人群中I型糖尿病临床前期和发病早期的预测，因此具有重要的临床实用价值。
②高通量。使用一张检测芯片可同时检测数位至数十位患者血清，一次提供每份血清中三种糖尿病自身免疫抗体的相关信息，非常适合在人群中进行大批量筛查诊断使用。
③检测成本低廉，经济性强。一张芯片可检测数位至数十位患者血清，每份血清三种糖尿病诊断标志物，相当于常规数百次实验的结果；但所需检测试剂用量仅相当于常规检测的试剂用量的1/20～1/50，可大大降低检测成本，具有非常强的经济性，易普及。
④特异性强、灵敏度高。以纯化蛋白为检测底物，避免了常规检测中的干扰，保证了高度的检测特异性，有效的避免了假阳性和假阴性的检测结果的产生。同时采用最新蛋白固相检测片制作工艺，保证了其检测的高灵敏度。
⑤稳定的质量控制。高度纯化的抗原蛋白保证了抗原质量的稳定，减小批间批内差异，从而有效的实现检测标准化，降低检测结果的波动。同时每张芯片都具有独立的质控检测微阵列，保证了每张芯片质量的可靠性。
⑥检测结果准确可靠。芯片采用间接荧光法检测，检测结果以生物芯片专用激光共聚焦扫描仪扫描后通过智能化的分析软件判定，消除了通常实验室检测人为判定结果可能造成失误的因素。
附图说明：
图1是芯片的结构示意图；
图2是单个反应池的结构示意图。
附图图面说明如下：
1-外壳，2-反应池，3-检测微阵列，4-GAD蛋白微型固相检测片，5-PTP蛋白微型固相检测片，6-Insulin蛋白微型固相检测片。
实施例：
本发明涉及蛋白检测芯片、其制备及检测方法，主要用于检测糖尿病辅助诊断上的三个重要指标：GADA、ICA512/IA-2和IAA。以下将通过实施例对本发明作进一步说明，但不应理解为保护范围仅限于下述实施例。
(一)一种糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片，包括外壳1和检测微阵列3，所述外壳1是规格为22mm×75mm，厚度是1mm的玻璃薄片，所述玻璃薄片上表面设置有78个反应池2，所述反应池2是边长为2.5mm的正方形。在每个反应池2内设置有一个检测微阵列3，该检测微阵列3由三个面积是1mm2、同一规格大小的蛋白微型固相检测片组成，所说的蛋白微型固相检测片分别是GAD蛋白微型固相检测片4、PTP蛋白微型固相检测片5和Insulin蛋白微型固相检测片6。每个蛋白微型固相检测片上包含有6个蛋白点样点。
(二)一种糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片的制备方法如下：
首先准备蛋白微型固相检测片，所说的蛋白微型固相检测片根据其上的蛋白种类不同分为GAD蛋白微型固相检测片、PTP蛋白微型固相检测片和Insulin蛋白微型固相检测片。
①GAD蛋白微型固相检测片的制备中，检测片采用透明聚苯乙烯盖玻片，厚度0.1mm，点样试剂采用美国sigma公司纯化GAD蛋白，PBS稀释，PH7.5，终浓度范围在100μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在600点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％BSA封闭，-20℃储存；使用时切割为面积为1mm2、同一规格大小的矩形微型检测片，每个微型检测片含有6个蛋白点样点。
②PTP蛋白微型固相检测片的制备中，检测片采用透明聚苯乙烯盖玻片，厚度0.1mm，试剂采用美国sigma公司重组纯化PTP蛋白(β亚型)，PBS稀释，pH7.5，终浓度范围在100μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度为600点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％BSA封闭，在-20℃储存。使用时切割为面积为1mm2、同一规格大小的矩形微型检测片，每个微型检测片含有6个蛋白点样点；
③Insulin蛋白微型固相检测片的制备中，检测片采用透明聚苯乙烯盖玻片，厚度0.1mm，试剂采用美国sigma公司合成人胰岛素蛋白，PBS稀释，pH7.5，终浓度范围在100μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在600点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％BSA封闭，-20℃储存。使用时切割为面积为1mm2、同一规格大小的矩形微型检测片，每个微型检测片含有6个蛋白点样点。
然后进行组装，选用含78个反应池的玻璃薄片，所说的反应池是边长为2.5mm的正方形。将三种同一规格大小的不同种类的蛋白微型固相检测片排列并以透明黏合剂黏附固定于反应池内，制成检测微阵列，由这样的78个含有检测微阵列的反应池组成检测芯片。其中的任意两个检测微阵列用于质量控制，被称为质控检测微阵列，质控检测微阵列又被细分为阴性质控检测微阵列和阳性质控检测微阵列，另外76个检测微阵列被用于临床检测。
最后还包括包装步骤，将检测芯片表面用锡箔纸密封包装，储存于-20℃条件下，运输时置于不高于4℃的恒温容器内。
(三)一种糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片的检测方法如下：
首先进行间接荧光法操作，所说的78个反应池中的任意两个指定为质控反应池，其余76个是检测反应池。
第一步：检测前预处理：
①将芯片取出后，室温放置5min，打开包装；
②在每个反应池，即78个反应池中均加入50μl PBS，放入37℃水浴中15min；
③滴加3％H2O2 50μl室温下封闭10min；
④PBS冲洗2次，每次5min；
⑤滴加1％BSA 50μl室温下封闭20min。
第二步：对检测微阵列的检测操作步骤是：
①将一份患者待测血清以1∶5用PBS稀释，直接滴加于一个检测微阵列表面，37℃孵育1h，该芯片上的其中76个可用于76份血清的检测；
②PBS冲洗3次，每次5min；
③加入荧光标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，37℃孵育1h，所说的荧光标记可选用市售FITC标记；
④PBS-1％Tween洗涤3次，每次10min；
⑤滴加甘油与0.5％PBS按1∶1混合制备的封裱剂封片。
第三步：与第二步同步操作，对质控检测微阵列的检测操作步骤是：仅将第二步检测微阵列的检测操作步骤中所用患者待测血清换为阳性对照检测液或阴性对照检测液，其余步骤相同。所说的阳性对照检测液按下述方式制备：健康成人血清，1500转离心10min，将纯化的GADA、IA-2、IAA单克隆抗体各5u或相当于此量的浓缩溶液溶于健康成人血清制成；所说的阴性对照检测液按下述方式制备：健康成人血清，1500转离心10min，取上清液制成。
然后以激光共聚焦扫描仪扫描，观察结果。
(四)针对本发明的蛋白检测芯片，本发明提供以下的结果判定标准。本例中选用ScanArray共聚焦微阵列扫描仪扫描后观察结果。
本标准以一个检测微阵列的检测结果为例，实际检测结果判定中其他检测微阵列判定方法相同：①当GAD65蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与阴性质控检测微阵列中GAD65蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度比值超过50∶1时，则GADA检测为阳性，否则为阴性；②当PTP蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与阴性质控检测微阵列中PTP蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度比值超过50∶1时，则ICA512/IA-2检测为阳性，否则为阴性；③当Insulin蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与阴性质控检测微阵列中Insulin蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度比值超过50∶1时，则IAA检测为阳性，否则为阴性。
本发明的芯片上附带两个额外的质控反应池，可对芯片的质量进行检测。结果判定标准是：如果阳性质控检测微阵列每个检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与背景荧光强度的比值高于50∶1，同时阴性质控检测微阵列每个检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与背景荧光强度的比值低于50∶1，则表明此芯片质量良好，本次检测结果有效。
Claims (10)
1、一种糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片，包括外壳(1)和检测微阵列(3)，其特征在于：所述外壳(1)是上表面设置有多个反应池(2)的玻璃薄片，反应池(2)内均设置有一个检测微阵列(3)，每个检测微阵列(3)分别由三个不同种类的、同一规格大小的蛋白微型同相检测片组成，所述蛋白微型固相检测片分别是GAD蛋白微型固相检测片(4)、PTP蛋白微型固相检测片(5)和Insulin蛋白微型固相检测片(6)。
2、如权利要求1所述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片，其特征在于：所述单个蛋白微型固相检测片的面积在0.1mm2～9mm2之间。
3、如权利要求1或2所述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片，其特征在于：所述玻璃薄片规格为22mm×75mm，厚度1mm～3mm，其上表面设置有3～200个反应池(2)，所述反应池(2)是边长为0.2mm～18mm的正方形。
4、如权利要求3所述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片，其特征在于：所述反应池(2)容量为10μl～100μl。
5、如权利要求4所述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片，其特征在于：所述蛋白微型固相检测片上包含有2～10个相应的蛋白点样点。
6、一种如权利要求1所述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片的制备方法，其特征在于：首先准备蛋白微型固相检测片，本发明有三种蛋白微型固相检测片，根据其上的蛋白种类不同分为GAD蛋白微型检测片、PTP蛋白微型检测片和Insulin蛋白微型检测片；这三个蛋白微型固相检测片的制备中，检测片采用透明聚苯乙烯盖玻片或采用玻璃盖玻片和醋酸纤维膜，制备方法是GavinMacBeath的《用于高通量功能测定的蛋白微阵列制备》中的方法。
7、一种如权利要求1所述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片的制备方法，其特征在于：首先制备蛋白微型固相检测片，它包括，
①GAD蛋白微型固相检测片的制备中，点样试剂采用美国sigma公司纯化GAD蛋白，PBS稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％BSA封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的矩形蛋白微型检测片，每个微型检测片含有2～10个蛋白点样点；
②PTP蛋白微型固相检测片的制备中，试剂采用美国sigma公司重组纯化PTP蛋白(β亚型)，PBS稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％BSA封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的矩形蛋白微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点；
③Insulin蛋白微型固相检测片的制备中，试剂采用美国sigma公司合成人胰岛素蛋白，PBS稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％BSA封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的矩形蛋白微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点；
然后进行组装，①选用表面上设有3～200个反应池的玻璃薄片，每个反应池均为边长是0.2mm～18mm的正方形，容量10μl～100μl；②在反应池内设置检测微阵列，该检测微阵列由三个同一规格大小的不同种类的蛋白微型固相检测片排列并以透明黏合剂黏附固定于反应池内制成。
8、如权利要求6或7所述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片的制备方法，其特征在于：还包括包装步骤，该步骤是将芯片表面用锡箔纸密封包装，储存于-20℃条件下，运输时置于不高于4℃的恒温容器内。
9、一种如权利要求1所述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片的检测方法，其特征在于：先采用间接荧光法检测，再以生物芯片激光共聚焦扫描仪或其他种类的微阵列扫描仪扫描判定实验检测结果，也可仅使用普通荧光显微镜直接观察，对实验结果进行人工判定；所述检测过程中，选取检测微阵列中的任意两个分别作为阴性质控检测微阵列和阳性质控检测微阵列。
10、如权利要求9所述的糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片的检测方法，其特征在于：所述间接荧光法中，先进行预处理步骤：
①将芯片取出后，室温放置5min～15min，打开包装；
②在每个反应池加入10μl～100μl PBS，放入37℃水浴中孵育15min～30min；
③滴加3％H2O2 50μl室温下封闭10min；
④PBS冲洗2次，每次5min；
⑤滴加1％BSA 50μl室温下封闭10min～20min。
然后对检测微阵列进行检测：
①将一份患者待测血清以1∶5用PBS稀释，直接滴加于一个检测微阵列表面，37℃孵育20min～1h；
②PBS冲洗3次，每次5min；
③加入荧光标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，37℃呼育20min～1h；
④PBS-1％Tween洗涤3次，每次10min；
⑤滴加封裱剂(如：甘油与0.5％PBS为1∶1混合制备)封片。
再对质控检测微阵列进行检测：
仅上述检测微阵列操作步骤中所用患者待测血清换为阳性对照检测液或阴性对照检测液，其余步骤相同；阳性对照检测液是将健康成人血清，经1500转离心10min，将纯化的GADA、IA-2、IAA单克隆抗体各5u或相当于此量的浓缩溶液溶于健康成人血清制备而成；阴性对照检测液是将健康成人血清，经1500转离心10min，取上清液制备而成。
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